UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 0 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS LARISSA TEIXEIRA NUNES AVALIAÇÃO DE SOLUÇÕES DILUIDORAS E TAXAS DE DESCONGELAÇÃO NO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE Prochilodus brevis FORTALEZA-CE 2015

2 1 LARISSA TEIXEIRA NUNES AVALIAÇÃO DE SOLUÇÕES DILUIDORAS E TAXAS DE DESCONGELAÇÃO NO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE Prochilodus brevis Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e sanidade animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientadora: Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley FORTALEZA 2015

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5 4 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter fortalecido meus ombros ao invés de diminuir a carga, assim pude progredir cada dia com fé, esforço e determinação. Dele tirei força, coragem e entusiasmo para realizar e concluir mais esta etapa em minha vida. Aos meus pais, Fernando Antônio Teixeira Nunes e Joana Célia Teixeira, pelo incentivo, amor, apoio, ensinamentos e cuidado prestados a mim. Por terem me educado, mostrando os valores da honestidade e do respeito, a eles dedico minha admiração e amor. Aos meus irmãos Anderson e Caio Levi Teixeira Nunes, pelos ótimos momentos de diversão e aprendizado, com eles comecei a perceber o quanto é importante respeitar as diferenças do próximo, tornando a convivência mais agradável. Ao meu marido, Paulo Roberto Braga de Castro, pelo carinho, companheirismo, compreensão e apoio, ajudando em todos os momentos, principalmente nos mais difíceis, inclusive na decisão de continuar a carreira acadêmica. À minha orientadora, Profa. Dra. Sandra Salmito-Vanderley, exemplo de determinação e perseverança, agradeço por me aceitar como orientanda desde a graduação, exercendo seu papel com dedicação e paciência, agradeço pelos conselhos, atenção e cuidado. Aos colegas de pós-graduação mestrandos, doutorandos e egressos, Francisco Renan Aragão Linhares, João Paulo Silva Pinheiro, Jordana Sampaio Leite, Júlia Trugilio Lopes, Liliane Veras Leite Castro, Mayara Setúbal Oliveira, Mônica Aline Parente Melo Maciel e Priscila Silva de Almeida Monteiro, pela parceria, ajuda e alegria da convivência diária, tornando os dias no laboratório mais leves e produtivos. Aos atuais e ex-alunos de iniciação científica do LBRP, Cibele Castro Monteiro, Eric Silva Antério, Filipe Oliveira Ferreira, Jéssica de Sousa Castelo Branco, Karen Emanuelly Pinheiro Gomes, Maria Eduarda Magalhães de Souza, Renata Vieira do Nascimento, Romulo Roberto Ribeiro Pinheiro, Thais Maia Torres, Thaís Nery de Castro, Vanessa Alves Pereira, Yasmim Maia Ferreira, e mais recentemente, Deborah Queiroz, Edna Raquel Paiva Teodozia e Vanessa Sayonara de Farias Monteiro, pela presteza, disponibilidade, aprendizado mútuo e momentos de descontração, todos contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho. Aos integrantes do Núcleo Integrado de Biotecnologia, em especial dona Iraci e Henna Roberta Quinto, pelos bons momentos compartilhados. Aos colegas da turma de mestrado, pela troca de experiências e conhecimento. Em sua companhia, foi mais fácil lidar com os momentos de tensão e ansiedade nas disciplinas.

6 5 Ao Prof. Dr. Cláudio Cabral Campello, apesar de seu tão limitado e valioso tempo, aceitou realizar a estatística dos dados experimentais. Aos funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), pelo apoio, conhecimentos e experiências fornecidos ao longo destes dois anos, que muito acrescentaram. À Universidade Estadual do Ceará, onde iniciei a vida acadêmica, explorei um novo mundo, vivi experiências incríveis e conheci pessoas maravilhosas. À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), por ter concedido a bolsa de mestrado. À Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), pelo suporte financeiro fornecido ao LBRP, possibilitando a realização dos experimentos. A todos, minha imensa gratidão!

7 6 RESUMO A curimatã comum é um peixe reofílico, importante componente do ecossistema fluvial e apreciado na culinária nordestina. No entanto, ações antrópicas têm ameaçado sua sobrevivência. Desta forma, surge nos pesquisadores, o interesse no desenvolvimento de protocolos de conservação do material genético, como a criopreservação seminal. Logo, a determinação do meio de congelação e da taxa de descongelação adequados, são passos fundamentais que possibilitarão a utilização dessa biotecnologia na produção de curimatã comum, reduzindo os riscos à sua sobrevivência. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de diferentes soluções diluidoras e taxas de descongelação sobre a qualidade do sêmen criopreservado de P. brevis. Para isso, 18 horas antes da coleta de sêmen, os machos receberam dose única de extrato hipofisário de carpa. Cada animal foi sedado com solução à base de eugenol e o sêmen foi coletado. As amostras foram diluídas em quatro meios de congelação (5% Glicose + Metilglicol 10%; 5% Glicose + Dimetilsulfóxido 10%; 0,9% NaCl + Metilglicol 10%; 0,9% NaCl + Dimetilsulfóxido 10%) envasadas em palhetas de 0,25 ml e congeladas em vapor de nitrogênio líquido. O sêmen foi descongelado após sete dias em três taxas de descongelação: 25 C 30 s -1 ; 30 C 16 s -1 ; 40 C 12 s -1. Foram feitas as análises de motilidade, vitalidade e morfologia com auxílio de sistema automatizado de análise seminal (CASA). As características do sêmen in natura assemelharam-se, em sua maioria, às encontradas na literatura. Para o sêmen criopreservado, os maiores resultados de motilidade total e velocidade curvilinear (VCL) foram obtidos utilizando Glicose e DMSO, independente da taxa de descongelação empregada. Para a velocidade em linha reta (VSL) e velocidade média do percurso (VAP), o DMSO proporcionou os melhores resultados, independente do diluente e da taxa de descongelação. No que se refere à vitalidade, os maiores índices foram alcançados quando se utilizou DMSO e as taxas de descongelação de 30 C 16 s -1 ou 40 C 12 s - 1. Quanto à análise morfológica, a maior porcentagem de espermatozoides normais foi obtida utilizando as taxas de 25 C 30 s -1 e 40 C 12 s -1, independente do meio de congelação. A qualidade seminal sofre interferência do meio de congelação, bem como da interação entre seus componentes (diluente e crioprotetor) e da taxa de descongelação empregada. Sob as condições metodológicas empregadas, recomenda-se a criopreservação do sêmen de P. brevis em 5% Glicose + DMSO 10% e descongelação a 30 C durante 16 segundos ou 40 C durante 12 segundos. Palavras-chave: Curimatã comum, congelação seminal, teleósteo, qualidade espermática.

