EFEITO DO CURTO PERÍODO DE ESTOCAGEM DOS OVÓCITOS E TEMPO DE ENXAGUE DA ÁGUA DE ATIVAÇÃO DOS GAMETAS NA REPRODUÇÃO DE DOURADO Salminus brasiliensis

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1 EFEITO DO CURTO PERÍODO DE ESTOCAGEM DOS OVÓCITOS E TEMPO DE ENXAGUE DA ÁGUA DE ATIVAÇÃO DOS GAMETAS NA REPRODUÇÃO DE DOURADO Salminus brasiliensis Marcos Weingartner* e Evoy Zaniboni Filho *Laboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce (LAPAD/CCA/UFSC), Rodovia SC 406, n 3532, Armação, Florianópolis, SC. marcos@lapad.ufsc.br Resumo Vários fatores têm afetado a qualidade dos gametas de peixes após a extrusão. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de um curto tempo de estocagem entre a extrusão dos ovócitos e a fertilização, bem como o tempo de enxágüe da água de ativação dos gametas sobre a taxa de fertilização de ovos de dourado Salminus brasiliensis. Para isso, ovócitos obtidos através de reprodução induzida foram fertilizados com diferentes tempos após a extrusão, sendo: 10, 25, 35 e 55 minutos (T1, T2, T3 e T4, respectivamente). Para avaliar o efeito do tempo de enxágüe, a água de ativação dos gametas foi mantida por 1, 2 e 3 minutos até o enxágüe e posterior acondicionamento dos ovos nas incubadoras. Todos os tratamentos foram realizados em triplicata e a taxa de fertilização foi medida sete horas após a fertilização, quando foi observado o fechamento do blastóporo a uma temperatura de 25,3 ºC. As taxas de fertilização revelaram uma relação inversa entre o aumento do tempo de estocagem e a taxa fertilização, com valores de 82,90±2,87%; 79,67±5,59%; 61,40±3,16% e 44,81±3,13% para T1, T2, T3 e T4, respectivamente. Contudo, a análise de variância seguida de teste Tukey mostrou não haver diferença significativa (P>0,05) nas taxas de fertilização entre T1 e T2. Houve uma diminuição na taxa de fertilização com o aumento do tempo para o enxágüe, com valores de 18,20±5,94%; 12,03±8,54% e 7,84±6,03% para 1, 2 e 3 minutos, respectivamente. Desta forma, dentro das condições do atual trabalho, é recomendada a estocagem dos ovócitos por um tempo máximo de 25 minutos após a extrusão, bem como, realizar o enxágüe da água utilizada para a ativação do sêmen depois de 1 minuto, a partir do qual são observados prejuízos na taxa de fertilização de ovos de dourado. Introdução Conhecer os processos que envolvem a ativação e fertilização dos gametas das espécies de peixes utilizados na piscicultura é extremamente importante para o sucesso reprodutivo destes peixes. O tempo envolvido entre a extrusão e a ativação dos gametas pode determinar o sucesso na fertilização, durante o processo de reprodução induzida (Yang & Chen, 2006), bem como, as condições em que ocorre a fertilização é determinante para a produção final e qualidade das larvas (Sawada et al., 2006). Para muitas das espécies amplamente cultivadas no mundo muito se conhece das exigências dos gametas pós-ovulação para obtenção de razoáveis taxas de fertilização (Rottmann; Shireman & Chapman, 1991). No entanto, para as espécies nativas brasileiras, faltam conhecimentos essenciais para o sucesso da reprodução em cativeiro destes peixes. Segundo Zaniboni-Filho (2000), um dos motivos que levaram a esta falta de conhecimento se deve ao fato de que o desenvolvimento da piscicultura brasileira ocorreu por meio do cultivo de espécies exóticas, sendo que, por muito tempo, as espécies nativas não foram consideradas para a piscicultura.

