EFEITO DA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES PIV SOBRE A TAXA DE PRENHEZ DE GIR (Bos indicus) EM CONDIÇÕES DE CAMPO

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Mirela Castel-Branco Pereira
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1 EFEITO DA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIÕES PIV SOBRE A TAXA DE PRENHEZ DE GIR (Bos indicus) EM CONDIÇÕES DE CAMPO Effect of vitrification under field conditions on pregnancy rate of Gyr (Bos indicus) PIV embryos Ludymila Furtado CANTANHÊDE 1, Lucas Carvalho PEREIRA 2, José Carlos FERREIRA- SILVA 3, Maiana Silva CHAVES 4, Marcelo Tigre MOURA 5, Maico Henrique Barbosa do SANTOS 6 1 Universidade Federal Rural de Pernambuco, DMV. lud_furtado@hotmail.com 2 Universidade Federal Rural de Pernambuco, DMV. lucas_carvalho_pereira@hotmail.com 3 Universidade Federal Rural de Pernambuco, DMV. carlos.ztec@gmail.com 4 Universidade Federal Rural de Pernambuco, DMV. maiana-@hotmail.com 5 Universidade Federal Rural de Pernambuco, DMV. marcelotmoura@gmail.com 6 Universidade Federal Rural de Pernambuco, DMV. maicohenriquebarbosasantos@gmail.com

2 Introdução Em bovinos, embriões produzidos in vitro (PIV) são mais sensíveis à criopreservação quando comparados a embriões produzidos in vivo devido à alta concentração de lipídios. A espécie Bos indicus apresenta menor tolerância à criopreservação quando comparado com embriões Bos taurus PIV (VISINTIN et al., 2002). Dessa forma, objetivou-se avaliar a viabilidade de embriões PIV de Gir (Bos indicus) transferidos à receptoras após a vitrificação em condições de campo. Material e Métodos Foi realizada a produção in vitro de embriões Bos indicus, a vitrificação, desvitrificação e transferência direta para avaliação da taxa de prenhez e perda embrionária. Produção in vitro de embriões Recuperação dos ovócitos A punção dos folículos (OPU) de diâmetro maior que 2 mm foi realizada de acordo com Zhao et al (2009). O meio utilizado foi TCM-199 (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) suplementado. Maturação in vitro (MIV) Os ovócitos foram selecionados segundo Morató et al (2008). Foram então lavados em TCM-199 HEPES (Gibco Life Technologies) suplementado. Para a MIV foi utilizado o TCM-199 com SFB (Gibco Life), FSH (Folltropin, Bioniche Animais Saúde, Belleville, ON, Canada), hcg (Profasi, Serono, São Paulo, SP, Brasil), estradiol (estradiol-17b), piruvato de sódio e amicacina (Instituto Bioquimico, Rio de Janeiro, Brasil). Os ovócitos foram incubados sob óleo mineral a 39 o C em atmosfera úmida de 5% CO 2 durante 22 a 26 horas. Fecundação In Vitro (FIV) O sêmen utilizado pertenceu a reprodutores com fertilidade comprovada no processo de FIV com concentração final de 1x10 5 espermatozoides/gota segundo Viana et al (2010). Os espermatozoides e os ovócitos foram lavados em TALP-FIV. Os gametas foram acondicionados sob mesma atmosfera mencionada anteiormente. Cultivo in vitro de embriões (CIV) Os presumíveis zigotos foram desnudados e transferidos para SOFaa com BSA e SFB sob óleo mineral a 39 o C em atmosfera úmida de 5% CO 2, 5% O 2 e 90% de N 2 durante todo o período do CIV. No 3 o (D3) e 5 o dia (D5) de cultivo foi feito feeding. Vitrificação de embriões Os Blastocistos (n=138) foram vitrificados por Cryotop, colocados em 10% de etilenoglicol (WakoPure Chemical Industries Co., Osaka, Japão) e 10% de DMSO (WakoPure Chemical Industries Co.) em meio TCM-HEPES com SFB. Em seguida, os embriões foram transferidos para solução de vitrificação contendo 20% de etilenoglicol, 20% de DMSO e sacarose. Para então serem imersos em nitrogênio líquido. Como controle, foram selecionados embriões frescos (n=140) avaliados no dia 7 (D7).

