USO DE FLUOROCROMOS PARA AVALIAÇÃO DO SEMÊN SEXADO DE BOVINOS GIROLANDO Use of fluorochromes for the assessment of sexed semen of Girolando cattle

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1 USO DE FLUOROCROMOS PARA AVALIAÇÃO DO SEMÊN SEXADO DE BOVINOS GIROLANDO Use of fluorochromes for the assessment of sexed semen of Girolando cattle Rita de Kássia Oliveira de ANDRADE 1, Pábola Santos NASCIMENTO 1, Maiana Silva CHAVES 1, Marcelo Tigre MOURA 1, Sebastião Inocêncio GUIDO 2, Cláudio Coutinho BARTOLOMEU 1 1 Universidade Federal Rural de Pernambuco, DMV. pabolasn@hotmail.com 2 Instituto Agronômico de Pernambuco, Recife-PE, Brasil.

2 Introdução Desde a década de 40 cientistas reconhecem a necessidade de obter informações precisas acerca da porcentagem de espermatozóides móveis (de um ejaculado/de uma palheta). Pois essas informações sobre o movimento espermático poderiam ser utilizadas para prever o potencial de fertilidade de um macho ou selecionar o ''melhor'' procedimento para a preparação do sêmen (RUPERT & DAVID, 2004). Têm-se realizado estudos com o intuito de identificar o que seria esse potencial fecundante, muitos resultados evidenciam divergências entre os tipos de sêmen (convencional/sexado), raça, reprodutores utilizados, palhetas e partidas de um mesmo animal (MARQUES et al., 1995; BLONDIN et al., 2009). A integridade da membrana plasmática dos espermatozoides é geralmente sinônimia de espermatozoide viável (GRAHAM & MOCÉ, 2005), em virtude do seu papel biológico, qualquer mudança na função mitocondrial pode ser refletida na alteração da motilidade (THOMAS et al., 1998), do mesmo modo, um acrossoma intacto até o momento em que o espermatozoide se liga à zona pelúcida do oócito e sofre a reação acrossômica, liberando enzimas que permitem a fusão com a membrana do oócito (HAFEZ & HAFEZ, 2004) é de fundamental importância. As preparações que empregam a combinação de sondas fluorescentes ou fluorocromos, avaliadas por microscopia de epifluorescência ou citometria de fluxo, conferem especificidades na diferenciação entre células funcionais e afuncionais, e destacam-se como as mais utilizadas na determinação da integridade estrutural dos espermatozóides (GRAHAM & MOCÉ, 2005; ARRUDA et al., 2007). Uma vez que o sexo do produto é um fator determinante para o desempenho produtivo e econômico de uma atividade (SÁ FILHO et al., 2010), percebendo a lacuna de estudos feitos na raça a respeito dos danos da sexagem e diante do importante papel da raça Girolando na pecuária nacional (SILVA et al., 2012), objetivou-se comparar as análises realizadas com sêmen sexado e convencional de três touros da raça 5/8 Girolando utilizando sondas fluorescentes, e observar a influencia da sexagem sob a estrutura espermática, afim de identificar possíveis alterações provocadas pela técnica. Material e Métodos O estudo oi realizado no Laboratório de Andrologia do Departamento de Medicina Veterinária ANDROLAB, da Universidade Federal Rural de Pernambuco em Recife. Foram feitas três repetições de cada procedimento para o sêmen convencional e três para o sêmen sexado de cada touro, todas submetidas às mesmas condições. Foram utilizadas palhetas criopreservadas contendo sêmen convencional (três doses) e sêmen sexado (três doses), provenientes de três touros da raça pura sintética 5/8 Girolando (T1, T2 e T3), de mesma partida para cada tipo de sêmen/touro. Para a determinação da integridade do

3 acrossoma, os espermatozoides foram corados com isotiocianato de fluoresceína conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA), segundo Silva et al., (2012). Avaliação da integridade da membrana do plasma foi determinada usando uma combinação de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e iodeto de propídio (PI), tal como descrito por Silva et al., Para determinação do potencial da membrana mitocondrial, um método adaptado de Guthrie HD & Welch GR, (2006) foi utilizado. As análises foram avaliadas por microscopia de epifluorescência (Carl Zeiss, Göttingen, Alemanha). Os dados foram analisados pelo programa estatístico SPSS 16.0 empregando-se a análise de variância (ANOVA). Para todas as análises, os valores foram considerados significativos (P< 0,05). Antes dessas análises, dados percentuais para acrossoma íntegro, integridade da membrana plasmática, e alto potencial da membrana mitocondrial foram transformados em arcoseno. Todos os resultados foram expressos em média ± erro padrão. Resultados e Discussão As análises feitas a partir da utilização de fluorocromos comparando as amostras convencionais com as amostras sexadas do mesmo animal foi significativa para o T3 ao que se refere à membrana plasmática e acrossoma (tabela 1). A base molecular do processo de capacitação espermática é a remoção de colesterol e mudanças na distribuição dos fosfolipídeos de membrana que levam à abertura dos canais de Ca++. Alterações semelhantes podem acontecer gerando uma capacitação espermática prematura. Este processo não é desejável, pois diminui a longevidade espermática (FREITAS-DELL'AQUA et al., 2011). Graham & Mocé, (2005) observaram que a integridade estrutural da membrana plasmática dos espermatozoides é geralmente sinonímia de viabilidade espermática espermatozoide, no presente experimento foram vistas diferenças quanto as avaliações de membrana plasmática e acrossomal para o touro 3. Thomas et al., (1998) constataram que qualquer mudança na função mitocondrial pode ser refletida na alteração da motilidade. No presente estudo nenhuma diferença foi obtida a partir da avaliação do potencial de membrana mitocondrial para quaisquer dos touros estudados. Conclusão O processo de sexagem pode ter afetado as características estruturais da célula espermática de touros 5/8 Girolando. Comite de Ética O projeto foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade Pio Décimo. Processo nº 05/11.