8 7 ABSTRACT Curimatã comum is a migratory fish, an important component of river ecosystem and appreciated in the northeastern cuisine. However, human activities have threatened their survival. Thus arises in the researchers the interest in the development of genetic material storage protocols, such as seminal cryopreservation. Therefore, determining the appropriate freezing media and thawing rate are fundamental steps that will enable the use of this biotechnology in the production of common curimatã, reducing the risk to their survival. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of different freezing media and thawing rates on the quality of P. brevis cryopreserved semen. For that, 18 hours before semen collection, males received a single dose of pituitary extract of carp. Each animal was sedated with eugenol solution-based and the semen was collected. Samples were diluted in four freezing media (5% Glucose + methyl glycol 10%; 5% Glucose + Dimethylsulfoxide 10%; 0.9% NaCl + methyl glycol 10%, 0.9% NaCl + Dimethylsulfoxide 10%) loaded in straws 0, 25 ml and frozen in liquid nitrogen vapor. The semen was thawed after seven days in three thawing rates: 25 C 30 sec -1 ; 30 C 16 sec -1 ; 40 C 12 sec -1. The motility, vitality and morphology analyzes were performed by computer assisted sperm analysis (CASA). The in natura semen characteristics resembled, mostly, those found in the literature. For cryopreserved semen, the greatest results of total motility and curvilinear velocity (VCL) were obtained using Glucose and DMSO, regardless of thawing rate employed. For the straight-line velocity (VSL) and average path velocity (VAP), DMSO showed the best results, regardless of the diluent and thawing rate. As regards the vitality, the highest values were achieved when DMSO and thawing rates 30 C/16 sec or 40 C/12 sec were used. As to morphological analysis, the greatest percentage of normal sperm cells was obtained using the rates 25 C/30 sec and 40 C/12 sec, regardless of freezing media. The sperm quality suffers interference from the freezing media, as well as the interaction between its components (diluent and cryoprotectant) and the thawing rate used. Under the methodological conditions employed, it is recommended to P. brevis semen cryopreservation the use 5% Glucose + cryoprotectant DMSO 10% and thawing rate at 30 C for 16 seconds or 40 C for 12 seconds. Key words: Curimatã comum, sperm freezing, teleost, sperm quality.

9 8 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Exemplar de curimatã comum (Prochilodus brevis)...13 Capítulo 1 Figura 1 Média ± erro padrão da taxa de motilidade total dos espermatozoides de curimatã comum, criopreservados em diferentes meios de congelação. A) Letras minúsculas representam diferença entre os crioprotetores. B) Letras minúsculas representam diferença entre os diluentes (p<0,05)...36 Figura 2 Média ± erro padrão da VCL, VSL e VAP dos espermatozoides de curimatã comum criopreservados em diferentes meios de congelação. A, C e D) Letras minúsculas representam diferença entre os crioprotetores, dentro do mesmo parâmetro. B) Letras minúsculas representam diferença entre os diluentes, dentro do mesmo parâmetro (p<0,05).37 Figura 3 Média ± erro padrão da taxa de vitalidade no sêmen descongelado de curimatã comum. Letras maiúsculas representam diferença do crioprotetor entre as taxas de descongelação. Letras minúsculas representam diferença entre os crioprotetores na mesma taxa de descongelação (p<0,05). D1: descongelação a 25 C 30 s -1 ; D2: descongelação a 30 C 16 s -1 ; D3: descongelação a 40 C 12 s Figura 4 Média ± erro padrão da taxa de espermatozoides normais no sêmen de curimatã comum descongelado em três diferentes taxas. Letras minúsculas representam diferença entre as taxas de descongelação (p<0,05). D1: descongelação a 25 C 30 s-1; D2: descongelação a 30 C 16 s-1; D3: descongelação a 40 C 12 s Figura 5 Média ± erro padrão da taxa de espermatozoides normais no sêmen de curimatã comum criopreservado em diferentes meios de congelação. Letras maiúsculas representam diferença entre os diluentes. Letras minúsculas representam diferença entre os crioprotetores com o mesmo diluente (p<0,05)...39

10 9 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Tabela 1 Peso e comprimento corporal e características do sêmen in natura de curimatã comum, média ± desvio padrão...36

11 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANOVA Análise de Variância CASA Análise do Sêmen Assistida por Computador (Computer Assisted Sperm Analyzis) DMSO Dimetilsufóxido DNOCS Departamento Nacional de Obras Contra as Secas EHC Extrato Hipofisário de Carpa FINEP Financiadora de Estudos e Projetos FUNCAP Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico LBRP - Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes MG Metilglicol NaCl Cloreto de Sódio ph Potencial Hidrogeniônico PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias PROC GLM - General Linear Models Procedure SAS - Statistical Analysis System SCA - Sperm Class Analyser UECE Universidade Estadual do Ceará VAP Velocidade Média do Percurso (Average Path Velocity) VCL Velocidade Curvilinear (Curvilinear Velocity) VSL Velocidade Progressiva Linear (Straight Line Velocity)

12 11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ESPÉCIE EM ESTUDO E SUA REPRODUÇÃO TAXONOMIA (FISHBASE, 2015) CARACTERÍSTICAS GERAIS DO SÊMEN DE PEIXES CHARACIFORMES Volume seminal Osmolaridade e ph do sêmen Concentração espermática AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA: CINÉTICA, MORFOLOGIA E VITALIDADE CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL Meios de congelação: diluentes e crioprotetores Taxas de descongelação JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS... 42

