DILUENTES NA CONGELAÇÃO SEMINAL DE Prochilodus brevis

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1 DILUENTES NA CONGELAÇÃO SEMINAL DE Prochilodus brevis Pinheiro, R.R.R. (1) ; Souza, M.E.M. (1) ; Lopes, J.T. (1) ; Pinheiro, J.P.S. (1) ; Nunes, L.T. (1) ; Torres, T.M. (1) ; Linhares, F.R.A. (1) ; Nunes, J.F. (1) ; Salmito-Vanderley, C.S.B. (1) (1) Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes, Universidade Estadual do Ceará - UECE, Fortaleza - CE, Brasil. RESUMO Prochilodus brevis, uma espécie endêmica da região semiárida, vem despertando interesse acerca da sua reprodução em cativeiro devido à pesca predatória e as dificuldades de sua produção em aquicultura. Assim, objetivou-se, avaliar o efeito de soluções diluidoras, sobre a cinética e morfologia do sêmen pós-descongelação de curimatã comum. Tiveram a reprodução induzida pelo Extrato Hipofisário de carpa, 20 machos adultos. Do sêmen coletado confeccionaram-se seis pools que foram congelados em ACP- 104 (T1) e solução de glicose a 5% (T2) acrescidas de 10% de metilglicol. As amostras foram descongeladas após 15 dias em banho-maria a 25 C.30s -1 e analisadas pelo SCA Sperm class analyser e fixadas para posterior análise morfológica. O sêmen diluído em T1 apresentou: percentual de espermatozoides móveis (86,1 ± 3,8%); taxa de normais (80,0 ± 4,3%); VCL (54,1 ± 8,1); VSL (29,9 ± 5,8); e VAP (45,5 ± 7,3); superior estatisticamente quando comparado ao sêmen diluído em T2 que apresentou: percentual de espermatozoides móveis (67,8 ± 2,7%); normais (54,0 ± 3,8%); VCL (31,6 ± 3,6); VSL (14,0 ± 4,1); e VAP (22,5 ± 4,4). Assim recomenda-se a utilização do diluidor ACP-104 acrescido de 10% de Metilglicol. Palavras-chave: Peixe, Espermatozoide, Diluente.

2 INTRODUÇÃO O curimatã comum (Prochilodus brevis, Steindachner 1875) é uma espécie de interesse econômico e ecológico, endêmica da região semiárida brasileira (GURGEL et al. 2012). A pesca predatória de P. brevis, principalmente no período que antecede a desova, quando as fêmeas se encontram maduras, e o barramento dos rios que impedem as migrações da espécie, põe em risco a sobrevivência da espécie (NASCIMENTO et al., 2012). Diante da dificuldade da sua reprodução em cativeiro, técnicas de reprodução artificial têm sido elaboradas, como por exemplo, a criopreservação de sêmen, na qual as amostras de sêmen são conservadas a baixas temperaturas para posterior utilização na piscicultura. No entanto, os processos de congelação e descongelação levam a uma redução do número de espermatozoides normais, além de reduzir a taxa de motilidade, dificultando a fertilização. Para minimizar os danos desse processo, são adicionados diluidores que devem proporcionar proteção aos espermatozoides contra as crioinjúrias (SALMITO-VANDERLEY, 2010). Desta forma é importante o conhecimento da composição deste meio de congelação, pois este é um fator determinante da qualidade seminal após a descongelação (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). A avaliação da motilidade e morfologia são essenciais na análise da qualidade do sêmen (MATOS et al., 2008).

3 A glicose é comumente utilizada como um agente crioprotetor externo para vários tipos de células (PURDY, 2006), mas também como um imobilizador não-iônico do sêmen de peixes de água doce, sendo o diluente mais utilizado para a criopreservação (HORVÁTH et al., 2003;. CRUZ-CASALLAS et al., 2006;. VIVEIROS et al., 2009). A água de coco em pó específica para peixe, ACP-104, é um diluente padronizado e estabilizado, que mantém as características físicoquímicas da água de coco in natura. Composta por sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras além de indutores da divisão celular e diversos eletrólitos (MELO et al., 2010). Este diluente vem apresentando bons resultados de viabilidade espermática e de fertilização pós-criopreservação seminal em Colossoma macropomum (tambaqui) (LEITE et al, 2013) e em Prochilodus lineatus (curimba) (VIVEIROS et al., 2010). Assim, a padronização de protocolos de criopreservação adequados aos parâmetros fisiológicos de cada espécie animal se faz necessária, com o intuito de minimizar os efeitos deletérios da criopreservação (SILVA e GUERRA, 2011). Dessa forma, este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do diluente ACP-104 quando comparado com o diluente padrão (glicose) acrescido de Metilglicol (MG) sobre a cinética e morfologia do sêmen pós-descongelação de Prochilodus brevis.