4 Referências Bibliográficas ARRUDA, R. P.; ANDRADE, A. F. C.; PERES, K. R., et al. Biotécnicas aplicadas à avaliação do potencial de fertilidade do sêmen equino. Revista Brasileira Reprodução Animal, Belo Horizonte, v.31, n.1, p.8-16, BLONDIN, P.; BEAULIEU, M.; FOURNIER, V.; et al. Analysis of bovine sexed sperm for IVF from sorting to the embryo. Theriogenology, Stoneham, v.71, n. 1, p.30-38, GRAHAM, J.K.; MOCÉ, E.. Fertility evaluation of frozen/thawed semen. Theriogenology, Stoneham, v.64, n. 3, p , GUTHRIE, H.D. & WELCH, G. R. Determination of intracellular reactive oxygen species and high mitochondrial membrane potential in Percoll-treated viable boar sperm using fluorescence-activated flow cytometry, Journal Animal Science, Champaign, v. 84, n. 8, p , HAFEZ, E. S. E. & HAFEZ B. Transporte e sobrevivência de gametas. In: HAFEZ, E.S.E. & HAFEZ, B., Reprodução Animal, 7ª Ed., Barueri-SP: Manole, 2004, p MARQUES, C.C.; BAPTISTA, M.C.; PEREIRA, R.M.; et al.. Influência do sémen de diferentes touros sobre as taxas de fertilização in vitro e desenvolvimento de embriões em co-cultura. Revista Portuguesa de Zootecnia, Lisboa, n. 2, p , RUPERT P. AMANN & DAVID F. KATZ. Reflections on CASA After 25 Years. Journal of Andrology, Philadelphia, v.25, n. 3, p , SÁ FILHO,M.F.; SOUZA A.H.; MARTINS C.M.; et al.. Avanços nos Protocolos Reprodutivos em Fêmeas Bovinas Utilizando Sêmen Sexado. São Paulo, Brasil Disponível em: < /Avancos-Sexado_Baruselli.pdf> Acesso em 01 mai SILVA, E.C.B.; CAJUEIRO, J.F.P.; SILVA, S.V. et al. Effect of antioxidants resveratrol and quercetin on in vitro evaluation of frozen ram sperm, Theriogenology, Stoneham, v.77, n. 8, p , SILVA, S.V., SOARES, A.T., BATISTA, A.M., et al. In vitro and in vivo evaluation of ram sperm frozen in Tris egg-yolk and supplemented with superoxide dismutase and reduced glutathione, Reproduction in Domestic Animals, Berlin, v.46, n.5, p , SILVA, MARCOS VINICIUS G. BARBOSA DA (Ed.). Programa de Melhoramento Genético da Raça Girolando Sumário de Touros Resultado do Teste de Progênie - Julho/2012 /. Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, THOMAS, C.A.; GARNER, D. L.; DEJARNETTE, J. M. et al. Effect of cryopreservation in bovine sperm organelle function and viability as determined by flow cytometer. Biology of Reproduction, New York, v.58, n. 3, p , 1998.

5 Tabela 1: Médias e erros-padrão da integridade da célula espermática do sêmen convencional X sexado de três touros 5/8 Girolando. Touro 1 Touro 2 Touro 3 Convec. Sexado Convenc. Sexado Convenc. Sexado Membrana citoplasmática 47,5±11,8 a 38,0±2,7 a 40,1±7,3 b 44,1±4,4 b 66,5±2,7 c 53,8±1,8 C Potencial de memb. mitocondrial 66±19,0 a 79,6±4,8 a 73,6±3,6 b 81,0±3,2 b 82,6±7,9 c 85,5±2,7 c Membrana acrossomal 71,8±4,0 a 56,0±12,8 a 74,2±3,0 b 55,8±10,5 b 76,6±0,4 c 69,3±1,1 C a, A Na mesma linha, médias com letras sobescritas diferentes (P<0,05). b,b Na mesma linha, médias com letras sobescritas diferentes (P<0,05). c, C Na mesma linha, médias com letras sobescritas diferentes(p<0,05).