13 12 1 INTRODUÇÃO Muitos peixes neotropicais apresentam apenas deslocamentos relativamente curtos dentro de seus habitats. No entanto, um número significativo deles migra ao longo do rio (PETRERE Jr, 1985). Essa migração é chamada de piracema, ela ocorre durante o período de chuvas e é caracterizado pelo deslocamento desses animais em direção à cabeceira dos rios para se reproduzir (GODINHO; GODINHO, 1994). O Prochilodus brevis Steindachner, 1875 é um peixe migratório, pertencente à ordem Characiformes. Conhecido regionalmente como curimatã comum, esta espécie é endêmica dos estados do Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte, mas atualmente está distribuída pelas regiões Nordeste e parte do Sudeste (DOURADO, 1981). A curimatã comum, como uma espécie do gênero Prochilodus, é um componente ecológico importante no ecossistema fluvial, logo sua perda poderá alterar a dinâmica dos rios em que está inserida (TAYLOR et al., 2006). Apresenta grande valor comercial no sertão norteriograndense (ARAÚJO; GURGEL, 2002), no entanto encontra-se ameaçada pela construção de reservatórios de água e pela pesca predatória, principalmente no período que antecede a desova. Apesar da importância da espécie, há uma escassez de trabalhos sobre sua reprodução e características dos gametas, despertando nos pesquisadores o interesse pela busca de informações para subsidiar o desenvolvimento de programas de conservação dos estoques naturais a evitar a extinção da espécie. Nesse contexto, a criopreservação de sêmen surge como uma área em ascensão para a produção em aquicultura e preservação do material genético (RESENDE; MARQUES, 2009). As etapas do processo de criopreservação devem evitar injúrias às células espermáticas, ao passo que boas taxas de fertilização são resultado da preservação das funções normais desses gametas. Essas etapas devem adequar-se às particularidades de cada espécie. É preciso conhecer o meio de congelação que melhor interage com os espermatozoides de curimatã comum, evitando crioinjúrias e fornecendo os nutrientes essenciais às necessidades desses gametas. A taxa de descongelação apropriada também é um passo importante nesse processo, uma vez que este, é um dos momentos críticos de estresse celular. Encontrar a temperatura e o tempo de descongelação que promovam menos estresse poderá manter o maior número de espermatozoides aptos à fecundação. Portanto, existe a necessidade de definir um protocolo padrão para a criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis.

14 13 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ESPÉCIE EM ESTUDO E SUA REPRODUÇÃO A espécie Prochilodus brevis (Steindachner, 1875) tem como nome popular curimatã comum, é originária das bacias nordestinas, principalmente as cearenses, mas atualmente é encontrada em todo o Nordeste e parte do Sudeste do Brasil (DOURADO, 1981). Essa espécie não defende território e costuma habitar áreas não marginais de açudes e rios. Na fase juvenil alimenta-se de plâncton e quando adulto, passa a ingerir matéria orgânica e microrganismos associados à lama do fundo de lagos e margens de rios, caracterizando regime alimentar iliófago, também alimenta-se de restos de animais e vegetais (DOURADO, 1981). FIGURA 1 Exemplar de curimatã comum (Prochilodus brevis). Fonte: LBRP Nos primeiros 17 meses de idade, a curimatã comum cresce rapidamente e atinge, em média, 34 cm, crescendo lentamente daí em diante. Estudos recentes registraram seu comprimento médio entre 23 e 30 cm. Quanto ao peso, este varia entre 215 a 513 g (NASCIMENTO et al., 2012). As fêmeas são ligeiramente maiores que os machos, principalmente durante o período reprodutivo, entretanto, P. brevis não apresenta dimorfismo sexual (NASCIMENTO et al., 2012; GURGEL et al., 2012). O comportamento reprodutivo da curimatã comum possui como aspectos principais, a migração para a desova, ou seja, é uma espécie reofílica. Este fenômeno é conhecido como piracema, quando no período chuvoso esses peixes percorrem trajetos de vários quilômetros até as áreas de reprodução, onde liberam seus gametas em águas abertas (GESTEIRA, 1978). Apresenta desova anual total, isto é, na época de enchente dos rios, que no Nordeste ocorre de dezembro a maio, fêmeas e machos liberam todo o conteúdo gamético

15 14 e a fecundação ocorre no meio externo. Após a eclosão, os adultos retornam para as partes mais profundas dos rios e açudes, portanto não apresentam cuidados parentais (PORTO, 1897; NASCIMENTO et al., 2012). Em águas paradas, como o cativeiro, os peixes reofílicos não se reproduzem naturalmente, devido à ausência de estímulos ambientais e hormonais, desencadeados pela piracema, sendo necessária a indução hormonal da reprodução. Atualmente, um dos principais agentes indutores da maturação final e liberação dos gametas, aplicados em reprodução artificial de espécies nativas brasileiras, é o extrato bruto de hipófise de carpa (EHC) (ZANIBONI FILHO; WEINGARTNER, 2007). 2.2 TAXONOMIA (FISHBASE, 2015) Reino: Animalia Filo: Chordata Classe: Actinopterygii Ordem: Characiformes Família: Prochilodontidae Gênero: Prochilodus Espécie: Prochilodus brevis 2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO SÊMEN DE PEIXES CHARACIFORMES Volume seminal O volume de sêmen é a quantidade produzida e varia conforme a espécie e até dentro da mesma espécie. Os aspectos que influenciam essa característica são variados e vão desde estação do ano, clima, período de repouso sexual, método de coleta, tratamento hormonal (MURGAS et al., 2011) até as condições do confinamento (ALMEIDA, 2013). Para a espécie em estudo, já foram registrados os valores de 1,31 ml (LOPES et al., 2014) e 0,15 ml (SILVA et al., 2014), para volume seminal, em ambos os trabalhos foi realizada indução hormonal para a coleta do sêmen.

