AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES CRIOPROTETORAS NO CONGELAMENTO DE SÊMEN DE PIRACANJUBA Brycon orbignyanus

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1 AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES CRIOPROTETORAS NO CONGELAMENTO DE SÊMEN DE PIRACANJUBA Brycon orbignyanus Viviane O. Felizardo*, Mariana M. Drumond, Luis D. S. Murgas, Márcio G. Zangeronimo, Juliana M. de A. Silva, Gilmara, J. M. Pereira e Aline F. S. Carvalho *Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG viviofbio@yahoo.com.br Resumo A Piracanjuba (Brycon orbignyanus) é uma espécie de peixe de piracema ameaçada de extinção da bacia do Rio Grande. Estudos aprimorando a técnica da criopreservação do sêmen podem contribuir para otimizar o processo reprodutivo desta espécie. O trabalho foi realizado na Estação de Piscicultura da CEMIG em Itutinga e no DMV-UFLA, com objetivo de avaliar os efeitos sobre as características seminais pré e pós-congelamento de Piracanjuba, utilizando diferentes soluções crioprotetoras. Cinco machos do plantel de reprodutores da CEMIG foram induzidos à espermiação, utilizando extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC). As amostras de sêmen coletadas de cada animal foram diluídas em quatro soluções crioprotetoras diferentes, na proporção de 1:4, acondicionadas em palhetas de 0,5 ml e colocadas em botijão de nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas por imersão em banho-maria a 60º C, durante 5 segundos. A taxa de motilidade do sêmen pré e pós-congelamento apresentou uma média de 89,7% e 19%, respectivamente. Não Houve diferença significativa (P>0,05) na motilidade do sêmen pós-descongelamento entre os diluidores testados. O sêmen de Piracanjuba pode ser congelado com soluções contendo DMSO e Metanol como crioprotetores internos e gema de ovo e lactose como crioprotetores externos. Introdução A piracanjuba (Brycon orbignyanus) é uma espécie reofílica encontrada principalmente nos rios Grande e Paraná (Castagnolli, 1992). O macho se reproduz a partir de dois anos de idade, com 20 cm de comprimento, já a fêmea se reproduz a partir do terceiro ano de idade, com 25 cm de comprimento. Esta espécie está desaparecendo de seu habitat natural devido ao desmatamento das margens e assoreamento dos rios, que restringem suas fontes de alimento, como frutas e sementes, e prejudicam a sobrevivência dessa espécie que é muito exigente em oxigênio dissolvido na água. Há também um grande interesse comercial, contribuindo para a pesca predatória desta espécie e conseqüentemente a redução dos estoques naturais. O desenvolvimento de técnicas de reprodução induzida tem como objetivo a obtenção de maior número de alevinos para posterior recuperação da população natural e a conservação em locais de risco para a sua sobrevivência. Além disso, a rotina de reprodução artificial com sêmen fresco ou congelado revela a possibilidade de limitar o estoque de machos na piscicultura intensiva, propiciando a exploração mais racional de reprodutores geneticamente selecionados e redução nos custos de produção (Silveira et al., 1988). A criopreservação é uma técnica que envolve procedimentos que permitem o armazenamento de espermatozóides de peixes em nitrogênio líquido, mantendo-se a viabilidade dos gametas por tempo indefinido (Mins et al., 2000).