4 MATERIAL E MÉTODOS Para o estudo transportou-se 20 machos de curimatã comum, em idade reprodutiva, oriundos do Centro de Pesquisa em Aquicultura (CPAq) do Departamento Nacional de obras Contra as Secas (DNOCS) em Pentecoste-CE, localizado entre os S e W, a 90 Km de Fortaleza, que foram mantidos no Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes, localizado na Universidade Estadual do Ceará (Uece), Fortaleza, Ceará, Brasil. Sendo arraçoados duas vezes ao dia com ração contendo 28% de proteína bruta fornecida na base de 3% de biomassa. Tais animais tiveram a espermiação induzida pelo extrato hipofisário de carpa (três mg kg -1 peso vivo, via injeção intra-celomática) 18h antes da coleta de sêmen. No dia da coleta os animais foram sedados utilizandose uma solução à base de óleo de cravo (eugenol) sendo imediatamente submetidos à coleta de sêmen, após a sedação, e em seguida devolvidos ao tanque de manuseio. Para a coleta de sêmen os animais foram contidos em decúbito lateral, tiveram os olhos envoltos em pano úmido, para minimização do estresse e facilitação de sua contenção. O orifício genital foi enxuto com papel toalha e então realizada uma leve compressão abdominal no sentido anteroposterior. O sêmen foi coletado em tubos graduados de polietileno e mantido a aproximadamente 4 C em caixa de poliestireno. Somente as amostras válidas (sem contaminação com sangue, fezes e urina e motilidade superior a 85% após ativação com água do tanque) foram utilizadas para o experimento.

5 O sêmen de três animais foi utilizado para constituição de cada pool (n=6) que foram diluídos na proporção de 1:9 (sêmen: diluidor) em dois tratamentos (T1: ACP-104 mais 10% de MG e T2: solução de glicose 5% mais 10% de MG). O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 ml, mantido a 4 C por 10 min, submetido a vapor de nitrogênio líquido em Dry shipper (-170 C) por 15 min e transferido para um botijão criogênico (-196 C). As amostras foram descongeladas após 15 dias em banho-maria a 25º C 30s -1. Uma alíquota de cada amostra foi ativada com NaCl (50mM) na proporção 1:50 (sêmen: ativador) para mensurar objetivamente o percentual de espermatozoides móveis por meio do sistema computadorizado de análise (SCA). Outra alíquota foi diluída em solução de citrato de sódio formolizado a 4%, na proporção de 1:10 (sêmen: fixador) para análise das morfopatologias, sendo realizado o esfregaço pela deposição de 4 µl de solução de sêmen diluído em corante rosa bengala na proporção de 5:1 (sêmen: corante). Foram confeccionadas duas lâminas de cada amostra e observados 200 espermatozoides por meio de microscopia ótica com aumento de 400X. Foram observadas anomalias tais como: macrocefalia, microcefalia e defeitos na cauda (enrolada, dobrada, quebrada e corrugada). Os dados de motilidade foram expressos como media ± desvio padrão e submetidos à análise de variância, seguido pelo teste t student (p<0,001), os dados de morfologia foram expressos como média ±

6 desvio padrão submetidos à análise de variância seguido pelo teste de Tukey (p<0,05) utilizando o programa estatístico ASSISTAT versão 7.6 beta (2013). RESULTADOS E DISCUSSÃO A média de volume seminal encontrada foi de 1,61 ± 0,57 ml com concentração espermática de 12, ± 4,11 sptz. ml -1, osmolaridade de 267 ± 13,11 mosm. Kg -1 e ph de 8,5 ± 0,3 corroborando os dados encontrados por Pinheiro, et al. (2013). As características seminais somente podem ser preservadas em temperaturas criogênicas se, antes do início da congelação, o sêmen for diluído em criosolucões (diluidores) adequados, que têm por função essencial manter os espermatozoides imobilizados para que durante a congelação e a descongelação, as trocas osmóticas celulares possam ser restabelecidas de modo continuo, corrigindo o desequilíbrio iônico, que acompanha as mudanças bruscas de temperatura, favorecendo assim a sobrevivência e viabilidade dos espermatozoides. Dessa maneira, sabe-se que não somente o diluidor como outros fatores podem influenciar a motilidade dos espermatozoides de peixes. Fatores como a solução ativadora, sua osmolaridade (ALAVI et al., 2009) e temperatura (BILLARD et al., 1995), estado nutricional e sanitário dos animais, condições de análise e espécie estudada (MURGAS et al., 2011).