16 Osmolaridade e ph do sêmen Em condições naturais ou mesmo na fertilização artificial, o ph e a osmolaridade do sêmen de peixes são fatores cruciais, pois estão relacionados com a despolarização da membrana do espermatozoide e podem afetar a capacidade da motilidade flagelar. A osmolaridade varia de acordo com características individuais e espécie-específicas (ALAVI; COSSON, 2006). No plasma seminal, os espermatozoides mantêm-se quiescentes, com osmolaridade em torno de 300mOsm/kg. No entanto, este é um fator crítico aos espermatozoides, que possuem pouco tempo de motilidade após a ativação (ALAVI; COSSON, 2006), que na maioria dos peixes de água doce é de 30 a 40 segundos, em média (HINES; YASHOUV, 1971; BILLARD; MARCEL; MATEI, 1981). O ph extracelular atua, possivelmente, como um segundo mensageiro no processo de ativação da motilidade espermática, pois sozinho não é capaz de desencadear tal processo. Porém, seus valores ótimos são necessários e alterações do ph seminal de peixes, que pode variar de 6,5 a 8,5 em peixes de água doce, interferem na motilidade em diferentes espécies (TABARES; TARAZONA; OLIVEIRA, 2005) Concentração espermática A concentração espermática é a densidade de espermatozoides por ml de sêmen, podendo ser determinada pela contagem em câmaras volumétricas, mediante diluição do sêmen em formol-citrato (FELIZARDO et al., 2010). Para P. brevis, já foram documentados os valores de 22,26 x 10 9 sptz.ml -1 (LOPES et al., 2014) e 1,5 x 10 7 sptz.ml -1 (SILVA et al., 2014), em ambos a indução hormonal foi realizada. Como os outros parâmetros supracitados, sua variação ocorre conforme a espécie, peso, idade do peixe, época do ano (SILVA et al., 2009), frequência de coleta e volume do ejaculado (MURGAS et al., 2011). O tratamento hormonal também modifica os valores de concentração espermática, uma vez que o plasma seminal aumenta, com consequente diminuição do número de espermatozoides a cada ml de sêmen (VIEIRA et al., 2011). 2.4 AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA: CINÉTICA, MORFOLOGIA E VITALIDADE

17 16 Um dos parâmetros mais utilizados na avaliação da qualidade espermática é a motilidade, pois esta característica é um importante pré-requisito para a fertilização dos ovócitos (RURANGWA et al., 2004). Viveiros et al. (2009) relataram que a taxa de motilidade do sêmen descongelado de dourado (Salminus brasiliensis) revelava o número de espermatozoides com membranas intactas, demonstrado a íntima relação da motilidade com a viabilidade espermática e com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes. A técnica convencional, baseada na observação através de microscópio ótico, é utilizada pela maioria dos laboratórios para realizar análise seminal. Essa avaliação é feita de forma subjetiva, por um avaliador bem treinado, que estima a taxa de espermatozoides móveis numa escala de 0 a 100% (TAITSON et al., 2008). Atualmente o Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) vem sendo utilizado na análise objetiva da motilidade. Um sistema automático (hardware e software Sperm Class Analyser - SCA) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, gerando informações precisas e significativas do movimento individual de cada célula e de subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004). Com o auxílio do programa é possível avaliar a porcentagem de espermatozoides móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozoides com velocidade rápida, média ou lenta; assim como analisar as propriedades de trajetória e velocidade dos espermatozoides, sendo algumas delas: velocidade curvilínea (VCL - μm/s), velocidade em linha reta (VSL - μm/s), velocidade média da trajetória (VAP - μm/s) (AMANN; KATZ, 2004). O CASA já foi utilizado para analisar a motilidade espermática de algumas espécies do gênero Prochilodus, como P. brevis (LOPES et al., 2014), P. magdalenae (ATENCIO et al., 2013; MARTÍNEZ; PARDO, 2013) e P. lineatus (VIVEIROS et al., 2013). Outro parâmetro relevante na análise da qualidade espermática é a morfologia. Para atingir boas taxas de motilidade é importante que a morfologia das células espermáticas esteja dentro da normalidade (COSSON et al., 1999). Os espermatozoides de peixes podem ser morfologicamente divididos em cabeça, peça intermediária e cauda (NAGAHAMA, 1983). Na maioria dos grupos de peixes, falta o acrossoma, que ocorre em todos os outros grupos de vertebrados. Todavia, a carência desta estrutura é compensada pela presença da micrópila no ovócito, que facilita a entrada do espermatozoide (COSSON et al., 1999). Juntamente com a análise da motilidade, a avaliação morfológica dos espermatozoides torna a atribuição de boa qualidade seminal mais precisa e auxilia na seleção

18 17 de amostras com potencial fertilizante, além de explicar insucessos de reprodutores tidos como aptos após análises convencionais de motilidade espermática (MILIORINI, 2006). As morfopatologias espermáticas podem ser causadas por múltiplos fatores, e são classificadas em primárias, quando são provenientes da espermatogênese e secundárias, quando são causadas pelo manejo durante a coleta e processamento do sêmen (HERMAN; MITCHELL; DOAK, 1994). Em estudos de criopreservação de sêmen de Characiformes, poucos trabalhos avaliam a morfologia espermática como critério de definição da qualidade seminal pósdescongelação (MELO-MACIEL et al., 2012), apesar dos processos de criopreservação do sêmen atuarem como agentes potenciais de alterações da morfologia espermática. A análise da vitalidade espermática também constitui um aspecto importante na avaliação do sêmen, principalmente após a descongelação. Durante o processo de criopreservação alguns eventos podem danificar a célula espermática, levando à lise celular e, consequentemente, sua morte. Esta análise consiste em estimar a porcentagem de células vivas e mortas (PÉREZ-CEREZALES et al., 2010). Embora imprescindíveis para a sobrevivência dos espermatozoides no processo de congelação, os crioprotetores possuem efeitos tóxicos para o espermatozoide, tornando algumas substâncias utilizadas na criopreservação de outros tipos celulares, impróprias para a célula espermática (WATSON, 2000). A redução da temperatura durante o processo de criopreservação leva a formação de cristais de gelo no espaço extracelular, criando um gradiente osmótico entre a solução intracelular inicialmente isotônica e a solução congelada extracelular que se encontra concentrada. Dependendo da velocidade de refrigeração, a água se move através da membrana e se une à fase congelada do meio extracelular ou irá congelar, formando gelo no interior da célula. Na maioria dos casos, as células submetidas à formação de cristais de gelo intracelular se tornam osmoticamente inativas ou lisadas devido à perda da integridade da membrana (DENVIREDDY et al., 2002). 2.5 CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL O primeiro estudo sobre congelação de sêmen de peixe foi realizado por Blaxter (1953) com o objetivo de viabilizar o cruzamento de dois tipos de arenque (Clupea harengus) que desovam em épocas diferentes do ano. Além deste primeiro objetivo, o uso de

