UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MÔNICA ALINE PARENTE MELO MACIEL CINÉTICA ESPERMÁTICA, CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN E COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DE DIFERENTES ESPÉCIES DE PEIXES CHARACIFORMES FORTALEZA - CEARÁ

2 MÔNICA ALINE PARENTE MELO MACIEL CINÉTICA ESPERMÁTICA, CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN E COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DO PLASMA SEMINAL DE DIFERENTES ESPÉCIES DE PEIXES CHARACIFORMES Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. José Ferreira Nunes. FORTALEZA - CEARÁ

3 Dados Internacionais de Catalográfica na Publicação Universidade Estadual do Ceará Sistema de Bibliotecas Maciel, Mônica Aline Parente Melo. Cinética espermática, criopreservação do sêmen e composição bioquímica do plasma seminal de diferentes espécies de peixes Characiformes [recurso eletrônico] / Mônica Aline Parente Melo- Maciel CD-ROM: 4 ¾ pol. CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico com 92 folhas, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm). Tese (doutorado) - Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de concentração: Reprodução e sanidade animal. Orientação: Prof. Ph.D. José Ferreira Nunes. Coorientação: Profa Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley. 1. Colossoma macropomum. 2. Piaractus brachypomus. 3. Prochilodus brevis. 4. Sperm Class Analyzer. 5. Água de Coco em Pó. I. Título. 3

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5 RESUMO O tambaqui, a pirapitinga e a curimatã são espécies de interesse econômico e ecológico. Diante disto, diversas pesquisas em relação a sua reprodução são realizadas no Brasil. Esse trabalho tem por objetivo avaliar a cinética espermática, criopreservação do sêmen e bioquímica do plasma do plasma de diferentes espécies de peixes Characiformes. Todos os animais foram induzidos a espermiação com extrato hipofisario de carpa. Esse trabalho foi executado em 3 experimentos. No experimento 1 foi realizado a criopreservação utilizando o sêmen de 30 machos de tambaqui para a constituição de 14 pools. Tais pools foram criopreservados em 5 tratamentos compostos de Água de coco em Pó adicionada de dimetilsulfóxido e/ou Aloe Vera (5% ou 10%). Após 30 dias, as amostras foram descongeladas e analisadas. No experimento 2, para a análise da cinética em diferentes tempos após ativação, o sêmen de 18 tambaquis, 17 curimatãs e 19 pirapitingas foram coletados e analisados objetivamente 10, 30, 60 e 120 segundos após a ativação com NaCl (50mM). No experimento 3, o efeito da estacionalidade sobre a cinética, características físicas e químicas do sêmen e bioquímica do plasma seminal, foi avaliada utilizando 12 pirapitingas e 9 tambaquis. Os resultados do experimento 1 mostram que a adição de Aloe vera levou a uma redução significativa de espermatozoides móveis independente da sua concentração. No experimento 2 foi observado o mesmo padrão de motilidade para as 3 espécies testadas. A motilidade aos 10 segundos foi similar a 30 segundos. Houve uma redução significativa aos 60 segundos e uma outra redução, mais acentuada, aos 120 segundos. No experimento 3 houve redução de volume do sêmen, VSL dos espermatozoides e concentração de cloretos no plasma de tambaqui fora da estação reprodutiva, assim como aumento significativo das concentrações de triglicerídeos dentro da estação. Para pirapitinga foi observado um aumento significativo na concentração de triglicerídeos fora da estação reprodutiva assim como redução da concentração de glicose. Pode-se concluir que o Aloe vera não proporciona melhoria na proteção espermática durante o processo de criopreservação. A taxa de motilidade espermática em diferentes tempos pós ativação muda para cada espécie testada. A composição do plasma seminal de tambaqui e pirapitinga sofre variação estacional. Palavras-chave: SCA. Motilidade. Bioquímica. Plasma. Peixe. 5