2 Desta forma, muitas das técnicas reprodutivas para os diversos peixes nativos ainda estão sendo descobertas, sendo que os principais pacotes tecnológicos voltados à reprodução dos peixes são os mesmos utilizados para espécies exóticas (Andrade & Yasui, 2003). Entre os peixes nativos que tem despertado interesse entre os piscicultores e centros de pesquisa, destaca-se o dourado, S. brasiliensis. O dourado é um caracídeo encontrado na bacia dos rios Paraná, Paraguai, Uruguai, São Francisco, além daquelas ligadas ao sistema lagunar da Lagoa dos Patos (Morais Filho & Schubart, 1955; Froese & Pauly, 2003). É a espécie que atinge o maior tamanho entre os representantes do gênero Salminus, podendo passar de um metro de comprimento (Morais Filho & Schubart, 1955). Segundo Vazzoler (1996), é uma espécie migradora de desova total anual, possui ovos semidensos e não apresenta cuidado parental. Por ser uma espécie de piracema, não reproduz naturalmente em cativeiro, necessitando de indução hormonal para a maturação final, ovulação e desova. De acordo com Weingartner & Zaniboni-Filho (2005), historicamente o dourado tem apresentado baixas taxas de fertilização durante o processo de reprodução induzida em diferentes laboratórios brasileiros. Estes autores acreditam que esta baixa taxa de fertilização deve estar associada ao uso de procedimentos inadequados, devido à utilização de técnicas desenvolvidas para as espécies exóticas. Desta forma, este trabalho tem como objetivo estudar alguns procedimentos relacionados à fertilização dos ovócitos de dourado, avaliando a viabilidade dos ovócitos estocados por curto período em condição ambiente e o efeito do tempo de manutenção da água de ativação dos gametas até o enxágüe. Material e Métodos Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce (LAPAD/UFSC), durante o período reprodutivo 2004/2005 e 2006/2007. Foram utilizados reprodutores de dourado do plantel mantido pelo LAPAD composto por exemplares selvagens capturados no alto rio Uruguai, bem como descendentes diretos (F1 - produto do cruzamento dos indivíduos selvagens). Para obter a maturação final e desova em laboratório foi seguido o protocolo de indução hormonal recomendado por Zaniboni-Filho & Barbosa (1996), sendo aplicadas três doses do hormônio de extrato de pituitária de carpa, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg e 5,0 mg/kg, com intervalos de 24 horas entre a primeira e segunda aplicação e 12 horas entre a segunda e terceira. A desova ocorreu 5 horas após a última aplicação a uma temperatura é de 25ºC, totalizando 125 horas-grau. Foram utilizados ovócitos provenientes de uma única fêmea para a realização de cada experimento. O trabalho consistiu na realização de dois experimentos, um avaliando a qualidade dos ovócitos submetidos a período variável de estocagem entre a extrusão e a fertilização; e o segundo buscou avaliar o efeito do tempo de manutenção da água de ativação dos gametas, antes do enxágüe. A água de ativação é aquela adicionada aos gametas ainda secos para desencadear o processo de hidratação dos ovócitos e motilidade do sêmen, técnica conhecida como fertilização a seco (Zaniboni-Filho e Weingartner, 2007). O enxágüe é realizado para retirada

3 do sêmen imediatamente após a fertilização, do contrário, pode haver o comprometimento da qualidade da água durante a incubação dos ovos. No primeiro experimento, os ovócitos foram estocados em temperatura ambiente por tempos de: 10, 25, 35 e 55 minutos entre a extrusão e a fertilização. Foi utilizado um tempo de enxágüe de 3 minutos após a adição da água. Para o segundo experimento os óvulos foram fertilizados 10 minutos após a extrusão com tempos de enxágüe variando de 1, 2 e 3 minutos após a adição da água, sendo posteriormente liberados nas incubadoras. Para ambos os experimentos, cada tratamento foi feito em triplicata. A fertilização foi feita em recipientes de 500 ml contendo 10 gramas de ovócitos cada. Foi utilizada uma relação de 4 ml sêmen por quilo de ovócito. O sêmen foi previamente misturado aos ovócitos antes da distribuição nos recipientes de 500 ml. Para ativação dos gametas foi utilizado um volume de 100 ml de água no experimento de estocagem e de 40 ml para o experimento de tempo para o enxágüe da água de ativação. Estas diferenças no volume de água de fertilização foram utilizadas para exacerbar o efeito dos tratamentos nos diferentes experimentos. Segundo Weingartner & Zaniboni-Filho (2006), os volumes utilizados em ambos os experimentos é adequado para proporcionar boa taxa de fertilização para o dourado, no entanto, 40 ml de água para 10 gramas de ovócitos é o limite mínimo recomendado. Para a incubação dos ovos, foram utilizadas incubadoras cilíndro-cônicas de 56 litros com fluxo contínuo de água no primeiro experimento, enquanto no segundo experimento foram utilizadas incubadoras cilíndro-cônicas com 18 litros de volume útil, sem renovação de água e com aeração constante para garantir a movimentação dos ovos. Durante os trabalhos de fertilização e incubação a água apresentou temperatura de 25,3 ºC e 6,70 mg de oxigênio dissolvido. Foi utilizada a taxa de fertilização para avaliar o efeito dos tratamentos sobre a qualidade dos ovos. A taxa de fertilização apresenta alta correlação com a qualidade dos ovócitos obtidos por reprodução induzida, e dessa forma, é recomendada para avaliar o efeito de experimentos como estes (Rizz et al., 2003; Formacion et al., 1993). A taxa de fertilização foi quantificada sete horas após a fertilização, quando era observada a fase de fechamento do blastóporo, através da amostragem de 260 ovos de cada incubadora, conforme Zaniboni-Filho (1992). Em ambos os experimentos, os dados foram submetidos à análise de regressão linear para avaliar o efeito dos tempos de estocagem e do enxágüe sobre as taxas de fertilização. Foi utilizado ANOVA para verificar a existência de diferença estatística significativa entre os tempos de cada experimento e o Teste-Tukey para separação de médias. Resultados e Discussão Em ambos os experimentos houve alteração nas taxas de fertilização em função dos tratamentos utilizados. A taxa de fertilização foi inversamente proporcional ao tempo de estocagem dos ovócitos (Figura 1). No entanto, não houve diferença na taxa de fertilização para os tempos de estocagem de 10 ou 25 minutos (P>0,05) com valores de 82,91±2,87% e 79,67±5,59, respectivamente. Entre 35 e 55 minutos de estocagem houve um decréscimo significativo (P<0,01), com valores de fertilização de 61,39±3,16% e 44,82±3,13%, respectivamente.

