Osmolaridade dos Ativadores e Taxa de Diluição na Ativação do Sêmen Criopreservado de Curimba (Prochilodus lineatus)

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1 Osmolaridade dos Ativadores e Taxa de Diluição na Ativação do Sêmen Criopreservado de Curimba (Prochilodus lineatus) VIVIANE DE OLIVEIRA FELIZARDO Doutoranda em Zootecnia/UFLA, Rua João Mattioli, 542-centro. viviofbio@yahoo.com.br LUIS DAVID SOLIS MURGAS Doutor em medicina Veterinária. Docente DMV/UFLA. lsmurgas@ufla.br RODRIGO DIANA NAVARRO Pós-doutorando em Medicina Veterinária/UFLA, DMV/UFLA. rddnavarro@yahoo.com.br ANTÔNIO CARLOS Mestrando em Zootecnia/UFLA, DZO/UFLA. Antonycarl2003@yahoo.com.br MICHELE PAULINO SAMPAIO - Mestranda em Medicina Veterinária, DMV/UFLA. mspmichelle@bol.com.br Resumo O presente trabalho foi realizado na Estação de Piscicultura da CEMIG em Itutinga- MG e no Departamento de Medicina Veterinária-UFLA, com objetivo de avaliar a influência de ativadores com diferentes osmolaridades e taxa de diluição na ativação de sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus). Quatro machos foram induzidos a espermiação, utilizando extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC). As amostras de sêmen coletadas de cada animal foram diluídas em duas soluções (DMSO + lactose e metanol + lactose) na proporção de 1:4, acondicionadas em palhetas de 0,5 ml e colocadas em nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas por imersão em banho-maria a 60º C, por oito segundos. Foram avaliadas as taxas (%) e duração (s) da motilidade espermática dos tratamentos. Na ativação foram utilizados água destilada, NaCl 0,3%, NaCl 0,6% e NaCl 0,9%, contendo as respectivas osmolaridades: 30, 99, 183 e 293 mosm nas taxas de diluição de 1:2, 1:4, 1:6, 1:8 sêmen:solução ativadora. Para análise estatística dos dados foi utilizado o programa SAS. O uso do crioprotetor DMSO, não proporcionou efeito (P>0,05) na taxa de motilidade, nas taxas de diluição de 1:2, 1:4 e 1:6 sêmen: ativador, entre as osmolaridades

2 testadas. Para a diluição de 1:8 foi observado efeito linear (P<0,06). Na duração da motilidade, a diluição 1:2 apresentou efeito quadrático (P<0,05) até a concentração máxima de 249,53 mm. A diluição de 1:4 e 1:6 não apresentou diferença (P>0,05). Para a diluição de 1:8 foi observado efeito quadrático (P<0,05) com a concentração máxima de 126 mm. Para o sêmen que foi criopreservado em crioprotetor metanol, a diluição de 1:4 influenciou (P<0,07) a taxa de motilidade espermática de forma linear. Para as taxas de diluição de 1:2, 1:6 e 1:8, não foram observadas diferenças (P>0,05). Na duração da motilidade, as diluições 1:2 e 1:4 não apresentaram diferenças (P>0,05). As diluições 1:6 e 1:8 influenciaram (P<0,05) a duração da motilidade espermática de forma linear. Palavras-chave: criopreservação, motilidade espermática, peixe, sêmen Introdução A capacidade técnica para preservação de gametas e embriões de peixes e de invertebrados aquáticos tem se expandido rapidamente nos últimos anos, impulsionada primariamente pela indústria aqüícola (Carolsfeld et al., 2003). A criopreservação é uma técnica importante no controle reprodutivo de muitas espécies e sua aplicação em peixes está em amplo desenvolvimento. Envolve procedimentos que permitem o armazenamento de espermatozóides em nitrogênio líquido, mantendo-se a viabilidade dos gametas por tempo indefinido. A criopreservação do sêmen tem sido testada para várias espécies como, por exemplo, o dourado Salminus maxillosus (Carolsfeld et al., 2003); a piracanjuba Brycon Orbignyanus (Carolsfeld et al., 2003; Maria et al., 2006; Felizardo, 2008); o matrinxã Brycon orthotaenia (Silveira, 2000); o curimbatá Prochilodus linaetus (Murgas et al., 2007); e a tilápia-nilótica Oreochromis niloticus (Amorim, 2002). No processo de criopreservação, a incorporação de soluções diluidoras é fundamental para proporcionar meio osmótico e nutricionalmente ideal aos espermatozóides durante a aplicação da biotecnologia. O BTS (Beltsville Thawing Solution) é um diluidor desenvolvido e preconizado para conservação do sêmen suíno. Entretanto, vários autores têm utilizado com sucesso esse diluidor em pesquisas com peixes de piracema, como piracanjuba Brycon orbignyanus (Maria et al., 2006; Felizardo, 2008), curimba Prochilodus linaetus (Murgas et al., 2007) e pirapitinga Brycon nattereri (Oliveira et al., 2007).