6 ABSTRACT Tambaqui, pirapitinga and curimatã are species of economic and ecological interest. Given this, several studies regarding its reproduction are carried out in Brazil. This study aims to evaluate the sperm kinetics, semen cryopreservation and biochemistry of seminal plasma of different species of fish Characiformes. All animals were induced to spermiation with pituitary extract of carp. This work was performed in 3 experiments. In experiment 1 was performed using semen cryopreservation 30 males tambaqui for the establishment of 14 pools. These pools were cryopreserved in 5 treatments composed of powder coconut water added in dimethylsulfoxide and / or Aloe Vera (5% or 10%). After 30 days, the samples were thawed and analyzed. In experiment 2, to analyze the kinetics at different times after activation, the semen tambaquis 18, 17 and 19 curimatãs pirapitinga were collected and objectively analyzed 10, 30, 60 and 120 seconds after activation with NaCl (50 mm). In experiment 3, the effect of seasonality on the sperm kinetics, physical and chemical characteristics of the semen and the biochemical seminal plasma was measured using 12 pirapitinga and 9 tambaquis. The results of experiment 1 indicate that the addition of Aloe vera has led to a significant reduction of moving independently of concentration of Aloe vera. In experiment 2 was observed the same pattern of motility for the 3 species tested. Motility was similar for 10 seconds to 30 seconds. There was a significant reduction at 60 seconds and a further reduction, more marked after 120 seconds. In experiment 3 decreased volume of semen, VSL of spermatozoa and chloride concentration in plasma tambaqui outside the breeding season, as well as significant increase in triglyceride concentrations inside the season. To pirapitinga was a significant increase in the concentration of triglycerides outside the breeding season as well as reducing the concentration of glucose. It can be concluded that Aloe vera provides no improvement in sperm protection during the cryopreservation process. Sperm motility rate at different times after activation changes for each species tested. The composition of the seminal plasma tambaqui and pirapitinga suffers seasonal variation. Key-words: SCA. Motility. Biochemistry. Plasma. Fish. 6

7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figure 1 - VCL, VSL and VAP in m s -1 of P. brevis, C. macropomum and P. brachypomus species at 10, 30, 60 and 120 s post-activation. Velocities followed by different letters are significantly different at p<

8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Motilidade como método de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado de Characiformes brasleiros Tabela 2 - Morfopatologias e morfometria como métodos de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado e Characirfomes brasileiros Tabela 3 - Fertilização como método de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado de Characiformes brasileiros Tabela 4 - Motilidade e velocidades espermáticas do sêmen de tambaqui criopreservado em ACP-104 adicionado de diferentes crioprotetores (média ± desvio padrão) Tabela 5 - Percentage of spermatozoa motility at 10s, 30s, 60s, 120s post activation of C. macropomum (n = 17), P. brachypomus (n=19) and P. brevis (n=18) species. Different letters in columns are significantly different at p< Tabela 6 - Características físicas, químicas, cinéticas e bioquímicas do sêmen de tambaqui dentro e fora da estação reprodutiva...66 Tabela 7 - Características físicas, químicas, cinéticas e bioquímicas do sêmen de pirapitinga dentro e fora da estação reprodutiva

9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACP-104 Água de coco específica para peixe ANOVA Análise de Variância ASMA Análise da morfologia espermática auxiliada por computador AV Aloe vera BTS Beltsville Thawing Solution CASA Análise do Sêmen Assistida por Computador (Computer Assisted Sperm Analyses) CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais CPAq Centro de Pesquisas em Aquicultura DMSO Dimetilsulfóxido DNOCS Departamento Nacional de Obras Contra as Secas EHC Extrato Hipofisário de Carpa FSH Hormônio Folículo Estimulante (Folicle Stimulant Hormone) GLM Modelos Lineares Generalizados (General Linear Model) GnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas (Gonadotrophin-Releasing Hormone) GnRHa Análogo do hormônio liberador de gonadotrofina (Gonadotrophin-Releasing Hormone analogue) hcg Gonadotrofina Coriônica Humana (human Chorionic Gonadotrophin) LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes LH Hormônio Luteinizante (Luteinizing Hormone) LHRHa Análogo do hormônio liberador de hormônio luteinizante (Luteinizing Hormone Releasing Hormone Analogue) LIN Linearidade (Linearity) MG Metil glicol µl Microlitro mm milimolar NaCl Cloreto de sódio NaHCO3 Bicarbonato de sódio NIB Núcleo Integrado de Biotecnologia 9