2 Com relação ao uso de soluções diluidoras, a incorporação destas é fundamental para proporcionar meio osmótico e nutricional adequado aos espermatozóides durante a aplicação desta biotecnologia. Estes diluidores consistem de soluções de sais ou de carboidratos, que ajudam a manter a viabilidade das células durante a refrigeração. Um bom diluidor deve ser isotônico, não ativar a motilidade espermática, que geralmente é ativado quando em contato com água, deve ser estável ao longo do armazenamento, estéril e também carreador de crioprotetores (Maria et al., 2006). O diluidor BTS (Beltsville Thawing Solution), normalmente é utilizado para o resfriamento do sêmen suíno, tem obtido bons resultados no resfriamento do sêmen de peixes como o pacu Piaractus mesopotamicus (Miliorini et al., 2002), a curimba Prochilodus scrofa (Franciscatto et al., 2002) e a própria piracanjuba Brycon orbignyanus (Murgas et al., 2004). Juntamente com o diluidor é necessário o uso de um crioprotetor, para que haja uma proteção do espermatozóide durante o congelamento e o descongelamento (Squires et al., 1999), estes crioprotetores devem possuir como propriedades uma baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água. Os crioprotetores podem ser classificados como intracelulares ou permeáveis e extracelulares ou impermeáveis. O crioprotetor intracelular é uma substância química que retira a água da célula durante o processo de congelamento do sêmen, interferindo também na formação de cristais de gelo por outras formas desconhecidas. Entre os crioprotetores intracelulares mais utilizados podem ser citados dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, metanol e etilenoglicol. Os crioprotetores extracelulares funcionam de forma diferente; ao invés de entrarem na célula, eles recobrem a superfície celular e estabilizam a membrana, ajudando, portanto, a minimizar e reparar os possíveis danos celulares causados pelo processo de congelamento. A gema de ovo e o leite em pó desnatado são crioprotetores extracelulares mais comuns (Carolsfeld & Harvey, 1999). Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de diferentes soluções crioprotetoras sobre as características seminais pré e pós-congelamento de Piracanjuba. Material e Métodos O experimento foi realizado na Estação de Piscicultura da CEMIG em Itutinga, durante o período de piracema nos meses de dezembro a janeiro de 2006/2007. Foram utilizados reprodutores oriundos do plantel da estação da CEMIG e a avaliação da motilidade e sua duração foi realizada no laboratório de Fisiologia e Farmacologia do DMV/UFLA. Foram selecionados cinco machos de Piracanjuba, aptos à reprodução, que foram individualmente pesados, marcados e colocados em aquários de 1000 L, dotados de aeração e com troca constante de água. Os reprodutores foram submetidos ao tratamento hormonal para indução da espermiação, aplicando-se uma dose única de 5 mg de extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC). A coleta do sêmen foi feita a seco, mediante massagem na região ventral do animal sentido antero posterior. Amostras de sêmen de cada animal foram diluídas em quatro soluções crioprotetoras diferentes (Tabela 1), na proporção de 1:4 (sêmen:solução crioprotetora). O sêmen in natura sem acréscimo de diluente foi considerado como controle, que foi posteriormente avaliado quanto à sua motilidade e o tempo de duração, sendo

3 previamente ativados com solução salina a 0,9% e observado ao microscópio óptico e cronometrado o tempo até a motilidade atingir cerca de 10%, antes de serem congelados. Tabela 1. Composição dos diluidores utilizados na criopreservação. Substâncias Diluentes % D1 D2 D3 D4 DMSO 8 8 Gema de ovo 5 5 Lactose 5 5 Metanol 8 8 BTS D1. diluidor 1; D2. diluidor 2; D3. diluidor 3 e D4. diluidor 4. O sêmen diluído foi acondicionado em palhetas de 0,5 ml que foram colocadas em botijão de vapor de nitrogênio líquido para resfriamento. Após 24 horas as amostras foram transferidas para o botijão de nitrogênio líquido para congelamento. O descongelamento foi feito por imersão em banho-maria a 60º C, durante 5 segundos (Murgas et al., 2004). O sêmen diluído e descongelado foi avaliado utilizando o mesmo processo que foi utilizado para avaliação do sêmen pré-congelamento. Para motilidade espermática antes do congelamento, os dados foram submetidos à análise de variância, utilizando um delineamento em blocos ao acaso com quatro tratamentos e cinco repetições, sendo a parcela experimental representada por um animal. As demais variáveis foram submetidas à análise estatística não paramétrica, uma vez que não atingiram a normalidade dos dados mesmo após transformação dos mesmos. Neste caso, as médias foram comparadas pelo teste de Kruskal-Wallis a 5% quando houve significância ao teste quiquadrado (P<0,05). Todas as análises foram realizadas utilizando-se o Sistema de Análise Estatística e Genética da Universidade Federal de Viçosa (SAEG, 1993). Resultados e Discussão Os valores médios das características seminais pré e pós-congelamento de Piracanjuba estão apresentados na Tabela 2. A taxa de motilidade do sêmen in natura diluído variou de 82,5 a 95%, em outro experimento Maria et al. (2006), obtiveram taxa de motilidade para a mesma espécie acima de 87%, quando avaliaram imediatamente após a diluição e obtiveram uma taxa variando de 0 a 17% ao avaliar a motilidade do sêmen após 48 horas em todas as amostras de sêmen diluído ou não, verificou ainda que a adição de gema de ovo diminuiu a motilidade espermática. Murgas et al. (2004), trabalhando também com piracanjuba obtiveram uma taxa de motilidade de 90 a 100%. Não Houve diferença significativa (P<0,05) na motilidade do sêmen pósdescongelamento entre os diluidores testados. Murgas et al. (2004), não encontrou diferença