19 18 técnicas para o armazenamento de sêmen de peixes justifica-se por razões ligadas a questões ambientais e econômicas, uma vez que a utilização e a implantação de bancos genéticos, incluindo a congelação de sêmen, constituem soluções potenciais para minimizar perdas decorrentes da ação do homem sobre os peixes nativos, garantindo a diversidade genética tanto para os programas de repovoamento, como para a produção comercial (SHIMODA, 2004). O sêmen congelado pode ser mantido em bancos de sêmen por prazo indeterminado, o que possibilita o estabelecimento de programas de melhoramento genético com a utilização de machos selecionados, eliminação do problema de assincronia da atividade reprodutiva entre machos e fêmeas, redução do número de reprodutores machos mantidos na estação de piscicultura, com consequente redução dos custos (GODINHO, 2007). A técnica de congelação celular pode ser dividida em três etapas: (1) As células são submetidas a uma solução crioprotetora, que penetra na célula e substitui a maior quantidade de água intracelular; (2) Posteriormente, a célula deve regular a osmolaridade, ficando isotônica com o meio extracelular, o que pode causar efeitos tóxicos e impacto osmótico nas mesmas; (3) Finalmente, diminui-se a temperatura passando pelo ponto de congelação da água e da solução crioprotetora (LEZCANO, 2001). Existem vários utensílios e equipamentos para congelar as amostras de sêmen, sendo os mais utilizados as caixas de isopor, dry shippers, freezers reguláveis e botijões criogênicos, dentro dos quais são introduzidas palhetas francesas plásticas, cujo volume pode ser de 0,25; 0,5 e 5 ml (MAISSE et al., 1998) Meios de congelação: diluentes e crioprotetores Para a congelação é necessário que o sêmen seja diluído em um meio de congelação, composto pelo diluente e pelo crioprotetor. O meio de congelação é responsável por nutrir a célula espermática e prevenir as crioinjúrias durante a congelação e descongelação seminal. Salmito-Vanderley et al. (2012) listam inúmeros meios de congelação utilizados na criopreservação do sêmen de algumas espécies da ordem Characiformes. O diluente, geralmente uma solução rica em sais e/ou carboidratos, promove o aumento do volume de sêmen, facilitando sua distribuição em doses, e atua como fonte de energia para o espermatozoide pós-descongelado. As condições mínimas requeridas para um diluente adequado são: isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade

20 19 espermática; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen; condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os espermatozoides; esterilidade, ou seja, não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; e, finalmente, servir de carreador de crioprotetores (LEGENDRE; BILLARD, 1980). O diluente Glicose destaca-se nesse contexto por tratar-se de uma solução de fácil aquisição, já testada com sucesso para o sêmen de curimba, um peixe do gênero Prochilodus (VIVEIROS et al., 2009). A solução salina 0,9% NaCl também já foi utilizada como diluente, proporcionando boas taxas de motilidade (MARIA et al., 2006a; MARIA et al., 2006b; OLIVEIRA et al., 2007; ÓRFÃO et al., 2011). O crioprotetor, por sua vez, tem como função proteger as células espermáticas dos efeitos deletérios provocados pela criopreservação. Deve possuir baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água (BATISTA et al., 2006). Crioprotetores podem ser classificados como intracelulares (permeáveis) ou extracelulares (impermeáveis). Os crioprotetores intracelulares são indispensáveis para o sucesso da criopreservação, pois atuam desidratando e reduzindo o ponto crioscópio do interior da célula dificultando a formação de cristais de gelo intracelulares que as danificam. Os crioprotetores extracelulares podem ser ou não adicionados ao meio de congelação, e auxiliam na proteção celular recobrindo a superfície da célula e estabilizando a membrana (WATSON, 1995). Entre os crioprotetores mais utilizados na criopreservação do sêmen de peixe podem ser citados crioprotetores internos como o dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, metanol e etilenoglicol usados geralmente a uma concentração de 10% (MARIA, 2005). Outra substância crioprotetora que vem sendo utilizada é o metilglicol, menos tóxico que os outros crioprotetores, já foi testado com sucesso na criopreservação de sêmen de piracanjuba, Brycon orbignyanus (MARIA et al., 2006a), curimba, Prochilodus lineatus (VIVEIROS et al., 2008), pacu, Piaractus mesopotamicus (ÓRFÃO et al., 2008) e, mais recentemente, em pirapitinga, Piaractus brachypomus (NASCIMENTO et al., 2010). Na maioria dos trabalhos, observa-se que a combinação dos dois agentes (crioprotetores e diluentes) é bastante variável, o que torna muito difícil a tarefa de distinguir qual é o fator ideal para cada espécie, já que eles atuam de forma distinta (SALMITO- VANDERLEY et al., 2012).

21 Taxas de descongelação O processo de descongelação depende de como o sêmen foi congelado. Espermatozoides congelados em curvas moderadas necessitam de curvas adequadas de descongelação. Neste caso, como o gelo extracelular descongela lentamente, diluirá lentamente o soluto das frações de água não congeladas, o que permite que a água se difunda lentamente para dentro da célula, diluindo o soluto intracelular até atingir a concentração inicial. Se o espermatozoide é descongelado rapidamente, o gelo derrete rapidamente, diluindo o soluto do meio e a água entrará muito rapidamente no espermatozoide, o qual se encontra altamente concentrado, danificando o espermatozoide (GRAHAM, 1996). Segundo Resende e Marques (2009), células que tenham sido protegidas com crioprotetores e resfriadas de forma adequada podem, mesmo assim, morrer se elas forem descongeladas muito rápida ou lentamente. A descongelação é o oposto da congelação: as células precisam de tempo para se reidratarem, mas também necessitam se descongelar rápido o suficiente para que os cristais de gelo não se formem durante o processo e se tornem grandes o suficiente para matá-las. Na descongelação do sêmen de algumas espécies de piracema, tem-se utilizado temperatura de banho-maria entre 26 e 60 ºC e tempo de imersão entre cinco e 14 segundos (SILVA, 2000; MURGAS et al., 2003; MORAES, 2004; MARIA et al., 2006a), entre os caracídeos as taxas de 30 C por 16 s e 60 C por 8 s são as mais testadas (VIVEIROS et al., 2011; VIVEIROS et al., 2012).

