Criopreservação de sêmen de peixes no Brasil: estado da arte e perspectivas futuras

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1 Criopreservação de sêmen de peixes no Brasil: estado da arte e perspectivas futuras (Fish semen cryopreservation in Brazil: state of the art and future perspectives) Alexandre Nizio Maria 1*, Paulo César Falanghe Carneiro 1 1 Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, Sergipe, RESUMO Os estudos sobre a criopreservação de sêmen de peixes de água doce no Brasil teve inicio na década de 1980, no entanto, a maior parte das pesquisas ocorreu nos últimos dez anos. Neste artigo é apresentada uma visão geral do estado da arte da criopreservação de sêmen de peixes no Brasil e os avanços técnicos ocorridos nas últimas décadas. Atualmente também são realizadas pesquisas sobre este tema que buscam identificar soluções para a aplicação das técnicas de criopreservação de sêmen de peixes em escala comercial, contribuindo assim para o desenvolvimento da piscicultura no país. Palavras-chave: diluidores, crioprotetores, congelamento, descongelamento, motilidade, fertilização. ABSTRACT Studies on cryopreservation of freshwater fish semen in Brazil started in the 80 s, however, most of the researches has occurred in the last decade. The present study shows a general view on the state of art of the cryopreservation of fish semen in Brazil and recent advances. Nowadays, there are also studies on this matter which search ways for using the technique of cryopreservation of fish semen in commercial scale, so it could contribute with the fish production in our country. Key words: extenders, cryoprotectants, freezing, thawing, motility, fertilization. 27 a 29 de junho de

2 INTRODUÇÃO A criopreservação de sêmen de peixes é uma técnica de grande interesse para a piscicultura que pode ser utilizada como rotina nos laboratórios de reprodução. Esta técnica visa à conservação deste material genético em nitrogênio líquido a -196ºC. Nesta temperatura a estrutura e funcionalidade de células e tecidos vivos são mantidas, conservando-as geneticamente viáveis e reversivelmente inativas do ponto de vista metabólico (Pegg, 2007). O desafio para o sucesso dessa técnica está na retirada do excesso de água presente no interior da célula espermática, evitando assim a formação de cristais de gelo que podem causar danos funcionais irreversíveis (Carneiro, 2007). Entre os benefícios da criopreservação de sêmen podemos citar: a eliminação do problema causado pela assincronia na maturidade gonadal entre machos e fêmeas; a simplificação do manejo dos reprodutores, podendo-se trabalhar separadamente com machos ou com fêmeas em momentos distintos; a facilidade de transporte de material genético entre pisciculturas, evitando o transporte de animais vivos e seus custos; a formação de bancos de germoplasma que permite a conservação de gametas de animais selecionados em programas de melhoramento ou manipulados geneticamente (triplóides, clones e transgênicos); e o estabelecimento de programas de hibridização utilizando peixes com períodos reprodutivos diferentes (Viveiros, 2005; Maria et al., 2009). Os bancos de germoplasma podem beneficiar também, do ponto de vista genético, a reposição de espécies ameaçadas de extinção, sobreexplotadas ou ameaçadas de sobreexplotação. Um dos primeiros relatos na literatura sobre o congelamento de sêmen de peixes no mundo foi realizado na década de Apenas cerca de 30 depois o Brasil iniciou suas pesquisas na área. Hoje no país, mais de 17 espécies de peixes já têm seu protocolo de criopreservação de sêmen determinado, com especial destaque para as famílias Characidae, Prochilodontidae, Anastomidae e Pimelodidade (Carosfeld et al., 2003; Maria et al., 2009; Viveiros & Godinho, 2009; Viveiros, 2011; Araújo, 2011). O desenvolvimento de protocolos depende da padronização de métodos mais adequados de coleta e diluição, determinação de diluidores e crioprotetores mais eficazes, tipos de recipientes para armazenamento do sêmen e velocidades de resfriamento, congelamento e descongelamento específicas. Assim este artigo tem como objetivo apresentar uma 27 a 29 de junho de