3 Desvitrificação de embriões Os blastocistos foram aquecidos pela imersão da tira no meio base (TCM-HEPES + sacarose) a 35 C por 1 minuto. Em seguida foram colocados em meio conforme Morató et al (2008). Os embriões foram transferidos em tempo fixo para receptoras sincronizadas após o aquecimento. Protocolo de transferência de embrião e diagnóstico de prenhez Somente as receptoras com corpo lúteo (CL) receberam um embrião no dia 17 de protocolo. O diagnóstico precoce de prenhez foi realizado por ultrassonografia transretal (DP 2200 VET, 5 MHz transdutor linear, Mindray, China) no 35 o dia, contando a partir da data da FIV. O diagnóstico confirmatório e a perda embrionária no 60 o dia, junto com a sexagem. Análise estatística Para análise da taxa de prenhez e perda embrionária foi realizado o teste do Quiquadrado com nível de significância de 5%. Resultados e Discussão Avaliação da viabilidade de embriões PIV vitrificados foi feita após a transferência direta em vacas sincronizadas. A taxa de prenhez de embriões vitrificados foram semelhantes às de embriões transferidos a fresco, tanto em 35 quanto em 60 dias após a fertilização in vitro. A fase do desenvolvimento embrionário também não influenciou as taxas de prenhez e a incidência de morte embrionária (Tabela 1). Resultados semelhantes da influência das fases de desenvolvimento sobre as taxas de prenhez foram descritos com embriões PIV vitrificados e transferidos por Scanavez et al. (2013) em condições de campo. A baixa criotolerância de embriões PIV vem sendo um fator limitante para utilização de embriões vitrificados (MUCCI et al., 2006) deste forma estes resultados são relevantes para criopreservação de embriões PIV de Bos indicus em condições de campo. Conclusão A vitrificação a campo é um método eficiente e pode ser implementada para minimizar o descarte de embriões excedentes sem prejuízo à taxa de prenhez. Referências Bibliográficas MORATÓ, R.; IZQUIERDO, D.; PARAMIO, M.T. et al. Embryo development and structural analysis of in vitro matured bovine oocytes vitrified in flexipet denuding pipettes. Theriogenology, Stoneham, v.70, n.9, p , MUCCI, N.; ALLER, J.; KAISER, G.G. et al. Effect of estrous cow serum during bovine embryo culture on blastocyst development and cryotolerance after slow freezing or vitrification. Theriogenology, Stoneham, v.65, p , SCANAVEZ, A. L.; CAMPOS, C. C.; SANTOS, R. M. Taxa de prenhez e de

4 perda de gestação em receptoras de embriões bovinos produzidos in vitro. Arq Bras Med Vet Zootec, Belo Horizonte, v.65, p , VIANA, J.H.M.; SIQUEIRA, L.G.B.; PALHÃO, M.P. et al. Use of in vitro fertilization technique in the last decade and its effect on Brazilian embryo industry and animal production. Acta Scientiae Veterinariae, Porto Alegre, v. 38, p , VISINTIN, J.A.; MARTINS, J.F.P.; BEVILACQUA, E.M. et al. Cryopreservation of BostaurusvsBosindicus embryos: are they really different. Theriogenology, Stoneham, v.57, p , ZHAO, X.M.; FU X.W.; HOU Y.P. et al. Effect of vitrification on mitochondrial distribution and membrane potential in mouse two pronuclear (2-PN) embryos. Molecular Reproduction and Development, New York, v.76, n.11, p , Palavras chave: criobiologia, criotolerância, Zebu. Key words: cryobiology, crytolerance, Zebu Trabalho aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade Pio Décimo no processo 05/11. Tabela 1: Efeito da vitrificação de embriões PIV em condições de campo sobre taxa de prenhez de Gir (Bos indicus). Prenhez (35 dias) Prenhez (60 dias) Estágio de desenvolvimento n (%) n (%) Embrião Fresco (controle): Bi 18/39 (46,15) 17/39 (43,58) Bl 23/49 (46,93) 23/49 (46,93) Bx 26/52 (50,00) 26/52 (50,00) Total 67/140 (47,85) 66/140 (47,14) Embriões vitrificados: Bi 14/40 (35,00) 13/40 (32,50) Bl 22/52 (42,30) 20/52 (38,46) Bx 20/46 (43,47) 20/46 (43,47)

5 Total 56/138 (40,57) 53/138 (38,40) PIV: produção in vitro; Bi: Blastocisto inicial; Bl: Blastocisto; Bx: Blastocisto expandido. 35 e 60 dias após a fertilização in vitro.

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