22 21 3 JUSTIFICATIVA O Prochilodus brevis é uma espécie nativa dos estados do Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte. Do ponto de vista ecológico, é de fundamental importância para a composição do ecossistema fluvial e possui potencial econômico por ser utilizado na culinária nordestina. Entretanto sua sobrevivência está ameaçada pela pesca predatória, principalmente no período que antecede sua desova e pela construção de barragens. Estes fatores despertam nos pesquisadores o interesse sobre o estudo da biologia reprodutiva dessa espécie, sendo a criopreservação do sêmen, uma das áreas em ascensão para a produção em aquicultura e preservação de material genético em programas de conservação. Diversos estudos mostram que a criopreservação seminal é uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes, tendo em vista que seus benefícios são variados, dentre eles: sincronizar a disponibilidade dos gametas; conservar a variabilidade genética; reduzir os custos de manutenção do plantel de reprodutores; possibilitar trocas de material genético entre laboratórios; dentre outros. Já existem trabalhos que relatam diversos aspectos sobre a biologia reprodutiva de Prochilodus brevis, porém, não com o desenvolvimento e aplicação de biotecnologias relacionadas à reprodução, como a criopreservação. A definição de etapas do processo de criopreservação é de suma importância para manter as características seminais adequadas a fim de garantir boas taxas de fertilização.

23 22 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA A associação de Glicose 5% e 10% de metilglicol como diluente e crioprotetor, respectivamente, viabiliza a criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis, proporcionando boa qualidade seminal pós descongelação. A taxa de descongelação é um fator determinante na qualidade espermática pósdescongelação, independente do diluidor utilizado.

24 23 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Avaliar o efeito de diferentes soluções diluidoras e taxas de descongelação sobre a qualidade do sêmen criopreservado de Prochilodus brevis. 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar a qualidade do sêmen in natura de P. brevis; Testar as soluções de Glicose e NaCl como diluentes associados aos crioprotetores Dimetilsulfóxido ou Metilglicol para a criopreservação do sêmen de P. brevis; Verificar a influência de três diferentes taxas de descongelação sobre a qualidade seminal de P. brevis.

25 24 6 CAPÍTULO 1 Criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis: meios de congelação e taxas de descongelação Cryopreservation of Prochilodus brevis semen: freezing media and thawing rates Periódico: Revista Semina: Ciências Agrárias (Submetido em: 04 de junho de 2015)

26 25 Criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis: meios de congelação e taxas de descongelação Cryopreservation of Prochilodus brevis semen: freezing media and thawing rates Larissa Teixeira Nunes 1, Mayara Setúbal Oliveira 1, Júlia Trugilio Lopes 1, Maria Eduarda Magalhães de Sousa 1, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro 1, Cláudio Cabral Campello 1, Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley 1,2* 1 Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil. 2 Centro de Ciências da Saúde, Universidade Estadual do Ceará, Ceará, Brasil. * Correspondência: Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE Telefone: (85) sandra.salmito@uece.br RESUMO O Prochilodus brevis é um peixe reofílico, importante componente do ecossistema fluvial e apreciado na culinária nordestina. No entanto, ações antrópicas têm ameaçado sua sobrevivência. Desta forma, surge, nos pesquisadores, o interesse no desenvolvimento de protocolos de conservação do material genético, como a criopreservação seminal. Logo, a determinação do meio de congelação e da taxa de descongelação adequados, são passos fundamentais que possibilitarão a utilização dessa biotecnologia na produção de curimatã comum, reduzindo os riscos à sua sobrevivência. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de diferentes soluções diluidoras e taxas de descongelação sobre a qualidade do sêmen criopreservado de P. brevis. Para isso, 18 horas antes da coleta de sêmen, os machos receberam dose única de extrato hipofisário de carpa. Cada animal foi sedado com solução à base de eugenol e o sêmen foi coletado. As amostras foram diluídas em quatro meios de congelação (5% Glicose + Metilglicol 10%; 5% Glicose + DMSO 10%; 0,9% NaCl + Metilglicol 10%; 0,9% NaCl + DMSO 10%) envasadas em palhetas de 0,25 ml e congeladas em vapor de nitrogênio líquido. O sêmen foi descongelado após sete dias em três taxas de descongelação: 25 C 30 s -1 ; 30 C 16 s -1 ; 40 C 12 s -1. Foram feitas as análises de motilidade, vitalidade e morfologia com auxílio de sistema automatizado de análise seminal (CASA). As características do sêmen in natura assemelharam-se, em sua maioria, às encontradas na literatura. Para o sêmen criopreservado, os maiores resultados de motilidade total e VCL foram obtidos utilizando Glicose e DMSO, independente da taxa de descongelação empregada. Para as demais velocidades (VSL e VAP), o DMSO proporcionou os melhores resultados, independente do diluente e da taxa de descongelação. No que se refere à vitalidade, os maiores índices foram alcançados quando se utilizou DMSO e as taxas de descongelação de 30 C 16 s -1 ou 40 C 12 s -1. Quanto à análise morfológica, a maior porcentagem de

27 26 espermatozoides normais foi obtida utilizando as taxas de 25 C 30 s -1 e 40 C 12 s -1, independente do meio de congelação. A qualidade seminal sofre interferência do meio de congelação, bem como da interação entre seus componentes (diluente e crioprotetor) e da taxa de descongelação empregada. Sob as condições metodológicas empregadas, recomenda-se a criopreservação do sêmen de P. brevis em 5% Glicose + DMSO 10% e descongelação a 30 C durante 16 segundos ou 40 C durante 12 segundos. Palavras-chave: Curimatã comum, congelação seminal, diluente seminal, agente crioprotetor, temperatura de descongelação, qualidade espermática. ABSTRACT Prochilodus brevis is a migratory fish, an important component of river ecosystem and appreciated in the northeastern cuisine. However, human activities have threatened their survival. Thus, arises in the researchers the interest in the development of genetic material storage protocols, such as seminal cryopreservation. Therefore, determining the appropriate freezing media and thawing rate are fundamental steps that will enable the use of this biotechnology in the production of common curimatã, reducing the risk to their survival. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of different freezing media and thawing rates on the quality of P. brevis cryopreserved semen. For that, 18 hours before semen collection, males received a single dose of pituitary extract of carp. Each animal was sedated with eugenol solution-based and the semen was collected. Samples were diluted in four freezing media (5% Glucose + methyl glycol 10%; 5% Glucose + DMSO 10%; 0.9% NaCl + methyl glycol 10%, 0.9% NaCl + DMSO 10%) loaded in straws 0, 25 ml and frozen in liquid nitrogen vapor. The semen was thawed after seven days in three thawing rates: 25 C 30 sec -1 ; 30 C 16 sec -1 ; 40 C 12 sec -1. The motility, vitality and morphology analyzes were performed by computer assisted sperm analysis (CASA). The in natura semen characteristics resembled, mostly, those found in the literature. For cryopreserved semen, the greatest results of total motility and VCL were obtained using Glucose and DMSO, regardless of thawing rate employed. For the other velocities (VSL and VAP), DMSO showed the best results, regardless of the diluent and thawing rate. As regards the vitality, the highest values were achieved when DMSO and thawing rates 30 C/16 sec or 40 C/12 sec were used. As to morphological analysis, the greatest percentage of normal sperm cells was obtained using the rates 25 C/30 sec and 40 C/12 sec, regardless of freezing media. The sperm quality suffers interference from the freezing media, as well as the interaction between its components (diluent and cryoprotectant) and the thawing rate used. Under the methodological conditions

