EFEITO DA ADIÇÃO DOS ANTIOXIDANTES TROLOX C E ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DE ESPERMATOZOIDES DE OVINOS 1

Transcrição

1 EFEITO DA ADIÇÃO DOS ANTIOXIDANTES TROLOX C E ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DE ESPERMATOZOIDES DE OVINOS 1 Effect of addition of antioxidants trolox c and ascorbic acid about the integrity of plasma membrane of sheep spermatozoa 1 1 Jonathan Maia da Silva Costa 2*, 2 Wildelfrancys Lima de Souza 3, 3 Elenice Andrade Moraes 4, 4 Vitória Gomes Coelho 5, 5 Laiane Moreira Vianna Magalhães 3, 6 Dailli Ingrid de Brito Lima 5 1 Parte de dissertação do primeiro autor. 2 Doutorando do Curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (FAVET), Universidade Estadual do Ceará. * jonathanmaiacosta@yahoo.com.br 3 Mestrandos do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal (CPGCA), Universidade Federal do Vale do São Francisco (Univasf), Petrolina-PE. 4 Professora do Colegiado de Zootecnia e CPGCA, Univasf, Petrolina-PE. 5 Discente do Curso de Medicina Veterinária, Univasf, Petrolina-PE.

2 Introdução A criopreservação de sêmen dos animais domésticos contribuiu para a expansão das biotécnicas da reprodução, como a inseminação artificial (IA) e a fertilização in vitro, o que a torna uma importante técnica reprodutiva, tendo em vista que promove a conservação do germoplasma masculino por tempo indeterminado (SILVA, 2013). Entretanto, a célula espermática é sensível a variações externas decorrentes do processo de congelaçãodescongelação, que implicam em danos a motilidade espermática e a integridade das membranas (SALAMON e MAXWELL, 1995), produzindo uma subpopulação com menor tempo de vida in vivo, o que reduz efetivamente a eficiência da população como um todo. Visando reduzir os efeitos deletérios ocasionados pela criopreservação, antioxidantes não enzimáticos como o Trolox C e ácido ascórbico, tem sido adicionados ao meio diluidor, os quais tem demostrado efeitos benéficos na manutenção da viabilidade espermática pósdescongelamento (MAIA et al., 2009; CASTILHO et al., 2009), sendo está uma importante avaliação, uma vez que, os parâmetros da cinética espermática têm sido correlacionados com provas de capacidade fecundante do espermatozoide (ISACHENKO et al., 2004). Assim, objetivou-se avaliar o efeito da adição dos antioxidantes Trolox C e ácido ascórbico sobre a integridade da membrana plasmática de espermatozoides descongelados de carneiros. Material e Métodos O presente estudo foi submetido ao Comitê de Ética e Deontologia em Estudos e Pesquisas CEDEP/UNIVASF, registrado com o protocolo de número 0005/ O experimento foi desenvolvido no Centro de Pesquisa em Suínos, Espécies Nativas e Silvestre (CPSENS), localizado no Campus de Ciências Agrárias da Univasf, Petrolina, Pernambuco (09 23'55 de latitude S e de longitude O). Foram utilizados três carneiros, com idade entre 2 a 4 anos. Os animais foram mantidos em baias individuais, com dieta a base de volumoso e concentrado, com fornecimento de água ad libitum. As coletas foram realizadas duas a três vezes por semana para cada animal com intervalos de 48 horas. Foi utilizada nas coletas vagina artificial para ovinos (Minitub ; Berlim, Alemanha) com água a 50 C acoplada a tubos de centrífuga de 50 ml, utilizando como manequim uma fêmea ovina. Após a coleta o sêmen foi transportado imediatamente para o CPSENS e colocado em banho-maria a 32 C. Cada ejaculado foi avaliado quanto aos parâmetros seminais (volume, aspecto, concentração e a motilidade espermática). Os ejaculados foram distribuídos em cinco tubos de ensaio de 15 ml e diluídos em Tris-gema de ovo, conforme Souza et al., (2015), para concentração final de 200x10 6 espermatozoides/ml, determinado através

3 da análise no fotômetro SDM6 (Minitub ; Berlim, Alemanha), e mantidos em banho maria a 32 C. A avaliação da integridade da membrana plasmática foi realizada através da associação das sondas iodeto de propídeo (PI) e Hoechst 3342 (H342). Para isto foi utilizada metodologia descrita por Azevedo (2006), com algumas modificações. Uma alíquota de 5 µl de sêmen (2x10 6 espermatozoides) foi diluída em 120 µl de meio Tris ao qual foram adicionadas as soluções de trabalho das sondas nas seguintes proporções: 2μL de IP e 2μL H342. A mistura foi homogeneizada, mantida protegida da luz e incubada a 37ºC por 8 minutos, em seguida uma alíquota dessa mistura de 10μL foi colocada entre lâmina e lamínula e 200 espermatozoides foram avaliados em microscópio de fluorescência, usando filtro 02 (excitação 365nm e Emissão 420nm). Os espermatozoides corados foram visualizados e classificados: A ausência de fluorescência azul (H342) e consequentemente a presença de fluorescência vermelha (PI) na cabeça do espermatozoide, indicava lesão na membrana plasmática, já a ocorrência inversa indicava que a membrana plasmática encontrava-se integra. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando-se o programa estatístico SAEG. Resultados e Discussão Os percentuais de membrana plasmática dos espermatozoides podem ser observados na Tabela 1, onde os grupos tratados com 200µL de Trolox C (23,67%); 0,05 % (27,17) e 0,25% (37,0%) de ácido ascórbico apresentaram maiores (P<0,05) taxas de integridade de membrana, pósdescongelamento. A suplementação do diluidor com 0,25% de ácido ascórbico proporcionou efeito benéfico na integridade de membrana plasmática avaliada pela associação das sondas PI e H (342), em relação aos demais grupos, dados que corrobora com os achados de Salamon e Maxwell (1995), os quais demonstraram que embora os espermatozoides apresentem motilidade de 60% pós-descongelamento, somente cerca de 20 a 30% permaneceram biologicamente intactos. Aisen et al. (2002), por sua vez, ao utilizarem um diluidor tris isotônico, com menos gema de ovo 10% x 20% e sem antioxidante, observaram que os danos causados à membrana plasmática durante a criopreservação, foram elevados (P<0,05) nos espermatozoides congelados. Resultados semelhantes ao deste estudo foram obtidos por Moraes et al. (2015) ao avaliarem a associação dos antioxidantes trolox, ácido ascórbico e melatonina. Maia et al. (2009) e Silva et al. (2011), ambos em sêmen de carneiros, com as sondas fluorescentes supracitadas, observaram cerca de 30% de espermatozoides com membrana plasmática íntegra.

