ESTRATÉGIAS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS

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1 1 ESTRATÉGIAS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS CAMILA YAMAGUTI LENOCH 1, RAQUEL SILVA ALVES 2, IALANNA GARGHETTI SPILMANN 2, FERNANDA BOLDO SOUZA 2, LARISSA GOLFETTO DRUMM 2, UBIRAJARA MACIEL COSTA 2 1 Instituto Federal Catarinense - IFC 2 Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC As CTM foram cultivadas em DMEM + 10% SFB a 37ºC com 5% de CO 2 e congeladas na concentração de 10 6 células/ml em DMEM + 10% SFB com três tratamentos diferentes (10% DMSO, 10% PG e 10% EG). Após permaneceram por, pelo menos, 48 horas em botijão de nitrogênio líquido, foram descongeladas, e realizados os seguintes testes: sobrevivência celular imediata, curva de crescimento celular, teste de Population Doubling Time (PDT), teste de viabilidade celular através do reagente WST-1 e capacidade de diferenciação destas células em células dos tecidos ósseo e adiposo. Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente e os tratamentos apresentaram resultados tecnicamente viáveis e semelhantes entre si. Portanto, tanto o DMSO quanto o PG e o EG são eficazes na criopreservação de CTM. Palavras-chaves: Células tronco mesenquimais, Crioprotetores, Viabilidade celular. 1183

2 2 STRATEGIES FOR CRYOPRESERVATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS MSCs were grown in DMEM + 10% FBS at 37ºC with 5% of CO 2 and frozen at a concentration of 10 6 cells/ml in DMEM + 10% FCS with three different treatments (10% DMSO, 10% PG and 10% EG). After standing for, at least 48 hours, in a liquid nitrogen cylinder, they were thawed and conducted the following tests: immediate cell survival, cell growth curve, Population Doubling Time test (PDT), cell viability test using the WST-1 reagent and differentiation capacity of these cells into cells of the bone and adipose tissue. The results were analyzed statistically and the treatments showed results that are technically viable and similar each other. Therefore, both DMSO as the PG and EG are effective in cryopreservation of CTM. Key-words: Mesenchymal stem cells; Cryoprotectants; Cell viability. INTRODUÇÃO O resfriamento das células tronco mesenquimais (CTM) a temperaturas próximas a 0ºC reduz o seu metabolismo, mas não o interrompe completamente, de forma que as células continuam sofrendo o processo de deterioração progressiva, apenas em menor velocidade (Meryman, 1971). Por isso, é necessário o uso de técnicas que permitam estabilizar e manter as características e a viabilidade destas células em temperaturas criogênicas (Graham, 1996). Para minimizar os danos causados pela criopreservação, é necessário o uso de crioprotetores, que são substâncias químicas que agem interna ou 1184

3 3 externamente protegendo a célula da formação de gelo intracelular (Córdova-Caballero et al., 2002). MATERIAL E MÉTODOS As CTM foram cultivadas em meio DMEM + 10% SFB (Soro Fetal Bovino) em garrafas de cultivo de 75 cm 2, temperatura de 37ºC, 5% de CO 2 e umidade saturada. Ao atingir 70% de confluência eram realizadas as passagens, a CTM foram criopreservadas entre a 5ª e a 7ª passagem, na concentração de 1x10 6 células/ml em criotubos contendo um volume final de 1 ml. Foram utilizadas três soluções crioprotetoras: DMSO (dimetilsulfóxido), PG (propilenoglicol) e EG (etilenoglicol), na concentração de 10%, em DMEM com 10% SFB. Após serem envazados, os criotubos foram transferidos para o dispositivo comercial Mr. Frosty previamente refrigerado a 4ºC para ser realizada a curva de resfriamento de 4ºC a -80ºC, diminuindo 1ºC/minuto conforme orientação do fabricante. O Mr. Frosty foi, então, colocado em um ultrafreezer a -80ºC, onde permaneceu por 12 horas. Em seguida, os criotubos foram transferidos para um botijão de nitrogênio líquido a - 196ºC, no qual permaneceram por pelo menos 48 horas antes de serem descongelados em banho-maria a 37ºC. Uma parte das CTM foi mantida em cultivo para ser utilizada como grupo controle nos testes realizados. Imediatamente após o descongelamento, as CTM foram submetidas à determinação da sobrevivência celular imediata, através da contagem celular pelo método de exclusão de células mortas por coloração com azul de Tripan a 0,4% (Freshney, 2000); à determinação da curva de crescimento celular; à determinação do PDT (Population Doubling Time); ao teste de viabilidade celular através do reagente 1185

4 4 WST-1; e à determinação da capacidade de diferenciação em células especializadas (diferenciações osteogênica e adipogênica). Todos os testes foram realizados em triplicata. RESULTADOS A análise estatística foi realizada pelo pacote estatístico SAS (SAS Institute, 2009), por meio do procedimento GLM, adotando-se um nível de significância de 5%. A taxa de sobrevivência celular foi significativamente maior com o tratamento que utilizou o DMSO (86,4±0,7%) como crioprotetor em relação aos tratamentos com EG (72,9±2,6%) e PG (71,7±1,5%), os quais não apresentaram diferença estatística entre si. Quanto à curva de crescimento celular e à determinação do PDT (DMSO=27,2±1,4 h; PG=26,7±1,9 h; EG=28,0±1,7 h; Controle=21,3±0,2 h), não houve diferença estatística entre os tratamentos, entretanto, todos foram inferiores ao controle não criopreservado. A viabilidade, analisada através do reagente WST-1, das células criopreservadas com EG, PG e DMSO foram, respectivamente, 66,65%, 71,42% e 83,62%. O PG não diferiu estatisticamente dos demais crioprotetores. O DMSO, entretanto, apresentou diferença significativa em relação ao EG, demonstrando um maior potencial de células viáveis. Tanto as CTM criopreservadas nos três tratamentos quanto as CTM controle conseguiram se diferenciar em células do tecido ósseo e do tecido adiposo. DISCUSSÃO A criopreservação influenciou na sobrevivência, na taxa de multiplicação e na viabilidade celular, mas mesmo assim pode ser 1186

5 5 utilizada para armazenar as CTM, já que os danos causados não inviabilizaram as mesmas. E qualquer um dos três crioprotetotes utilizados (DMSO, PG e EG) podem ser utilizados na criopreservação destas células, pois durante os experimentos realizados apresentaram resultados tecnicamente viáveis. CONCLUSÃO Os resultados obtidos neste estudo estão em consonância com outros dados presentes na literatura, demonstrando assim a viabilidade do uso dos protocolos testados para serem utilizados na rotina laboratorial, sendo que o emprego de qualquer um dos três crioprotetores avaliados neste trabalho apresentará resultados eficazes para a criopreservação das CTM. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CÓRDOVA-CABALLERO, M. S. et al. Transplantes de células progenitoras hematopoyéticas. Gaceta Médica de México, v. 138, n. 1, FRESHNEY, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic techniques. 4 ed. Hoboken, NJ: Wiley-Liss, GRAHAM, J. K. Cryopreservation of stallion spermatozoa. Veterinary Clinics of North America: Equine Practice, v. 12, p , MERYMAN, H. T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury. Cryobiology, v. 8, p , SAS Institute Inc. SAS/STAT: User s guide. Version 9.2.ed. Cary, NC, p. 1187

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