28 27 employed, it is recommended to P. brevis semen cryopreservation the use 5% Glucose + cryoprotectant DMSO 10% and thawing rate at 30 C for 16 seconds or 40 C for 12 seconds. Key words: Curimatã comum, sperm freezing, sperm extender, cryoprotective agent, thawing temperature, sperm quality. Introdução O Prochilodus brevis ou curimatã comum, como é conhecido regionalmente, é um peixe migratório, pertencente à ordem Characiformes. É endêmico nos estados do Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte, mas atualmente está distribuído pelas regiões Nordeste e parte do Sudeste. Sua importância ecológica está relacionada ao regime alimentar detritívoro, quando adulto (DOURADO, 1981). Essa característica é fundamental para o ecossistema fluvial, uma vez que os detritos são a principal via de energia e fluxo de materiais na maioria dos ecossistemas, dá suporte aos níveis tróficos superiores e é uma importante fonte de regeneração de nutrientes inorgânicos e absorção, portanto perdas de espécies detritívoras poderia interromper o funcionamento do ecossistema (MOORE et al., 2004). Outro aspecto relevante é a importância social, pois seu consumo está mais ligado à subsistência, muito embora, em algumas regiões tenha forte apelo econômico. A construção de barragens hidrelétricas, pesca predatória, escassez de chuvas e poluição são alguns fatores que têm afetado a migração e, consequentemente, a dinâmica do rio, ameaçando a sobrevivência de diversas espécies de peixes, em especial as reofílicas, fazendo-se necessário o desenvolvimento de biotecnologias para a aquicultura de P. brevis. Contudo, há poucos trabalhos que testam biotecnias de conservação seminal, despertando nos pesquisadores o interesse por informações para subsidiar o desenvolvimento de programas de conservação dos estoques naturais e evitar a extinção da espécie. Nesse contexto, a criopreservação de sêmen surge como uma área em ascensão para a produção em aquicultura e preservação do material genético de espécimes com características de interesse e ameaçados (RESENDE; MARQUES, 2009). Durante o processo de criopreservação deve-se evitar injúrias às células espermáticas, ao passo que boas taxas de fertilização são resultado da preservação das funções normais desses gametas. As etapas deste processo devem adequar-se às particularidades de cada espécie (CARNEIRO et al., 2012). Dessa forma, conhecer o meio de congelação que melhor interage com os espermatozoides de curimatã comum é imprescindível para evitar danos e fornecer os nutrientes essenciais aos gametas. Outro ponto fundamental para o sucesso da criopreservação é a definição da temperatura e do tempo apropriados durante a descongelação, uma vez que este é um dos momentos críticos de estresse celular (LEUNG, 1991). Durante esse processo, as células precisam de tempo para se reidratarem, mas também devem descongelar rápido o suficiente para que os cristais de gelo não se formem e se tornem grandes o suficiente para romper a membrana e causar morte celular (RESENDE; MARQUES, 2009). A utilização da taxa de descongelação ótima diminuirá o estresse causado ao espermatozoide, mantendo-o apto à fecundação.

29 28 Portanto, a elaboração de um protocolo eficaz para a criopreservação do sêmen de P. brevis, poderá levar a uma melhor qualidade seminal pós-descongelação, permitindo o aumento da reprodução desta espécie em cativeiro, para suprir a demanda do pescado e evitar seu esgotamento em estoques naturais. Diante disso, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes soluções diluidoras e taxas de descongelação sobre cinética, morfologia e vitalidade dos espermatozoides criopreservados de P. brevis. Material e Métodos Manejo dos animais e coleta seminal O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará ( /2014). O experimento foi realizado entre os meses de janeiro e abril de 2013, no Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes LBRP (3 47'36.2"S; 38 33'30.1"W), localizado no campus do Itaperi da Universidade Estadual do Ceará (UECE), em Fortaleza, Ceará, Brasil. Os exemplares de P. brevis utilizados neste estudo foram mantidos em tanques de fibra de vidro de 7100 L com aeração constante. Os animais foram alimentados duas vezes ao dia com ração comercial (32% de proteína bruta) na proporção de 3% da biomassa animal. Vinte e nove machos de curimatã comum, com papila urogenital hiperêmica e liberação de sêmen detectável sob leve pressão abdominal, receberam por via intracelomática, uma dose (3 mg kg -1 peso corporal) de extrato hipofisário de carpa (EHC). Dezoito horas após a indução hormonal, cada animal foi retirado do tanque de manejo e sedado com solução a base de óleo de cravo (Eugenol; União Vegetal Suplementos Nutricionais Ltda) na proporção de 1:10:10000 (eugenol:álcool:água). Em seguida, o animal foi pesado, medido e teve a papila urogenital devidamente seca com papel toalha para evitar contaminação e os olhos envoltos em pano úmido para facilitar a contenção e minimizar o estresse. Uma leve pressão abdominal no sentido anteroposterior foi realizada para a liberação do sêmen, que foi armazenado em tubos graduados de polietileno e mantido em caixa térmica com gelo a aproximadamente 4º C. Para o experimento, foram selecionadas amostras (n=20) que não apresentaram ativação prévia (atribuída a contaminação por água, urina, fezes ou sangue) e motilidade superior a 85% após a ativação com NaCl 50 mm. Análise do sêmen in natura Inicialmente o volume seminal (ml) foi mensurado por meio de tubos graduados. Em seguida, alíquotas de sêmen de cada animal foram destinadas às análises de osmolaridade e ph seminais e concentração, cinética, vitalidade e morfologia espermáticas. A osmolaridade e o ph foram mensurados em osmômetro digital de refrigeração Peltier (Roebling, Alemanha) e fitas de ph (MERCK-Alemanha), respectivamente.