4 significativa dos diluidores testados em relação à motilidade espermática do sêmen resfriado de piracanjuba dentro dos tempos considerados. A taxa de motilidade do sêmen pré-congelado diluído não diferiu da taxa de motilidade do sêmen in natura sem acréscimo de diluidor. Tabela 2. Características seminais pré e pós-congelamento de Piracanjuba Soluções crioprotetoras DMSO8% Ovo 5% Metanol 8% Ovo 5% DMSO8% Lactose 5% Metanol8% Lactose 5% Motilidade (%) Pré-congelamento Motilidade (%) Pósdescongelamento Duração (seg.) Pré-congelamento Duração (seg.) Pósdescongelamento 88,8 a 37,5 b* 38,3 B 179,5 Ab* 92,5 a 7,5 b* 46,3 B 31,5 B* 95 a 13,8 b* 62,5 A 50,8 B 82,5 a 12,5 b* 89,3 A 60,0 B Sêmen in natura 98,0 97,2 P = 0,0001 0,0109 * Diferem do sêmen in natura pelo teste de Kruskal-Wallis (P<0,05). 1 Médias seguidas de letras minúsculas na linha e maiúsculas na coluna diferem pelo teste de Kruskal-Wallis (P<0,05). A taxa de motilidade do sêmen descongelado obteve uma média de 19%, essa média foi reduzida em relação ao sêmen diluído fresco, fato relatado por Martinez e Ekwall (1998), que afirmam que os processos de congelamento e descongelamento provocam uma grande mortalidade dos espermatozóides, além de danificarem as estruturas celulares (membrana celular, peça intermediária e flagelo), podendo incapacitá-los para a fertilização. Murgas et al. (1998), encontraram para a mesma espécie uma taxa de 60% de motilidade do sêmen criopreservado, usando o diluidor água de côco. Menezes et al. (2007), avaliando o sêmen in natura e pós-descongelamento de tambaqui (Colossoma macropomum), obtiveram uma motilidade de 80% in natura e uma taxa máxima de 25% para o sêmen pós-descongelamento. O tempo de duração da motilidade do sêmen de piracanjuba variou de 74 a 105 segundos para o sêmen diluído fresco e de 63 a 103 para o sêmen diluído descongelado, Murgas et al. (2004), trabalhando com a mesma espécie obtiveram uma oscilação da duração da motilidade de 36 a 113 segundos do sêmen in natura. Murgas et al. (1998), obtiveram duração média de 125 s para a motilidade do semen de piracanjuba, após o congelamento com o diluidor água de côco. No curimbatá (Prochilodus lineatus), Cruz (2001) verificou taxa e duração para a motilidade espermática do sêmen fresco de 90% e variando de 86, 50 a 111,4 segundos para o sêmen descongelado respectivamente. Miliorini (2006) constatou que o congelamento pouco afetou a duração da motilidade espermática.

5 A duração da motilidade do sêmen pré-congelamento nos tratamentos que utilizou gema de ovo como crioprotetor externo se mostrou médias superiores significativa (P<0,05), quando comparados aos tratamentos que utilizou lactose como crioprotetor externo. Nos dados do sêmen pós-descongelamento a média do tratamento que utilizou 8% de DMSO e 5% de ovo se mostrou superior aos demais tratamentos. A duração do tempo de motilidade do sêmen pós-descongelamento dos tratamentos que utilizou lactose como crioprotetor externo se diferiram do sêmen in natura. O tratamento que utilizou 8% de DMSO e 5% de ovo apresentou média significativa (P<0,05) superior ao do sêmen in natura, enquanto que o tratamento que utilizou 8% de Metanol e 5% de ovo apresentou média inferior ao do sêmen in natura. Cruz (2001), estimou valores de 70% e 62% de motilidade para o sêmen descongelado de curimba (Prochilodus lineatus) diluído em meio contendo DMSO em concentrações de 5% e 10%, respectivamente. A associação de DMSO 10%, glicose 5% e gema de ovo 10% tem sido utilizada com sucesso na criopreservação do sêmen de curimba (Kavamoto et al., 1989 e Silva, 2000). A taxa de diluição de 1:4 sêmen/diluidor utilizada neste trabalho, foi utilizada por Carolsfeld et al. (2003) em trabalhos de criopreservação de sêmen envolvendo espécies de peixes brasileiros, incluindo piracanjuba, com sucesso nos resultados. Neste mesmo trabalho a combinação de DMSO e gema de ovo, seguida por metanol e lactose, foi efetivamente utilizado como diluidor para o congelamento de sêmen. Conclusões O sêmen de Piracanjuba pode ser congelado com soluções contendo DMSO e Metanol como crioprotetores internos e gema de ovo e lactose como crioprotetores externos. Agradecimentos À Estação de Piscicultura da CEMIG-Itutinga, à CAPES e à Fundação O BOTICARIO de Proteção à Natureza, pelo apoio financeiro para realização deste trabalho. Referências CAROLSFELD, J.; GODINHO, H. G.; ZANIBONI FILHO, E.; HARVEY, B. J. Cryopreservation of sperm in Brazilian migratory fish conservation. Journal Fish biology, Oxford, v. 63, n. 2, p , Aug CAROLSFELD, J.; HARVEY, B. J. Conservação de recursos genéticos em peixes: teoria e prática. Curso de treinamento brasileiro. Tradução H. P. Godinho. Victoria, Canada: World fisheries Trust, p. 47. Datilografado. CASTAGNOLLI, N. Piscicultura de água doce. Jaboticabal: FINEP, 189p, 1992 CRUZ. V.L.B. Criopreservação de sêmen de curimbatá (Prochilodus lineatus) p. Dissertação (Mestrado em Zoologia de Vertebrados) Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Belo Horizonte.