4 Desta forma, podemos presumir que o uso de 0,25% de ácido ascórbico elevou a capacidade de produção dos antioxidantes enzimáticos GSH, CSH-Px e catalase, reduzindo o potencial de lipoperoxidação lipídica, durante o processo de congelamento e descongelamento (HU, et al., 2011). Conclusão A adição de 0,25% de ácido ascórbico no sêmen fresco de carneiros melhorou a integridade da membrana plasmática de espermatozoides de ovinos após descongelamento. Referências Bibliográficas AISEN, E.G.; MEDINA, V.H.; VENTURINO, A. Cryopreservation and postthawed fertility of ram semen frozen in different trehalose concentration. Theriogenology, Philadelphia-PA, v.57, p , AZEVEDO, H.C. Integridade e funcionalidade dos espermatozóides ovinos submetidos à criopreservação após a incorporação de colesterol, desmosterol, ácido oléico-linoleico e a- lactoalbumina. Botucatu, p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu. CASTILHO, F. E.; GUIMARÃES, D. J.; MARTINS, F. L. et al. Uso de própolis e ácido ascórbico na criopreservação do sêmen caprino. Revista Brasileira de Zootecnia, Minas Gerais-MG, v.38, n.12, p , HU, J. H.; ZHAO, X. K.; TIAN, W. Q. et al. Effects of vitamin E supplementation in the externder on frozen-thawed bovine semen preservation. The Animal Consortium, Chesterfield-MO, v. 5, p , ISACKENKO, E.; ISACKENKO, V.; KATKOV, I.I. et al. DNA integrity motility of human spermatozoa after standard slow freezing versus cryoprotectant-free vitrification. Human Reproduction., Oxford-GB, v. 19, n.4, p , MAIA, M. S.; BICUDO, S. D.; AZEVEDO, H. C. et al. Motility and viability of ram sperm cryopreserved in a Tris-egg yolk extender supplemented with anti-oxidants. Small Ruminant Research. Jefferson City-MO, v. 85, p , MORAES, E. A.; SOUZA, W. L.; COSTA, J. M. S. et al. Antioxidants improve membrane integrity and acrosome and sperm mitochondrial activity in ram sperm after cryopreservation. In: ADSA - ASAS, JOINT ANNUAL MEETING-JAM, 2015, Orlando-FL. J. Anim. Sci. Vol. 93, Suppl. s3/j. Dairy Sci. Vol. 98, Suppl. 2. Orlando- FL, p SAEG Sistema para análises estatísticas, versão 9.1: Fundação Arthur Bernardes UFV Viçosa, 2007.

5 SALAMON, S.; MAXWELL, W.M.C. Frozen storage of ram semen I. processing, freezing, thawing and fertility after cervical insemination. Animal Reproduction Science, Amsterdam-NL, v. 37, p , SILVA, J. C. Criopreservação de sêmen ovino com diferentes concentrações espermáticas associado ou não com ácido ascórbico. Viçosa, p. Tese (Doutorado em zootecnia). Universidade Federal de Viçosa. SILVA, S.V.; SOARES, A.T.; BATISTA, A.M. et al. In Vitro and In Vivo Evaluation of Ram Sperm Frozen in Tris Egg-yolk and Supplemented with Superoxide Dismutase and Reduced Glutathione. Reproduction in Domestic Animals, Berlin, v. 46, p , SOUZA, W. L.; LIMA, D. I. B.; MORAES, E. A. et al. Adição de diferentes concentrações de crioprotetores e gema de ovo sobre a motilidade espermática progressiva de ovinos após a criopreservação. In: XXV Congresso Brasileiro de Zootecnia-ZOOTEC, 2015, Fortaleza-CE. Anais do XXV Congresso Brasileiro de Zootecnia v. 25. Palavras chave: carneiro. criopreservação. fluorescência. Key words: ram, cryopreservation. fluorescence. Tabela 1. Percentual de integridade da membrana plasmática (imp) de espermatozoides de carneiros criopreservados acrescidos ou não de diferentes antioxidantes Parâmetros Grupos experimentais espermáticos Controle TRO 100µL TRO 200µL AA 0,05% AA 0,25% imp 22,04±6,9 bc 18,80±6,9 c 23,67±6,9 bc 27,17±6,9 b 37,0±6,9 a TRO= Trolox C; AA= Ácido ascórbico. Médias com letras diferentes sobrescritas na mesma linha diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). O presente estudo foi submetido ao Comitê de Ética e Deontologia em Estudos e Pesquisas CEDEP/UNIVASF, registrado com o protocolo de número 0005/