3 visão geral do estado da arte da criopreservação de sêmen de peixes no Brasil e informações sobre os avanços técnicos ocorridos nas últimas décadas. Etapas do processo de criopreservação A seqüência de eventos normalmente relacionados à criopreservação de sêmen de peixes envolve etapas como: 1. Coleta do sêmen; 2. Avaliação microscópica da qualidade seminal; 3. Adição de diluidores e crioprotetores; 4. Envase; 5. Congelamento e armazenamento; 6. Descongelamento; 7. Fertilização e acompanhamento do desenvolvimento embrionário e larval. Para obter sucesso na criopreservação de sêmen é necessário atenção nos procedimentos que antecedem o congelamento. A maioria das espécies de peixes estudadas no Brasil são migradoras e que possuem espermatozoides imóveis dentro dos testículos. Durante a coleta de sêmen, problemas como contaminação com água, fezes ou urina podem ativar a motilidade espermática, situação indesejável para as amostras utilizadas no congelamento. A criopreservação envolve a diluição do sêmen em uma solução crioprotetora que deve conter um diluidor, um crioprotetor intracelular e um crioprotetor extracelular para permitir o armazenamento adequado. Esses produtos garantem a não ativação dos espermatozóides durante o armazenamento e protegem as células espermáticas das chamadas crioinjúrias, danos celulares causados pela sua exposição a baixas temperaturas (Suquet et al., 2000; Billard et al., 2004). Entre os diluidores mais conhecidos e utilizados com sucesso na criopreservação de sêmen de peixes nativos brasileiros podemos citar a solução de glicose, geralmente na concentração de 5%. Entre os crioprotetores intracelulares temos o dimetilsulfóxido (DMSO) e o metilglicol, que são adicionados aos diluidores em concentrações entre 5 e 10% (Viveiros & Godinho, 2009; Maria et al., 2009). A gema de ovo pode participar como um crioprotetor extracelular e, quando utilizada, é adicionada em concentrações entre 5 a 10% (Maria et al., 2006; Viveiros & Godinho, 2009; Maria et al., 2011). No entanto, a melhor combinação para uma espécie pode não resultar em respostas positivas para outras. Como exemplo, as soluções crioprotetoras mais utilizadas nas espécies da família Pimelodidae são compostas por DMSO ou metanol e leite em pó ou lactose, utilizadas 27 a 29 de junho de

4 como crioprotetores intracelulares e extracelulares, respectivamente (Carosfeld et al., 2003; Araujo, 2011). Na prática o desenvolvimento de uma solução crioprotetora para uma determinada espécie de peixe necessita de ensaios para a avaliação dos seus eventuais efeitos tóxicos e sua influência sobre a integridade e funcionalidade da célula espermática. Tanto a escolha destas substâncias, quanto suas proporções na solução crioprotetora devem ser determinadas para cada espécie de peixe, sendo observadas diferenças muito grandes entre elas. A escolha dos crioprotetores e a definição da velocidade de congelamento, simultaneamente, determinam a severidade dos danos físicos causados aos espermatozóides pela formação de cristais de gelo intracelular (Mazur, 1977). Durante o congelamento os principais danos às membranas espermáticas ocorrem entre -5 C e - 15 C, que é faixa de formação dos cristais de gelo extracelular (Mazur, 1984). No Brasil, a criopreservação de sêmen de peixes tem sido realizada em botijões de vapor de nitrogênio líquido tipo dry shipper que apresentam velocidades de congelamento entre - 25 e -40ºC/min e estabilização à -180ºC em aproximadamente 3 minutos (Taitson et al., 2007). O congelamento envolve perda de água e consequente desidratação celular (Squires et al., 1999). Por outro lado, o descongelamento implica na rehidratação das células provocada por um influxo de água (Holt, 2000). Com exceção das células embrionárias de mamíferos, a maioria das células suporta o descongelamento rápido, mesmo que não seja atingida totalmente a sua rehidratação. A rapidez no descongelamento é necessária para evitar a recristalização, ou seja, o reagrupamento de pequenos cristais de gelo que podem ser letais à célula (Leung, 1991). O descongelamento uniforme do sêmen congelado em palhetas de 0,5 ml geralmente é obtido após sua imersão em água quente (30-60ºC) por poucos segundos (3-8 s). Em recipientes maiores este processo de descongelamento se torna mais difícil porque o descongelamento não é uniforme, ou seja, a superfície descongela mais rápido que a porção central. Portanto, a determinação da velocidade de descongelamento também é primordial para o estabelecimento de protocolos de conservação de sêmen (Mazur, 1984; Watson, 1995). O entendimento do mecanismo do congelamento e descongelamento da célula espermática tem levado ao aprimoramento dos protocolos de criopreservação. Muitos 27 a 29 de junho de

