Renata Marino Sykora*, Diego Mendes Baggio, Eduardo Antônio Sanches, Robie Allan Bombardelli, Bruno Estevão de Souza e Elexio Vidal

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1 ESTUDO DE PARÂMETROS INFLUENTES NO MÉTODO DE FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE OVÓCITOS DE JUNDIÁ CINZA (RHAMDIA QUELEN): RELAÇÃO ENTRE VOLUME DE ÁGUA E VOLUME DE OVÓCITOS Renata Marino Sykora*, Diego Mendes Baggio, Eduardo Antônio Sanches, Robie Allan Bombardelli, Bruno Estevão de Souza e Elexio Vidal *Universidade Estadual do Oeste do Paraná - UNIOESTE, Campus Toledo. Rua da Faculdade, 645, Jardim La Salle, CEP Toledo, PR. resykora@yahoo.com.br Resumo O Jundiá Cinza Rhamdia quelen é uma espécie de peixe encontrada desde o sudoeste do México ao centro da Argentina. Este peixe pertence à ordem Siluriforme, à família Pimelodidae e apresenta grande importância econômica na região sul do Brasil, pois é uma espécie nativa aparentemente bem adaptada à diferentes ambientes, amplamente utilizada nos viveiros de piscicultura e de boa aceitação no mercado consumidor. O presente experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito de diferentes volumes de água aplicados ao processo de fertilização artificial de ovócitos do jundiá. Foram utilizados dez reprodutores de jundiá (cinco machos e cinco fêmeas), com peso médio de 136 ± 19,49 g e 159 ± 34,35 g para machos e fêmeas, respectivamente. Após a coleta dos gametas masculinos, realizou-se a mistura do sêmen proveniente de todos os reprodutores, dando origem a um pool de sêmen, e então foi feita a análise de concentração espermática. Os ovócitos coletados foram fertilizados e distribuídos em um delineamento experimental inteiramente casualizado, composto por cinco tratamentos e quatro repetições. Os tratamentos foram constituídos pela adição de água para promover a fertilização dos ovócitos, respeitando as relações de volume de 0,5; 15,0; 30,0; 45,0 e 60,0 ml de água.ml de ovócitos -1. Os resultados obtidos foram submetidos á analise de regressão a um nível de 5% de significância e apresentaram relação LRP (P < 0,05) entre as variáveis. Observou-se uma relação diretamente proporcional entre as taxas de fertilização e aumento do volume de solução ativadora até o nível de 9,89 ml de água.ml de ovócitos não hidratados, proporcionando 61,61% de fertilização. Relações de volumes superiores não causam efeito sobre as taxas de fertilização. A relação volume de água.ml de ovócito não hidratado -1 mínima necessária para garantir o máximas taxas de fertilização artificial de ovócitos de jundiá cinza (R. quelen) é de 9,89. Introdução O Jundiá Cinza é uma espécie de peixe encontrada desde o sudoeste do México ao centro da Argentina (Baldisseroto, 2004). Pertence à ordem Siluriforme e à família Pimelodidae (Nakatani et al., 2001). Segundo Borghetti et al. (2003), no ano de 2000 foram produzidas toneladas de pescado provenientes da aqüicultura, sendo destas, toneladas provenientes do cultivo de peixes. Considerando este perfil, entre as diversas espécies de peixes nativos cultivados no país, o Jundiá (R.a quelen), representou um total de produção de toneladas, o que correspondeu a 1,4 % do total produzido pelo setor aqüícola brasileiro (Borghetti et al., 2003). Esta espécie de peixe apresenta grande importância econômica na região sul do Brasil, pois é uma espécie nativa aparentemente bem adaptada à diferentes ambientes, amplamente

2 utilizada nos viveiros de piscicultura e de boa aceitação no mercado consumidor (Marchioro & Baldisserotto, 1999). Seu cultivo vem crescendo progressivamente no sul do Brasil (Piaia & Baldisseroto, 2000) por apresentar uma carne com ótimo sabor, textura e alto rendimento de carcaça (Ferreira et al., 2001). Além disso, tolera baixas temperaturas e apresenta um bom crescimento em sistemas de cultivo no verão (Barcelos et al., 2003). Além das características de bom desempenho produtivo, outro fator que favoreceu o destaque desta espécie na piscicultura sul brasileira foi o domínio de seu processo reprodutivo em cativeiro (Ferreira et al., 