7 Da mesma forma, a presença de anormalidades espermáticas pode estar relacionada com a deficiência nutricional, idade dos reprodutores, variações ambientais e genéticas (MILIORINI, 2006) como por falhas durante a espermatogênese. Essas anormalidades observadas no sêmen também podem ser devido à manipulação, à fixação com solução formolizada, técnica de esfregaço ou influência do corante (SOUZA et al., 2012). Contudo, no presente estudo não houve diferença significativa do percentual de espermatozoides móveis (93,6 %) e normais (94,4 %) no sêmen fresco quando comparado ao sêmen tratado com ACP-104 que teve 86,16 % e 80,0 % de espermatozoides móveis e normais, respectivamente. No entanto, no sêmen tratado com glicose foi observada uma redução significativa do percentual de móveis (67,8 %) e de normais (54,0 %) quando comparado com o sêmen tratado com ACP-104 sendo essa redução significativa mais acentuada quando comparada ao sêmen fresco. Conforme detalhado na Tabela 1. Segundo Viveiros et al. (2010) o conhecimento dos parâmetros de velocidade espermática é de grande importância uma vez que há uma forte correlação entre as taxas de fertilização e as velocidades espermáticas, sendo a velocidade curvilinear (VCL) a que possui maior correlação.

8 Resumos Expandidos do I CONICBIO / II CONABIO / VI SIMCBIO (v.2) Universidade Católica de Pernambuco - Recife - PE - Brasil - 11 a 14 de novembro de 2013 Tabela 1. Taxa de espermatozoides móveis e morfologicamente normais no sêmen fresco e pós-descongelação de Prochilodus brevis em diferentes soluções diluidoras. Pool Espermatozoides móveis (%) Normais (%) Sêmen Fresco Tratamentos Sêmen Tratamentos Fresco ACP + MG Glicose + MG ACP + MG Glicose + MG I 92,3 87,3 64,9 95,5 82,0 57,0 II 93,5 84,4 66,4 96,0 83,0 60,0 III 91, ,3 97,0 86,0 51,0 IV 98,0 89,9 68,9 91,0 78,0 54,0 V 96,3 84,2 71,1 93,0 75,0 52,0 VI 89,8 82,8 70,6 94,0 76,0 50,0 Média ± DP 93,6 ± 86,1 ± 3,8 a 67,8 ± 2,7 b 94,4 ± 80,0 ± 4,3 a 54,0 ± 3,8 b 3,1 a 2,2 a Letras minúsculas distintas, na mesma linha, indicam diferença significativa (p<0,001) entre os tratamentos. Tabela 2. Velocidade curvilinear (VCL), velocidade linear progressiva (VSL) e velocidade média da trajetória (VAP) do sêmen fresco e pós-descongelação de Prochilodus brevis em ACP-104 e solução de glicose acrescido de metilglicol. VCL (µm. s -1 ) VSL (µm. s -1 ) VAP (µm. s -1 ) Sêmen fresco 148,6 ± 5,4 a 72,9 ± 4,5 a 123,7 ± 5,3 a ACP ,1 ± 8,2 b 30,0 ± 5,8 b 45,5 ± 7,4 b Glicose 31,6 ± 3,6 c 14,0 ± 4,1 c 22,6 ± 4,4 c Letras minúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa (p<0,001) entre os tratamentos. Foi percebido um decréscimo acentuado das velocidades no sêmen tratado com glicose quando comparado ao sêmen tratado com ACP- 8

9 Resumos Expandidos do I CONICBIO / II CONABIO / VI SIMCBIO (v.2) Universidade Católica de Pernambuco - Recife - PE - Brasil - 11 a 14 de novembro de , que obteve velocidade semelhante ao encontrado em Prochilodus lineatus e que conferiu bons resultados de fertilização, Tabela 2. CONCLUSÃO No presente estudo, o diluidor ACP-104 acrescido de 10% de Metilglicol mostrou-se mais adequado para a congelação dos espermatozoides de Prochilodus brevis, uma vez que obteve resultados superiores de cinética e morfologia quando comparado ao sêmen congelado com o diluidor padrão. REFERÊNCIAS ALAVI, S.M.H.; RODINA M.; VIVEIROS A.T.M.; COSSON J.; GELA D.; BORYSHPOLETS S.; LINHART O. Effects of osmolality on sperm morphology, motility and flagellar wave parameters in Northern pike (Esox lucius L.). Theriogenology, v. 72, p , BILLARD, R.; COSSON J.; PERCHEC G.; LINHART O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture, v. 129, p , CRUZ-CASALLAS P.E.; VELASCO-SANTAMARÍA Y.M. Determinación de las características seminales y seminación artificial en peces. In: Daza PV, Landines PMA, Sanabria OAI (Ed.). Reproducción de peces en el trópico. Bogotá, DC: Imprenta Nacional de Colombia. pp GURGEL, L.L.; VERANI, J.R.; CHELLAPPA, S. Reproductive ecology of Prochilodus brevis an endemic fish from the semiarid region of Brazil. The Scientific World Journal (Ecology Domain), p. 1-7,