5 trabalhos com crioprotetores menos lesivos, ou combinações mais adequadas de diversas substâncias e diferentes tipos recipientes mostram a possibilidade de modificação da morfologia dos cristais de gelo formados pelo congelamento (Cancimansi et al., 2010). Atualmente, vários recipientes são utilizados para criopreservação de células espermáticas entre eles, palhetas de 0,25 ou 0,5 ml, macropalhetas, criotubos, sacos e tubos plásticos com capacidade de armazenamento variado, geralmente entre 1 e 5 ml. A maioria dos trabalhos de congelamento de sêmen de peixes brasileiros tem sido realizada em palhetas francesas com volume de 0,5 ml, tamanho considerado adequado para o propósito dos bancos de germoplasma e para fertilizar pequenas quantidades de ovócitos (Carolsfeld et al., 2003; Maria et al., 2006; Viveiros et al., 2009). Contudo, a sua aplicação para espécies que apresentam alta fecundidade requer um grande número de palhetas para fertilizar um grande número de ovócitos. Portanto, a criopreservação de sêmen em recipientes com maior capacidade de armazenamento reduzirá o tempo necessário para o acondicionamento e descongelamento do sêmen, facilitando a manipulação durante o processo de fertilização. No Brasil, são poucos os estudos sobre a qualidade e eficiência do sêmen de peixes criopreservado em recipientes de maior volume (Velasco-Santamaría et al., 2006; Ninhaus-Silveira et al., 2006; Viveiros et al., 2009; Órfão, 2010; Viveiros et al., 2011). Em quase todos eles, apenas as macropalhetas de 4 ml foram utilizadas. Outros recipientes alternativos como os criotubos, no entanto, normalmente não têm sido utilizados rotineiramente no congelamento de sêmen de peixes e configura-se atualmente como um desafio para as novas pesquisas que visam o uso de recipientes de grandes volumes para viabilizar a aplicação da técnica de criopreservação de sêmen em escala comercial. Atualmente tem-se buscado recipientes que apresentem baixo custo, facilidade de aquisição no mercado nacional, aceitação internacional, ausência de contaminantes e facilidade de preenchimento e identificação das amostras. O desenvolvimento de novos recipientes de armazenamento objetiva preservar as características espermáticas pós-descongelamento e facilitar a utilização do sêmen congelado em larga escala sem que seja necessário o uso de um grande número de palhetas de pequenos volumes (0,25 ou 0,5 ml). 27 a 29 de junho de

6 O procedimento de fertilização de ovos que se segue após o descongelamento do sêmen deve ser bem organizado para que o sêmen descongelado seja rapidamente misturado aos ovócitos e os espermatozóides ativados pela adição de água ou de uma outra solução ativadora, que no caso da maioria dos peixes de água doce pode ser a base de bicarbonato sódio 1% ou cloreto de sódio 0,3%. O procedimento de fertilização não deve ser demorado, pois a qualidade dos ovócitos diminui rapidamente após a desova. CONSIDERAÇÕES FINAIS A criopreservação de sêmen de peixes no Brasil ainda é um campo novo em que pouco progresso prático, em nível comercial, foi alcançado. O crescente interesse pelo aprimoramento da técnica tem levado cada vez mais ao aumento no número de estudos sobre o tema fazendo com que, a partir do estado da arte atual existente para algumas espécies, já seja possível o início do uso do sêmen congelado na rotina de produção de alevinos em alguns laboratórios públicos e privados de reprodução de peixes. REFERÊNCIAS ARAÚJO, R.V. Motilidade, Velocidade e Fertilidade do sêmen de Surubim-do-paraíba Steindachneridion parahybae (Siluriformes) criopreservado em diferentes diluidores. 91p. Tese (Doutorado em Zootecnia) - Universidade Federal de Lavras, Programa de Pós Graduação em Zootecnia, Lavras, MG, BILLARD R.J.; COSSON, S.B.; NOVEIRI, M. Cryopreservation and short-term storage of sturgeon sperm, a review. Aquaculture, v. 236, p.1-9, CANCIMANSI, J.A.N.; SILVA, J.F.S.; VAN TILBURG, M.F. Recipientes de armazenamento de sêmen congelado e seu efeito sobre a crio-sobrevivência espermática. Pubvet, v.4, n.42, ed.147, art. 986, CAROLSFELD, J.; HARVEY, B.; GODINHO, H. P.; ZANIBONI-FILHO, E. Cryopreservation of sperm in Brazilian migratory fish conservation. Journal Fish Biology, v.63, p , HOLT, W. V. Fundamental aspects of sperm cryobiology: the importance of species and individual differences. Theriogenology, Woburn, v. 53, n. 1, p , a 29 de junho de