4 Fertilização (%) Taxa de fertilização (%) Para o tempo de enxágüe, foi observada uma queda nos valores da taxa de fertilização com o aumento de tempo de manutenção da água de ativação. Os valores caíram de 18,20±5,94% com enxágüe após 1 minuto da adição da água, para 12,03±8,54% e 7,84±6,03% de fertilização quando o tempo foi de 2 e 3 minutos, respectivamente (Figura 2). No presente trabalho foi observada uma redução na taxa de fertilização dos ovócitos estocados por curto período, com efeito significativo após 25 minutos da extrusão. Rizzo et al. (2003) avaliaram a taxa de fertilização e alterações estruturais de ovócitos de curimba Prochilodus marggravii estocados em condições ambiente por até 120 minutos após a extrusão, em intervalos de 30 minutos. Estes autores também observaram queda significativa da fertilização nos diferentes tempos e atribuíram este fato a uma alteração no citoesqueleto dos ovócitos, sendo que a estrutura da micrópila não foi alterada, permanecendo aberta durante a estocagem, justificando a capacidade de fertilização dos ovócitos a a y = -0,008x2-0,359x + 88,68 R² = 0, b c Tempo de estocagem (minutos) Figura 1. Valores médios (±DP) da taxa de fertilização de ovos de dourado (S. brasiliensis) submetidos a diferentes tempos de estocagem entre a extrusão e a fertilização y = -5,179x + 23,04 R² = 0, Tempo para o enxágüe (min) Figura 2. Valores médios (±DP) da taxa de fertilização de ovos de dourado submetidos a diferentes tempos de manutenção da água de ativação dos gametas até o enxágüe. No segundo experimento, a variação no tempo para a realização do enxágüe dos gametas também afetou a taxa de fertilização dos ovos de dourado. Uma das possíveis causas

5 desta redução pode esta associada a qualidade da água durante a ativação dos gametas. Weingartner & Zaniboni-Filho (2006) observaram um aumento na taxa de fertilização de ovócitos de dourado quando aumentaram o volume da água utilizada para a ativação dos gametas. Estes autores concluíram que este fato pode estar relacionado à qualidade de água durante a fertilização, onde a utilização de um pequeno volume de água provoca uma rápida degradação da qualidade da água, motivada pelo consumo do oxigênio dos gametas e pela oxidação do sêmen, que possui um pequeno tempo de vida após a ativação. O baixo tempo de vida do sêmen de peixes teleósteos após ativação também tem sido observado por vários outros autores (Coward et al., 2002; Vladic & Jarvi, 1997). O efeito da qualidade da água sobre a viabilidade de ovos foi observado por Sawada et al. (2006), que verificaram uma alta taxa de mortalidade dos ovos de Seriola dumerili submetidos na fase inicial de incubação a um curto período de hipóxia. De acordo com os resultados observados neste trabalho, a baixa taxa de fertilização observada nos ovos mantidos por tempo superior a 1 minuto antes do enxágüe pode estar relacionado não apenas ao tempo, mas a qualidade da água durante o período de ativação dos gametas. Desta forma, o incremento no volume de água de ativação dos gametas deve possibilitar a manutenção de boas taxas de fertilização mesmo quando o enxágüe é realizado em tempo superior a 1 minuto. Contudo, novos testes devem ser realizados para confirmar a relação entre tempo de enxágüe e volume de água de ativação na taxa de fertilização dos ovos de dourado. Conclusões Os ovócitos de dourado podem ser mantidos por até 25 minutos de estocagem após a extrusão sem prejuízo da taxa de fertilização. A água utilizada para a ativação dos gametas de dourado deve ser mantida por 1 minuto, quando deve ser drenada e os ovócitos enxaguados para a obtenção da máxima taxa de fertilização. Agradecimentos A Barra Grande Energética S.A, Tractebel Energia e CNPq pelo apoio financeiro. Referências ANDRADE, D. R.; YASUI, G. S. O manejo da reprodução natural e artificial e sua importância na produção de peixes no BrasiL. Rev. Bras. Reprod. Animal, Belo Horizonte, v.27, n.2, p , COWARD, K.; BROMAGE, N. R.; HIBBITT, O.; PARRINGTON, J. Gamete physiology, fertilization and egg activation in teleost fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries, Dordrecht, 12: 33 58, FORMACION, M. J.; HORI, R.; LAM, T.J. Overripening of ovulated eggs in goldfish. I. morphological changes. Aquaculture, Amsterdam, 68, 114:155, FROESE, R.; PAULY, D. (Eds.). FishBase. Disponível em: < Acesso em: 10 de junho de 2003.

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