2001). No entanto, alguns aspectos relacionados com a otimização do uso dos reprodutores ainda devem ser estudados, especialmente no que diz respeito aos métodos empregados na fertilização artificial de ovócitos (Chereguini et al, 1999). Em sistemas industriais/comerciais de propagação artificial de peixes, a técnica utilizada em espécies nativas brasileiras emprega um processo rudimentar e de certa forma empírico, através da mistura da água com a massa de esperma e ovócitos secos, a qual pode apresentar limitações quanto a obtenção dos resultados. Tais limitações podem estar relacionadas aos métodos de fertilização, dentre os quais o estudo das relações volume de água/volume de gametas empregadas deve receber atenção especial. Isto porque relações muito baixas podem comprometer negativamente a ativação dos espermatozóides, devido à inadequada concentração osmótica do meio e, relações elevadas podem impedir o encontro do espermatozóide e a micrópila, devido à diluição excessiva do meio (Chereguini et al., 1999). Assim, estudos relacionados com a eficiência dos métodos de fertilização artificial em espécies nativas devem ser desenvolvidos, a fim de se otimizar tal processo. O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos do emprego de diferentes volumes de água como solução ativadora durante o processo de fertilização artificial de ovócitos de jundiá cinza (R. quelen). Material e Métodos O trabalho foi realizado no Laboratório de Tecnologia da Reprodução dos Animais Aquáticos Cultiváveis, instalado no Centro de Pesquisas em Aqüicultura Ambiental - CPAA/IAP - Toledo, PR. Foram utilizados 10 reprodutores, provenientes desta estação de aqüicultura, que foram estocados em um tanque escavado, revestido com concreto, fundo de terra e dimensão de 200m 2, sem renovação de água e abastecimento somente para compensar a água evaporada e infiltrada. Os peixes foram alimentados com dieta comercial processada na forma extrusada e com 32% de proteína bruta. Foram selecionadas cinco fêmeas e cinco machos, apresentando as características descritas por Bombardelli et al. (2006), os quais foram transportados para o laboratório de reprodução, onde foram individualmente pesados, marcados e separados por sexo em tanques com aeração e renovação constante de água. Machos e fêmeas foram induzidos, hormonalmente, com 2,5 e 5,5 mg de extrato pituitário de carpa.kg de reprodutor -1, respectivamente. Após as induções hormonais, a temperatura foi monitorada constantemente e, após 240 horas-grau ou unidades térmicas acumuladas foi realizada a colheita dos gametas masculinos e femininos.

3 A colheita do sêmen foi realizada a partir de aplicação individual de massagem sobre a região ventral do animal sempre no sentido encéfalo-caudal. O volume de sêmen liberado foi mensurado a partir de tubo Falcon graduado e com precisão de 0,1mL. Após a colheita do sêmen de todos os reprodutores o material colhido foi misturado, dando origem a um pool de sêmen. Deste pool, foi mensurada a concentração espermática, por meio de contagem de células espermáticas em câmara hematimétrica de Neubauer (Mylonas et al., 1997). A colheita dos ovócitos e composição do pool de ovócitos foi conduzida de forma idêntica aos machos. Deste pool de ovócitos foram colhidas três amostras de 0,1mL de ovócitos não hidratados que foram contados para estimar o número relativo de ovócitos por mililitro de material liberado. Para a realização dos ensaios de fertilização, foram colhidas do pool de ovócitos, separadamente 20 amostras de 2mL de ovócitos não hidratados, que foram fertilizados com 0,1mL de sêmen e distribuídos em 20 incubadoras experimentais confeccionadas em PVC, com formato cônico e de volume útil de 2,5L. Os ovócitos fertilizados foram distribuídos em um delineamento experimental inteiramente casualizado, composto por cinco tratamentos e quatro repetições. Os tratamentos foram constituídos pela adição de água para promover a fertilização dos ovócitos, respeitando as relações de volume de 0,5; 15,0; 30,0; 45,0 e 60,0 ml de água.ml de ovócitos não hidratados -1. Foi considerado como uma unidade experimental uma incubadora de volume útil de 2,5L, contendo 2mL de ovócitos não hidratados, posteriormente fertilizados, equivalente a um total de 2848 ovos. Após a fertilização, a água das incubadoras foi mantida aquecida em 24 1ºC a partir de um sistema de aquecimento de água dotado de resistência elétrica e termostato. As taxas de fertilização foram mensuradas oito horas após o início da hidratação dos ovos. Para a estimativa deste parâmetro, foram avaliados em microscópio estereoscópio de aumento 10X, aproximadamente, 260 ovos de cada unidade experimental (Zaniboni Filho, 1992). Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância a um nível de 5% de significância e em seguida aplicada à análise de regressão LRP (Linear Response Model). O software utilizado para a realização das análises estatísticas foi o SAEG (Sistema de Análises Estatísticas e Genéticas). Resultados e Discussão Os reprodutores utilizados no presente experimento apresentaram peso corporal médio de 136 ± 19,49 g e 159 ± 34,35 g para machos e fêmeas, respectivamente. O volume médio e desvio padrão de sêmen liberado pelos machos de jundiá foi de 3,88 ± 0,63 ml. Em comparação aos resultados encontrados por Bombardelli et al. (2006), observou-se que o presente trabalho apresentou produção seminal inferior, visto que estes autores encontraram, para indivíduos da mesma espécie, uma produção seminal de 5,9 ± 0,54mL. O volume de sêmen liberado não pode ser considerado como o volume total presente no testículo, pois o método de colheita a partir da extrusão não garante a liberação total do sêmen presente nas gônadas (Ferreira et al., 2001). A concentração espermática verificada para o pool de sêmen do jundiá foi de 3,06x10 10 espermatozóides.ml -1.

4 Taxa de Fertilizaçao (%) Os resultados das taxas de fertilização artificial dos ovócitos de jundiá apresentaram efeito (P<0,05) LRP em função dos volumes crescentes de água utilizada como solução ativadora dos espermatozóides (Figura 1). Estes resultados mostram uma relação diretamente proporcional entre as taxas de fertilização e os volumes crescentes de água até a relação 9,89mL de água.ml de ovócito não hidratado -1, com máximo desempenho teórico em termos de taxas de fertilização de 61,61%. A partir desta relação volume de água.ml de ovócitos não hidratados -1, os resultados apresentaram um comportamento de plateau, ou seja, as taxas de fertilização permanecem constantes em função do aumento das relações de volumes de água. 80 Y = 55, ,6212X R² = 60, ,61% de fertilização 9,89 ml de água.ml de ovócito -1 0, ml de água.ml de ovócito -1 Figura 1. Taxa de fertilização observada para os diferentes volumes de solução ativadora (ml de água.ml de ovócito não hidratados -1 ) utilizados. O uso correto da solução ativadora em procedimentos de fertilização artificial de ovócitos apresenta implicações diretas sobre o sucesso da reprodução artificial de peixes. Neste sentido, deve ser realizado o correto dimensionamento da quantidade de solução ativadora a ser empregada (Zaniboni-Filho & Weingartner, 2007), tendo visto que o excesso desta solução pode causar a diluição excessiva do meio onde ocorre a fertilização, diminuindo a possibilidade dos espermatozóides encontrarem a micrópila durante o curto período de tempo em que ficam ativos (Chereguini et al., 1999; Bombardelli et al., 2006). Por outro lado, Sykora et al. (2007) verificaram que elevadas diluições do meio proporcionam maiores tempos de ativação espermática. Além disso, quantidades insuficientes de solução ativadora podem prejudicar o processo de fertilização por não propiciar um meio adequado para o encontro dos gametas (Chereguini et al., 1999) e causar a obstrução da micrópila pelo muco do ovário ou pelo contato de outro óvulo (Zaniboni-Filho & Weingartner, 2007). Novos estudos relacionados aos processos de fertilização artificial do jundiá cinza (Rhamdia quelen) devem ser realizados, pois poderão subsidiar novas pesquisas e o desenvolvimento da tecnologia da reprodução artificial desta espécie.

