Processamento e preservação de sêmen de peixes nativos

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1 Processamento e preservação de sêmen de peixes nativos Paulo César Falanghe Carneiro Embrapa Aracaju - SE

2 Introdução Blaxter 1950: Arenque com reprodução em épocas diferentes Uso do gelo seco Conhecimento mais avançado: salmão do Atlântico e truta arco- íris Espécies tropicais => falta de conhecimento básico

3 Introdução Armazenamento de sêmen de peixes Curto prazo (dias) => resfriamento Longo prazo (anos) => congelação/congelamento (tema desta palestra)

4 Objetivo da apresentação Apresentar técnicas e estado da arte Abordar a importância da aplicação das técnicas como ferramenta na conservação dos recursos genéticos em ambientes naturais e trabalhos de melhoramento genético/rotina de laboratórios de reprodução na aqüicultura

5 Por que conservar sêmen de peixe? Importância ambiental e econômica Importância AMBIENTAL Alterações do meio ambiente por atividades antrópicas Perda contínua de características genéticas que podem ter uso futuro importante

6 Projeto Repovoamento Alto Rio Iguaçu (ambientes diversos / degradação)

7 Projeto Repovoamento Alto Rio Iguaçu Km 6 Pontos de coletas de reprodutores e soltura de juvenis

8 Projeto Repovoamento Alto Rio Iguaçu (biologia molecular / RAPD / dendograma de similaridade)

9 Região do Baixo Rio São Francisco Tabuleiros (Sergipe/Alagoas) Costeiros

10 Por que conservar sêmen de peixe? Importância ECONÔMICA Domesticação a partir de indivíduos selvagens Características genéticas dos selvagens podem ter uso futuro de importância econômica Plantel de reprodutores Renovação constante Risco de endocruzamento/consangüinidade Cruzamentos seletivos => reduz deversidade Grande número de reprodutores => elevado custo de manutenção

11 Por que conservar sêmen de peixe? Importância ECONÔMICA Armazenamento para produção de alevinos Ainda há restrições técnicas e comerciais Muitas vantagens n. reprodutores gasto com hormônio melhora atenção com as fêmeas

12 Por que conservar sêmen de peixe? Outras vantagens (ponto de vista ambiental e econômico): Sincronização machos e fêmeas Facilidade de transporte de gametas Redução de problemas devido ao envelhecimento do sêmen durante o período reprodutivo

13 Conhecendo melhor o sêmen dos peixes Particularidade mais importante Ativação pela água (imóveis enquanto nos testículos) Peixe vive na água!?!?! Cuidados na coleta Água (à seco) Urina Fezes

14 Conhecendo melhor o sêmen dos peixes Ativação do espermatozóide PROCESSO IRREVERSÍVEL!!! Motilidade Curta duração (espécies tropicais: aprox. 1 min.) Curimbatá Matrinxã Pintado Pacu

15 Conhecendo melhor o sêmen dos peixes Diluição para armazenamento proteção das células (congelação) ajustes de concentração (esptz./ml) soluções aquosas!!! Meio diluente com elevada pressão osmótica (Glicose)

16 A congelação e seus efeitos nas células Formação de gelo no interior das células Injúrias irreversíveis Velocidade de congelação Muito Rápida Muito Lenta Formação de cristais Sem desidratação Efeito solução (alterações ph, osmolaridade, composição sais,...)