3 Juntamente com o diluidor, é necessário o uso de um crioprotetor para que haja uma proteção do espermatozóide durante o congelamento e o descongelamento (Squires et al., 1999). Estes crioprotetores devem possuir como propriedades uma baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água. Os crioprotetores podem ser classificados como intracelulares ou permeáveis e extracelulares ou impermeáveis. Entre os crioprotetores intracelulares mais utilizados podem ser citados dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, metanol e etilenoglicol. A gema de ovo e o leite em pó desnatado são os crioprotetores extracelulares mais comuns (Carolsfeld e Harvey, 1999). A motilidade espermática é um dos principais parâmetros a serem considerados na análise da qualidade do sêmen de peixes (Godinho, 2000). Para tanto, deve-se levar em conta que a motilidade espermática é influenciada por inúmeros fatores como temperatura, estado nutricional, estado sanitário, condições de análise, solução ativadora e a proporção ativador:sêmen. Em baixas proporções de ativador/sêmen, somente alguns espermatozóides são ativados, enquanto outros têm sua ativação tardia. Este fenômeno deve-se à diluição insuficiente ou à mistura inadequada da solução ativadora com o sêmen (Chereguini et al., 1999). Entre as soluções ativadoras da motilidade espermática, merecem destaque a água destilada, soluções salinas de bicarbonato de sódio, NaCl e KCl em diferentes concentrações, dependendo da espécie (Ravinder et al., 1997). Miliorini et al. (2004) utilizaram NaCl (30 e 60 mm) e NaHCO 3 (30 e 60 mm) como soluções ativadoras do sêmen de P. lineatus resfriado. Silveira (2000) observou que a solução de NaHCO 3 1% favoreceu satisfatoriamente a taxa de motilidade do sêmen de matrinxã (Brycon cephalus), porém, os ovócitos, durante a fertilização, se aglutinaram no fundo do recipiente e a taxa de eclosão foi nula. Dentre as espécies que tem se destacado em estudos de criopreservação podemos citar a curimba (Prochilodus lineatus), que é uma espécie nativa, que necessita migrar com destino à cabeceira do rio durante o período de piracema, para realizar a reprodução. É uma das espécies de peixes de água doce com maior significado na piscicultura comercial (Cerqueira e Fernandes, 2002), sendo muito apreciada na culinária dos estados da região nordeste do Brasil (Maia et al., 1999). Um dos principais aspectos que estimulam o desenvolvimento da biotecnologia que auxiliam na procriação da espécie é o fato de que suas larvas são muito bem utilizadas como alimento de espécies carnívoras na fase larval, além de servir como espécie-modelo no

4 desenvolvimento de pesquisas reprodutivas, dadas sua elevada prolificidade e facilidade de manejo. Nesse sentido objetivou-se verificar a influência de ativadores com diferentes osmolaridades e taxas de diluição na ativação de sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus). Materiais e Métodos O experimento foi realizado na Estação de Piscicultura da Companhia Energética de Minas Gerais CEMIG, em Itutinga, durante o período de piracema nos meses de novembro de 2006 a janeiro de Foram selecionados quatro machos de curimba de peso médio de g. que liberavam sêmen sob pequena compressão na parede celomática. Para a indução de liberação de gametas, foi ministrada uma dose única de 1 mg/kg intramuscular de extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC) por kg de peso corporal. Aproximadamente 196 horas graus após a aplicação do hormônio foi realizada a coleta do sêmen a seco. Logo após a coleta foi verificada a ausência de contaminantes como fezes, urina ou sangue. Uma alíquota de 10 µl de sêmen foi coletada para se estimar a concentração espermática. Foi avaliada a porcentagem de motilidade espermática do sêmen in natura em microscópio óptico e estimada a percentagem média de espermatozóides móveis. A duração da motilidade espermática foi estimada em segundos, desde a homogeneização com água destilada, até que somente 10% dos espermatozóides se encontrassem móveis. Somente amostras que apresentaram motilidade superior a 85% foram utilizadas para criopreservação. Uma amostra de sêmen de cada animal foi diluída em solução crioprotetora contendo o diluidor BTS (Beltsville Thawing Solution) mais a combinação dos crioprotetores intracelulares metanol 8% e dimetilsulfóxido (DMSO) 8% e o extracelular lactose 5%, na proporção de 1:4 (sêmen/solução crioprotetora). O sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,5 ml, e colocado em botijão de vapor de nitrogênio líquido para resfriamento. Após 24 horas, as amostras foram transferidas para o botijão de armazenamento e mantidas até o descongelamento. O descongelamento foi realizado dois anos após o congelamento no Laboratório de Fisiologia e Farmacologia do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Lavras. As palhetas foram imersas em banho-maria a 60º C, durante oito segundos (Murgas et al., 2007; Felizardo, 2008), sendo em seguida, avaliado quanto à porcentagem (%)