7 LEUNG, L. K. P. Principles of biological criopreservation. In: JAMIESON, B. G. M. (Ed.). Fish evolution and systematics: evidence from Spermatozoa. Cambridge University Press, Cambridge, Cap. 19, p MARIA, A. N.; VIVEIROS, A. T. M.; FREITAS, R. T.F.; OLIVEIRA, A. V. Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba Brycon orbignyanus semen, an endangered Brazilian teleost fish. Aquaculture, v. 260, n. 29, p , MARIA, A. N.; AZEVEDO, H. C.; CARNEIRO, P. C. F.. Criopreservação de sêmen de peixes no contexto do agronegócio da piscicultura. In: Tavares-Dias, M.. (Org.). Manejo e Sanidade de Peixes em Cultivo. 1 ed. Amapá: Embrapa Amapá, 2009, v. 1, p MAZUR, P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. American Journal of Physiology / Cell Physiology, p , MAZUR, P. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates. Cryobiology, v. 14, n. 3, p , NINHAUS-SILVEIRA, A.; FORESTI, F.; VERÍSSIMO-SILVEIRA, R.; SENHORINI, J.A. Seminal Analysis, Cryogenic Preservation, and Fertility in Matrinxã Fish, Brycon cephalus (Günther, 1869). Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol.49, n. 4, p , ORFÃO, L. H. Diversidade genética de populações e criopreservação de sêmen de pirapitinga-do-sul Brycon opalinus p. Tese de Doutorado. Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, Brasil. PEGG, D. E. Principles of Cryopreservation. In: DAY, J. G.; STACEY, G. N. (Ed). Methods in molecular biology: Cryopreservation and freeze-drying protocols. 2ed. Totowa, NJ: Humana Press Inc. v.368, p.39-58, SQUIRES, E.L.; PICKETT, B.W.; GRAHAM, J.K.; VANDERWALL, D.K.; MCCUE, P.M.; BRUEMMER, J.E. Cooled and frozen stallion semen. Fort Collins: Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory, Colorado State University, (Bulletin, 9). SUQUET, M.; DREANNO, C.; FAUVEL, C.; COSSON, J.; BILLARD, R. Cryopreservation of sperm in marine fish. Aquaculture Research, v.31, p , a 29 de junho de

8 TAITSON, P.F., CHAMI, E., GODINHO, H.P. Gene banking of the neotropical fish Leporinus obtusidens (Valenciennes, 1836): a protocol to freeze its sperm in the field. Animal Reproduction Science v.105,p , VELASCO- SANTAMARÍA, Y. M.; MEDINA-ROBLES V.M.; CRUZCASALLAS, E.P. Cryopreservation of yamú (Brycon amazonicus) sperm for large scale fertilization. Aquaculture, Amsterdam, v. 256, n, 1/4, p , June VIVEIROS A.T.M. & GODINHO, H.P. Sperm quality and cryopreservation of Brazilian freshwater fish species: a review. Fish Physiology and Biochemistry, v. 35, p , VIVEIROS, A. T. M. Criopreservação de sêmen de peixes. In: Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 16., Goiânia, GO. Palestras..., VIVEIROS, A.T.M. Current Status of Sperm Cryopreservation in Siluriform Catfishes. In: Cryopreservation in Aquatic Species, 2nd Edition. T. R. Tiersch and C. C. Green, editors. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana. p , VIVEIROS, A.T.M.; MARIA, A.N.; AMARAL, T.B.; ORFÃO, L.H.; ISAÚ, Z.A.; VERISSIMO-SILVEIRA, R. Spermatozoon ultrastructure and sperm cryopreservation of the Brazilian dry season spawner fish pirapitinga, Brycon nattereri. Aquaculture Research, p. 1-10, VIVEIROS, A.T.M.; ORFÃO, L.H.; MARIA, A.N.; ALLAMAN, I.B. A simple, inexpensive and successful freezing method for curimba Prochilodus lineatus (Characiformes) semen. Animal Reproduction Science v. 112, p , WATSON, P. F. Recent developments and concepts in cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reproduction Fertility and Development, v. 7, p , a 29 de junho de

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