30 29 A concentração espermática foi calculada por meio de contagem das células em câmara de Neubauer com auxílio de microscópio ótico (400x), após diluição em solução de citrato formolizada a 4% a uma taxa de 1:4000 (sêmen: solução fixadora). A cinética foi avaliada em sistema de análise seminal auxiliada por computador (CASA), por meio do software Sperm Class Analyser (SCA, Microptics Barcelona Espanha, versão 3.2), após homogeneização de 1 µl de sêmen com 100 µl de solução ativadora (NaCl 50 mm 100 mosm). Os parâmetros avaliados foram motilidade total, velocidade curvilinear (VCL), velocidade em linha reta (VSL) e velocidade média do percurso (VAP). Foram avaliados, no mínimo, 2000 espermatozoides por análise. Para a vitalidade, foram confeccionados esfregaços (1 lâmina/animal) após coloração dos espermatozoides pelo método de eosina-nigrosina (Adaptado de BLOM, 1950), utilizando a proporção 1:10:10 (sêmen:eosina:nigrosina). A leitura dos esfregaços (200 espermatozoides por animal), foi realizada com auxílio do programa SCA no módulo Contador. Foram considerados vivos os espermatozoides que se apresentavam incolores (indicando membrana citoplasmática intacta), e mortos os que apresentavam coloração rosada ou vermelha (indicando ruptura na membrana citoplasmática). A análise da morfologia ocorreu após a fixação do sêmen em solução de citrato formolizada a 4% na proporção de 1:100 (sêmen: fixador) e posteriormente coloração com Rosa Bengala na proporção de 3:20 (corante: sêmen fixado). Foram confeccionadas duas lâminas por animal e avaliados 100 espermatozoides por lâmina de acordo com a classificação proposta por Miliorini et al. (2011). As leituras foram realizadas no programa SCA, utilizando o módulo Contador. Criopreservação e descongelação seminal Uma alíquota de sêmen de cada animal foi diluída em quatro meios de congelação compostos pela associação de dois diluentes (5% Glicose ou 0,9% NaCl) e dois crioprotetores (dimetilsulfóxido - DMSO 10% ou metilglicol - MG 10%). O sêmen diluído foi envasado em palhetas francesas de 0,25 ml (5 replicatas), vedadas com álcool polivinílico e mantidas sob refrigeração (~ 4 ºC) por 10 minutos, para o tempo de equilíbrio. Logo após, as palhetas foram congeladas em dry shipper por 15 minutos e transferidas para um botijão de nitrogênio líquido a -196 C. No total, foram criopreservadas 400 palhetas (5 replicatas x 4 tratamentos x 20 animais). Após 15 dias, as amostras foram descongeladas em banho-maria utilizando três taxas de descongelação: 25 C durante 30 segundos; 30 C durante 16 segundos; 40 C durante 12 segundos. O sêmen pós descongelado foi submetido às análises de motilidade, morfologia e vitalidade, seguindo a mesma metodologia empregada para o sêmen in natura. Análise estatística

31 30 Os dados foram inicialmente submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett para verificação da distribuição normal dos resíduos e homocedasticidade, respectivamente. Confirmados ambos os requerimentos para a análise de variância (ANOVA), esta foi realizada usando o PROC GLM do programa SAS, 2002, considerando um delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2 x 2 x 3, representado pelo efeito do crioprotetor (DMSO e metilglicol), efeito do diluente (Glicose e NaCl), o efeito da descongelação (25 C 30 s -1 ; 30 C 16 s -1 ; 40 C 12 s -1 ) e as interações entre os efeitos principais. Quando observada significância de algum efeito principal ou interação, as comparações entre tratamentos foram feitas por meio do teste Student-Newman-Keuls. Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão. Diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Resultados e Discussão Análise do sêmen in natura Os resultados referentes à caracterização do sêmen in natura de P. brevis, ao peso e comprimento dos animais (n=20) encontram-se descritos na tabela 1. Criopreservação e descongelação seminal No que se refere à motilidade total, os fatores crioprotetor e diluente apresentaram efeito significativo (figura 1). O DMSO proporcionou maiores índices, com 32,87 ± 1,21%, independente do diluente e da taxa de descongelação utilizados, quando comparado ao metilglicol, com 16,06 ± 1,58% (p<0,05). A Glicose também apresentou os maiores percentuais de motilidade total, com 27,04 ± 1,84%, independente do crioprotetor e da taxa de descongelação empregados, em comparação ao NaCl, com 21,94 ± 1,27% (p<0,05). Para o parâmetro VCL, houve efeito significativo do crioprotetor e do diluente (figura 2A e 2B). O DMSO proporcionou maiores resultados, com 46,53 ± 0,5 µm s -1 quando comparado ao metilglicol, com 43,35 ± 1,03 µm s -1, independente do diluente e da taxa de descongelação utilizados (p<0,05). A Glicose também foi melhor, com 46,51 ± 0,91 µm s -1, independente do crioprotetor e da taxa de descongelação empregados, em comparação ao NaCl, com 43,44 ± 0,68 µm s -1 (p<0,05). Os resultados de VSL e VAP demonstraram que houve efeito significativo somente do crioprotetor (figura 2C e 2D). Ambos os parâmetros presentaram os maiores valores quando o sêmen de curimatã foi criopreservado com DMSO, independente do diluente e da taxa de descongelação, com 25,78 ± 0,56 µm s -1 e 36,56 ± 0,58 µm s -1, respectivamente, quando comparado ao metilglicol, com 15,64 ± 0,83 µm s -1 e 28,23 ± 1,02 µm s -1, respectivamente (p<0,05). Com relação à porcentagem de espermatozoides vivos, houve interação entre o crioprotetor e a taxa de descongelação (figura 3). Os tratamentos que continham DMSO não diferiram entre as taxas de descongelação 30 C 16 s -1 (56,15 ± 3,46%) e 40 C 12 s -1 (56,45 ± 3,26%), sendo superiores à taxa de 25 C 30 s -1 (41,61 ± 3,05%) (p<0,05). Já para os tratamentos com metilglicol, os