10 Resumos Expandidos do I CONICBIO / II CONABIO / VI SIMCBIO (v.2) Universidade Católica de Pernambuco - Recife - PE - Brasil - 11 a 14 de novembro de 2013 HORVÁTH, A.; MISKOLCZI, E.; URBÁNYI, B. Cryopreservation of common carp sperm. Aquat Living Resour, 16: LEITE, L.V.; MELO, M.A.P.; OLIVEIRA, F.C.E.; PINHEIRO, J.P.S.; CAMPELLO, C.C.; NUNES, J.F.; SALMITO-VANDERLEY, C.S.B. Determinação da dose inseminante e embriogênese na fertilização artificial de tambaqui (Colossoma macropomum). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.65, n.2, p , MATOS, D.L.; ARAÚJO, A.A.; ROBERTO, I.G.; TONIOLLI, R. Análise computarizada de espermatozoides: Revisão de literatura. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.32, n.4, p , MELO, M.A.P.; MACIEL, F.S.; OLIVEIRA, F.C.E.; SALGUEIRO, C.C.M.; SALMITO-VANDERLEY, C.S.B.; NUNES, J.F. Água de coco em pó (ACP-104 ) na criopreservação de sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus) In: SEMINÁRIO NORDESTINO DE PECUÁRIA (PECNORDESTE), Anais... Fortaleza, MILIORINI, A.B. Ativadores e concentrações de metanol e dimetilsufoxido na qualidade do sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus) f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) Universidade Federal de Lavras, Lavras, MURGAS, L.D.S.; FELIZARDO, V.O.; FERREIRA, M.R.; ANDRADE, E.S.; VERAS, G.C. Importância da avaliação dos parâmetros reprodutivos em peixes nativos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.35, n.2, p , NASCIMENTO, M.M.; NASCIMENTO, W.S.; CHELLAPPA, N.T.; CHELLAPPA, S. Biologia reprodutiva do curimatã comum, Prochilodus brevis (Characiformes: Prochilodontidae) no açude Marechal Dutra, Rio Grande do Norte, Brasil. Biota Amazônia, v. 2, n. 2, p , PINHEIRO, R.R.R.; CAJADO, F.J.L.; PINHEIRO, J.P.S.; NUNES, L.T.; LOPES, J.T.; MELO-MACIEL, M.A.P.; SALMITO-VANDERLEY, C.S.B. Avaliação das características do sêmen fresco de curimatã comum (Prochilodus brevis) In: XX CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, Anais... Uberlândia,

11 Resumos Expandidos do I CONICBIO / II CONABIO / VI SIMCBIO (v.2) Universidade Católica de Pernambuco - Recife - PE - Brasil - 11 a 14 de novembro de 2013 PURDY, P.H. A review on goat sperm cryopreservation. Small Ruminant Research, v. 63 p , SALMITO-VANDERLEY, C.S.B. Biotecnologias da reprodução em peixes de água doce. In: V CONGRESSO NORTE NORDESTE DE REPRODUÇÃO ANIMAL, Palestra... Patos-PB, 2010 SALMITO-VANDERLEY, C.S.B.; VIEIRA, M.J.A.F.; LEITE, L.V.; OLIVEIRA, F.C.E.; LINHARES, F.R.A.; SALGUEIRO, C.C.M.; NUNES, J.F. Meios de congelação para conservação de sêmen de peixes da família Characidae. Ciência Animal, v. 22, p , SILVA, S.V.; GUERRA, M.M.P. Efeitos da criopreservação sobre as células espermáticas e alternativas para redução das crioinjúrias. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.35, n.4, p , SOUZA, M.E.M.; OLIVEIRA, F.C.E.; OLIVEIRA, M.S.; PINHEIRO, J.P.S.; LEITE, J.S.; SALMITO-VANDERLEY, C.S.B. Avaliação de três diferentes corantes na detecção de anormalidades de cauda em espermatozoides de tambaqui (Colossoma macropomum). Ciência Animal, v. 22, p , VIVEIROS, A.T.M.; ORFÃO, L.H.; MARIA, A.N.; ALLAMAN, I.B. A simple, inexpensive and successful freezing method for curimba Prochilodus lineatus (Characiformes) semen. Animal Reproducion Science, v.112, p VIVEIROS, A.T.M.; NASCIMENTO, A.F.; ORFÃO, L.H.; ISAÚ, Z.A. Motility and fertility of the subtropical freshwater fish streaked prochilod (Prochilodus lineatus) sperm cryopreserved in powdered coconut water. Theriogenology, v.74, p ,

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