5 e duração (s) da motilidade utilizando o mesmo processo que foi usado para avaliação do sêmen in natura. Amostras de 2 µl de sêmen foram ativadas utilizando quatro diferentes soluções ativadoras: água destilada; NaCl 0,3%; NaCl 0,6% e NaCl 0,9%. As osmolaridades dos respectivos ativadores estão apresentadas na Tabela 1, sendo testado quatro diferentes proporções de sêmen:ativador: 1:2, 1:4, 1:6, 1:8. Vale ressaltar que o sêmen criopreservado já estava diluído na proporção de 1:4 sêmen:solução crioprotetora. A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o programa SAS. Tabela 1 Osmolaridade de diferentes concentrações de NaCl Concentração de NaCl (%) Osmolaridade (mosm) ,3 99 0, ,9 293 Resultados e Discussão Os valores médios da taxa de motilidade (%) do sêmen criopreservado com o crioprotetor DMSO, em função dos tratamentos estão apresentados na Tabela 2. No presente experimento a taxa de diluição de 1:2, 1:4 e 1:6 sêmen:ativador para o sêmen criopreservado com o crioprotetor DMSO não apresentou diferença (P>0,05) entre as osmolaridades testadas. Para a taxa de diluição de 1:8 sêmen:ativador foi observado efeito linear (P<0,06) negativo de acordo com o aumento da osmolaridade do ativador. Tabela 2 - Valores médios da taxa de motilidade (%) do sêmen criopreservado com o crioprotetor DMSO, em função dos tratamentos estudados. Taxa de Osmolaridade dos Ativadores (mm) Significância* diluição : , ,25 ns 1:4 48, ,5 25 ns 1: ,75 37,5 18,75 ns 1:8 1 46,25 58,75 33,75 15 P<0,06 *Efeito linear - y = 59, ,142209x, r 2 = 22%

6 Embora nenhum efeito linear significativo tenha sido encontrado para as taxas de diluição 1:2, 1:4; 1:6, as taxas de motilidade diminuíram de acordo com aumento da osmolaridade do ativador. Shimoda et al. (2007) testando os efeitos da osmolaridade sobre a motilidade espermática da piabanha (Brycon insignis), utilizaram nove concentrações de NaCl variando de 0 a 1,6%. Os autores verificaram que osmolaridade de até 274 mosm ativou praticamente todos os espermatozóides, mas com 342 mosm, apenas parte dos espermatozóides foram ativados e quando a concentração aumentou para 410 mosm ou mais, não ocorreu ativação espermática. Este fato pode ser explicado pelos ativadores com maiores concentrações proporcionarem uma osmolaridade próxima à osmolaridade seminal, que para as espécies de água doce variam de 286 mosm na piabanha (Shimoda et al., 2004) à 350 mosm em tilápia (Shimoda et al., 2007), e com isso não proporcionando meio adequado para ativação completa dos espermatozóides. Suquet et al. (1994) afirmam que altas pressões osmóticas inibem a motilidade espermática. Carolsfeld et al. (2003) encontraram uma taxa de motilidade variando de 5 a 20% para o sêmen de curimba criopreservado com DMSO e ativado com NaCl 25 mmol, e quando utilizaram água destilada como ativador, obtiveram taxa de motilidade variando de 0 a 5%. Para ativação do sêmen in natura de piau-açu (Leporinus macrocephalus), Viveiros et al. (2003) verificou que osmolaridade de 50 mm de NaHCO 3 apresentou as maiores taxas de motilidade em relação as concentrações de 75 e 119 mm. A diminuição da osmolaridade externa imediatamente leva ao reajustamento da concentração iônica interna pelo processo osmorregulativo da membrana. A diminuição da concentração iônica atinge valores em que a atividade da ATPase é ótima e, conseqüentemente, a motilidade é em alta velocidade (Cosson, 2004). Inoda e Morisawa, 1987 observou em espécies de água doce osmolaridade do sêmen ao redor de 250 mosmol. As baixas concentrações (< 75 mm) e conseqüentemente, baixa osmolaridade (< 150 mosml) das soluções de NaCl, promoveram as melhores taxas de motilidade espermática, classificando essas soluções como ativadoras. Os valores médios para duração de motilidade do sêmen criopreservado com o crioprotetor DMSO, em função dos tratamentos estão apresentados na Tabela 3. No presente experimento a taxa de diluição 1:2 sêmen:ativador apresentou efeito quadrático (P<0,05) até a concentração máxima de 249,53 mm. A taxa de diluição de 1:4 e 1:6 sêmen:ativador não apresentou diferença (P>0,05). Para a taxa de diluição de 1:8