6 FRANCISCATTO, R. T.; MURGAS, L. D. S.; MILIORINI, A. B. et al. Qualidade do sêmen de curimba (Prochilodus lineatus) e taxa de fertilidade após resfriamento a 4 C. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Viçosa, v.26, n.3, p , KAVAMOTO, E. T.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; GODINHO, H. M.; ROMAGOSA, E. Fertilização em Prochilodus scrofa, Steinndacher, 1882, com sêmen criopreservado em nitrogênio líquido. In: CONGRESSO PAULISTA DE MEDICINA VETERINÁRIA, 1.; CONFERÊNCIA ANUAL DA SPMV, 44., 1989, São Paulo. Resumo... São Paulo: SPMV, p. 83. MARIA, A.N.;VIVEIROS, A.T.M.; FREITAS, R.T.F.; OLIVEIRA, A.V. Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba (Brycon orbignyanus) semen, an endangered Brazilian teleost fish. Aquaculture, v. 260, p MARTINEZ, H. R. AND EKWALL, H. (1998), Electron microscopy in the assesment of cryopreserved spermatozoa viability. The Americas Microscopy and Analysis, May. pp MENEZES, J.T.B.; MENEZES JR., J.B.; DORIA, C.R.C.; DE QUEIROZ, L.J. Avaliação espermática pós-descongelamento em tabaqui, Colossoma macropomum (CUVIER, 1818). In: XVII ENCONTRO BRASILEIRO DE ICTIOLOGIA-EBI, 2007, Itajai. Anais...Itajai, p.423. MILIORINI, A.B. Ativadores e concentrações de metanol e dimetilsulfóxido na qualidade do sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus) p. Dissertação (mestrado em Ciências Veterinárias) - Universidade Federal de Lavras, Lavras MILIORINI, A. B.; MURGAS, L. D. S.; VIVEIROS; A. T. M. et al. Resfriamento do sêmen de pacu (Piaractus mesopotamicus) a 4 C, utilizando diferentes concentrações de dimetilsulfóxido. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Viçosa, v.26, n.3, p , MINS, S.D.; TSVETKOVA, L.I.; BROWN, G.G. et al. Cryopreservation of sperm of sturgeon and paddlefish. In: TIERSCH, T.R.; MAZIK, P.M. (Eds). Cryopreservation in aquatic species. Baton Rouge: World Aquaculture Society, p MURGAS, L.D.S.; GUALHANONE, A.; SILVA M.O.B. et al. Calidad seminal del pez piracanjuba (Brycon orbignyanus) post-descongelación. Anales de Veterinária de Murcia, Espanha, v.17, p MURGAS, L. D. S.; MILIORINI, A.B.; FRANCISCATTO, R.T.; MARIA, A. N. viabilidade espermática do sêmen de piracanjuba (Brycon orbignyanus) resfriado a 4º C. Revista Brasileira de Zootenia, v. 33, n. 6, p , SAEG. Sistemas para análises estatísticas. versão 5.0. Viçosa: Fundação Arthur Bernardes, SILVA, E. B. Avaliação comparativa da utilização do sêmen criopreservado e fresco na fertilização dos óvulos de curimatá Prochilodus lineatus Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.

7 SILVEIRA F. DA, W.; KAVAMOTO, E.T.; RIGOLINO, M.G. et al. Fertilidade do sêmen de truta arco-íris, Salmo irideus gibbons, em diferentes concentrações de espermatozóides por óvulo. Boletim do Instituto de Pesca, v.15, n.1, p.51-54, 1988 SQUIRES, E. L.; PICKETT, B. W.; GRAHAM, J. K.; VANDERWALL, D. K.; MCCUE, P. M.; BRUEMMER, J. E. Principles of criopreservation. In: Cooled and frozen Stallion Semen, Cap. 9.