5 Conclusão A relação volume de água.ml de ovócito não hidratado -1 mínima necessária para garantir o máximas taxas de fertilização artificial de ovócitos de jundiá cinza (R. quelen) é de 9,89. Referências BALDISSEROTTO, B. Fisiologia de Peixes Aplicada a Piscicultura. Santa Maria: Ed. UFSM, p. BOMBARDELLI, R.A.; MÖRSCHBÄCHER, E.F.; CAMPAGNOLO, R. et al. Dose inseminante para fertilização artificial de ovócitos de jundiá Rhamdia quelen (Quoy & Gaimardm, 1824). Revista Brasileira de Zootecnia, v.35, n.4, p , BARCELLOS, L. J. G.; KREUTZ, L. C.; RODRIGUES, L. B. et al. Haematological and biochemical characteristics of male jundia (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard pimelodidae): change after acute stress. Aquaculture Research, v.34, p , BORGHETTI, N. R. B; OSTRENSKY, A.; BORGHETTI. J. R. Aqüicultura: uma visão geral sobre a produção de organismos aquáticos no brasil e no mundo. Curitiba: Grupo Integrado de Aqüicultura e estudos ambientais, 2003, 128p. CHEREGUINI, O.; DE LA BANDA, I. G.; RASINES, I. et al. Artificial fertilization in turbot, Scopothalmus maximus, (L.): different methods and determination of the optimal sperm-egg ratio. Aquaculture Research, v.30, p , FERREIRA, A. A.; NUÑER, A. P. de O.; LUZ, R. K. et al. Avaliação qualitativa e quantitativa do sêmen de jundiá, Rhamdia quelen. Boletim do Instituto de Pesca, v.27, n.1, p.57-60, MARCHIORO, M. I.; BALDISSEROTTO, B. Sobrevivência de alevinos de jundiá (Rhamdia quelen Quoy & Gaimard, 1824) à variação de salinidade da água. Ciência Rural, v.29, n.2, p , MYLONAS. C. C.; GISSIS. A.; MAGNUS. Y.; et al. Hormonal changes in male white bass (Morone chysops) and evaluation of milt quality after treatment with a sustained-release GnRHa delivery system. Aquaculture v. 153, p , NAKATANI, K.; AGOSTINHO, A. A.; BAUMGARTNER, G. et al. Ovos e Larvas de Peixes de Água Doce. Maringá: EDUEM, p. PIAIA, R; BALDISSEROTO, B. Densidade de estocagem e crescimento de alevinos de jundiá Rhamdia quelen (quoy & gaimard, 1824). Ciência Rural, v.30, n.3, p , 2000.

6 SYKORA, R. M; SANCHES, E. A.;.BAGGIO, D. M; SOUZA, B. E.;BOMBARDELLI, R. A.; VIDAL, E. Efeito da relação volume de sêmen:volume de água sobre o tempo de ativação espermática em jundiá cinza (Rhamdia quelen). In: CONGRESSO NACIONAL DE ENGENHARIA DE PESCA, ENGENHARIA QUÍMICA E QUÍMICA, 1., 2007, Toledo, Anais... Toledo: Centro de Engenharias e Ciências Exatas da Universidade Estadual do Oeste do Paraná Campus Toledo. [2007] (CD-ROM). ZANIBONI FILHO, E. Incubação, larvicultura e alevinagem do Tambaqui (colossoma macropomum Cuvier 1818). São Carlos: Universidade Federal de São Carlos, p. Tese (Doutorado em ecologia de recursos naturais) Universidade Federal de São Carlos, ZANIBONI FILHO,E.; WEINGARTNER, M. Técnicas de indução da reprodução de peixes migradores. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.31, n.3, p , 2007.