7 sêmen:ativador foi observado efeito quadrático (P<0,05) com a concentração máxima de 126 mm. Murgas et al. (2007) encontraram uma duração da motilidade média de 37 segundos para o sêmen de curimba criopreservado com DMSO e ativado com água destilada em uma taxa de diluição 1:4 sêmen: solução ativadora. Tabela 3 - Valores médios de duração motilidade (s) do sêmen criopreservado com o crioprotetor DMSO, em função dos tratamentos estudados. Taxa de Ativadores mm Significância diluição : P<0,05 1: ns 1: ns 1: p<0,05 1. Efeito quadrático - Y= 56, ,375294x + 0,000752x 2 R 2 = 37 % 2. Efeito quadrático - Y= 12, ,279036x 0,00011x 2 - R 2 = 35 % Pode-se observar em todas as taxas de diluição, que o ativador com maior osmolaridade proporcionou os menores tempos de duração da motilidade; estes resultados estão relacionados com as taxas de motilidade menores, que o ativador com maior osmolaridade apresentou. Os valores médios da taxa de motilidade (%) do sêmen criopreservado com o crioprotetor metanol, em função dos tratamentos estão apresentados na Tabela 4. Para o sêmen que foi criopreservado com crioprotetor metanol a taxa de diluição de 1:4 sêmen:ativador influenciou (P<0,07) a taxa de motilidade espermática de forma linear positiva de acordo com o aumento da osmolaridade do ativador. Para as taxas de diluição de 1:2, 1:6 e 1:8 não foram observados diferença significativa (P>0,05).

8 Tabela 4- Valores médios de motilidade (%) do sêmen criopreservado com o crioprotetor metanol, em função dos tratamentos estudados. Taxa de Ativadores mm Significância diluição : , ,5 ns 1:4 1 27,5 37,5 42,5 47,5 P<0,07 1:6 2 37, ns 1: ,5 ns 1. y= x, r 2 = 28% 2. y= x, r 2 = 46% 3. y = 45, ,113691x, r 2 = 38% Carolsfeld et al. (2003) encontraram taxa de motilidade variando de 80 a 100% para o sêmen de curimba criopreservado com metanol e leite em pó, ativado com NaCl 0,45%. O sêmen criopreservado com o crioprotetor metanol parece não ter sofrido influência negativa com aumento da osmolaridade do ativador, efeito que foi observado no sêmen criopreservado com DMSO. Este fato demonstra a especificidade de cada protetor em relação ao ativador. No entanto, a partir da osmolaridade de 99 mm, ocorreu diminuição da taxa de motilidade de acordo com o aumento da taxa de diluição. As soluções ativadoras, usadas normalmente em sêmen de espécies nativas, se mostram espécie-específica. Mesmo quando os espermatozóides entram em contato com meios de baixa osmolaridade, ocorrem respostas diferentes entre variadas espécies e até mesmo entre o sêmen fresco e criopreservado da mesma espécie (Marques, 2001). Shimoda et al. (2007) verificaram para o sêmen in natura de piabanha que a ativação utilizando diferentes concentrações de NaCl com osmolaridade variando de 0 a 274 mosm proporcionaram taxas de motilidade semelhantes. Os valores médios da duração da motilidade do sêmen criopreservado com o crioprotetor metanol, em função dos tratamentos estão apresentados na Tabela 5. No presente estudo as taxas de diluição sêmen:ativador 1:2 e 1:4 utilizando o crioprotetor metanol, não apresentaram diferenças (P>0,05) no tempo de duração da motilidade espermática. A taxa de diluição sêmen:ativador 1:6 e 1:8 influenciou (P<0,05) a duração da motilidade espermática de forma linear.