17 A congelação e seus efeitos nas células Velocidade adequada de congelamento Permite a desidratação necessária Previne a formação de cristais de gelo Preserva a integridade celular (física e fisiológica) Sêmen Necessidade de substâncias crioprotetoras

18 A congelação e seus efeitos nas células Crioprotetores intracelulares e extracelulares Crioprotetores intracelulares Atóxicos Retiram água do interior das células Reduzem a temperatura de congelamento Previnem a formação de cristais Ex.: DMSO (dimetilsulfóxido), glicerol, metanol, metilglicol, propileno glicol

19 A congelação e seus efeitos nas células Crioprotetores extracelulares Revestimento da célula externamente Estabiliza a membrana celular Reduz injúrias Fonte de nutriente??? Ex.: Gema de ovo fresca (ácidos graxos, antioxidantes)

20 O congelamento e seus efeitos nas células Descongelação: mesma atenção Velocidade vs. Temperatura Congelação / Descongelação Necessidade de ensaios prévios para diferentes espécies

21 A conservação do sêmen Congelamento Gelo seco (- 79 o C) Pouco usada atualmente Peletes no bloco de gelo seco Nitrogênio líquido (- 196 o C) Melhor para longo prazo Facilita identificação e organização Menores riscos de contaminação

22 A conservação do sêmen Nitrogênio líquido (cuidados especiais) Baixa temperatura Alta taxa de expansão EPI (óculos / luvas) Recipientes especiais Diminui perdas evaporação Sem lacre Transporte Regulamentação internac. / mercad. perigosa

23 A conservação do sêmen Dry shipper

24 A conservação do sêmen Transporte

25 A conservação do sêmen o C Metabolismo Nulo Armazenamento ilimitado (manutenção nível de nitrogênio liquido no botijão) Questões importantes: 1. Incorporação da solução protetora 2. Resfriamento / Congelação 3. Armazenamento propriamente dito 4. Descongelação 5. Ativação e fertilização

26 A conservação do sêmen 1. Incorporação do meio diluidor (geralmente feita no próprio tubo de coleta de 15 ml) Composição final 1:3 a 1:10 (depende da concentração final desejada / n. ovos a ser fertilizados) Concentrações mais utilizadas DMSO 5-10% Glicose 5% Gema de ovo 5-10%

27 A conservação do sêmen Teste de motilidade e determinação da concentração espermática

28 A conservação do sêmen Viabilidade (coloração diferencial)

29 A conservação do sêmen Diluição e envase das palhetas

30 A conservação do sêmen 2. Resfriamento / Congelação Geralmente feito no vapor do nitrogênio líquido bandeja próprio botijão dry shipper Taxas de congelamento: 5-90 o C/min

31 A conservação do sêmen 2. Resfriamento / Congelação

32 A conservação do sêmen 3. Armazenamento propriamente dito

33 A conservação do sêmen 3. Armazenamento propriamente dito Organização das palhetas (em raques) nos canecos e monitoramento do nível do nitrogênio líquido no botijão

34 A conservação do sêmen 4. Descongelação Rápido para evitar recristalização (3-8 seg.) o C Imersão da palheta na água (cuidado para não haver ativação)

35 A conservação do sêmen 5. Ativação e fertilização Solução ativadora Água apenas NaCl 0,45% NaHCO 3 1%

36 CASA - Computer Assisted Sperm Analysis Movimento, morfologia, contagem e viabilidade

37 Considerações finais Criopreservação de sêmen de espécies nativas tropicais programas de recuperação ambiental e piscicultura Necessidade de estudos adicionais Fonte inesgotável de pesquisa

38 Considerações finais Bancos de genes (armazenamento material genético) Custeio por prazo indeterminado Unir interesses conservacionistas e cadeia produtiva para captação e geração de recursos financeiros Interações entre empresas privadas, instituições de pesquisa, agências de fomento => otimização de recursos financeiros e humanos

39 OBRIGADO Paulo Carneiro (79)

40 Jundiá Rhamdia quelen (resfriamento de sêmen)

41 Tempo de motilidade de espermatozóides do sêmen de jundiá Rhamdia quelen armazenado por 12 dias sob refrigeração (6 o C). N= Motilidade (segungos) * * * * * Período experim ental (dias) Resfriamento Técnica simples (baixo custo / pequeno produtor) Redução de custos com plantel de reprodutores Aumentar atenção junto às fêmeas

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