9 Tabela 5 - Valores médios de duração de motilidade (s) do sêmen criopreservado com o crioprotetor metanol, em função dos tratamentos estudados. Taxa de Ativadores mm Significância diluição : ns 1: ns 1: P<0,05 1: P<0,05 1. y = 48, ,109078x, r 2 = 39% 2. y = 53, ,141982x, r 2 = 51% Para o tempo de duração da motilidade, verificou-se efeito semelhante ao da taxa de motilidade, onde, sêmen criopreservado com o crioprotetor metanol parece não ter sofrido influência negativa do aumento da osmolaridade do ativador. A partir da osmolaridade de 99 mm, ocorreu diminuição da taxa de motilidade de acordo com o aumento da taxa de diluição. A duração da motilidade é dependente da taxa de motilidade, por isso o mesmo efeito é visto nas duas avaliações. Conclusão O ativador a ser utilizado na ativação do sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus) e a taxa diluição são dependentes do tipo de crioprotetor utilizado no processo de criopreservação. Quando se utiliza o crioprotetor DMSO, a osmolaridades do ativador influencia a taxa e duração da motilidade espermática. Por outro lado, quando o crioprotetor utilizado for o metanol, a taxa de diluição na ativação é quem influencia a taxa e duração da motilidade espermática. Agradecimento À Companhia Energética de Minas Gerais CEMIG, pela fundamental colaboração na realização deste e de outros inúmeros trabalhos ligados à piscicultura, primando conosco pela preservação da fauna de Piracema e do ecossistema aquático. Literatura Citada

10 Amorim, VMC. Criopreservação de sêmen de tilápia-nilótica (Oreochromis niloticus), variedade chitralada p. Dissertação (Mestrado em Zoologia) Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. Belo Horizonte. Carolsfeld, J; Harvey, B. Conservação de recursos genéticos de peixes: teoria e prática. Curso de Treinamento Brasileiro. Victoria: World Fisheries Trust, p. Carolsfeld J.; Godinho, HP; Zaniboni Filho, E. et al. Cryopreservation of sperm in Brazilian migratory fish conservation. Journal of Fish Biology, v.63, n.2, p , Cerqueira, CC; Fernandes, MN Gill tissue recovery after copper exposure and blad parameter responses in the tropical fish, Prochilodus scrofa. Ecotoxicol. Environ. Safety, v. 52, p Chereguini, O; De la Banda IG; Rasines, I; Fernandez A. Artificial fertilization in turbot, Scopothalmus maximus, (L.): different methods and determination of the optimal sperm-egg ratio. Aquaculture Research, v. 30, p , Cosson, J. The ionic and osmotic factors controlling motility of fish spermatozoa. Aquaculture International, London, v. 12, n. 1, p , Felizardo, VO. Manejo reprodutivo da piracanjuba (Brycon orbignyanus): congelamento de sêmen e taxas de fertilidade p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG. Godinho, HP. Criopreservação de sêmen de peixes. Informe Agropecuário, v.21, n.203, p.6-20, Inoda, T e Morisawa, M. Effect of osmolality on the initiation of sperm motility in Xenopus laevis. Comp. Biochem. Physiol. 88, Maia, EL; Oliveira, C C S.; Santiago, A P; Cunha, F E A; Holanda, F C A F; Sousa, J A. Composição química e classes de lipídios em peixe de água doce Curimatã comum, Prochilodus cearensis. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 19, n. 3, p , 1999.

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12 Silveira AN. Caracterização espermática, preservação criogênica do sêmen e fertilidade do matrinxã (Brycon cefálios) p. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP. Squires, EL; Pickett, BW; Graham, JK; Vanderwall, DK; McCue, PM; Bruemmer, JE. Principles of cryopreservation. In: Cooled and frozen Stallion Semen, b.09, Suquet, M; Billard, R; Cosson, J; Dorange, G; Chauvaud, L; Mugnier, C; FauveL, C Sperm features in turbot (Scophthalmus maximus):a comparison with other freshwater and marine fish species. Aquat. Living Resour., 7: Viveiros, A T M; Jatzkowski, A; Komen, J Effects of oxytocin on semen release response in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology, 59(9):