10 ph SAS SCA sgnrha SNK STR Tab. UECE VAP VCL VSL Potencial Hidrogeniônico Statistical Analysis System Sperm Class Analyser Análogo do hormônio liberador de gonadotrofina de salmão (salmon s Gonadotrophin-Releasing Hormone analogue) Student Newman Keuls Retilinearidade (straightness) Tabela Universidade Estadual do Ceará Velocidade média do percurso (Average Path Velocity) Velocidade Curvilinear (Curvilinear Velocity) Velocidade Progressiva Linear (Straight Line Velocity) 10

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Espécies Características do sêmen Bioquímica do plasma seminal Conservação seminal Diluidores para sêmen de peixes Avaliação seminal pós-descongelação Cinética espermática JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL Objetivos específicos CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

12 1 INTRODUÇÃO O Prochilodus brevis, (curimatã), Colossoma macropomum (tambaqui) e Piaractus brachypomus (pirapitinga) são peixes da ordem Characiformes e são nativos da América do Sul. Os characiformes têm importância comercial como peixes ornamentais, culinária, aquicultura e pesca esportiva (NASCIMENTO et al., 2012;GODINHO;VIVEIROS, 2011). Devido a importância dessas espécies, são necessários mais estudos sobre a fisiologia reprodutiva principalmente em relação aos apectos que envolvem a caracterização e manipulação do sêmen. Antes da espermiação, os espermatozoides de peixe são armazenados em estado imóvel nos testículos. A motilidade é associada a sensibilidade a osmolaridade e a concentração de íons no meio onde o sêmen é liberado (ALAVI; COSSON, 2006). A motilidade espermática em peixes de água doce é iniciada em meios hiposmóticos em relação ao fluido seminal (COSSON, 2010). Após o início da motilidade, os espermatozoides se tornam móveis e metabolicamente ativos porém, por pouco tempo. Após esse período, os espermatozoides se tornam incapazes de fertilizar o óvulo (CARNEIRO, 2007). Além disso, para o sucesso na avaliação da habilidade reprodutiva de diferentes espécies de peixes, o conhecimento dos constituintes físicos e químicos do sêmen é necessário (BOZKURT at et., 2011). Dentre eles, o plasma seminal tem influência sobre a qualidade do sêmen (BOZKURT at et., 2011) e papel vital no metabolismo espermático, função, sobrevivência e motilidade espermática (BILLARD et al., 1995). A determinação da composição do plasma seminal também pode ajudar a entender os pré-requisitos necessários à preparação de soluções apropriadas de plasma seminal artificial a serem usadas na inseminação artificial ou estocagem de sêmen. No entanto, para que se obtenha bons resultados existem algumas características espécie-específicas que devem ser levadas em consideração em termos de composição mineral e orgânica do plasma seminal (BOZKURT at et., 2011). Além de diferenças na composição do plasma seminal entre espécies, alguns autores relatam que os resultados são sujeitos a variação sazonal (ARAMLI et al., 2013). Uma outra área em ascensão na reprodução animal é a criopreservação do sêmen, tanto para a produção em aquicultura como para preservação de material 12

13 genético em programas de conservação (CAROLSFELD et al., 2003). Vários estudos mostram que a criopreservação é uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes, tendo em vista que seus benefícios são variados, dentre eles: sincroniza a disponibilidade dos gametas; facilita o transporte e evita envelhecimento dos mesmos; conserva a variabilidade genética; reduz os custos de manutenção do plantel de reprodutores; possibilita trocas de material genético entre laboratórios; dentre outros (CARNEIRO, 2007)., 13

14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Espécies O Colossoma macropomum (tambaqui),piaractus brachypomus (pirapitinga) e Prochilodus brevis (curimatã) são peixes Characiformes e são nativos da América Latina. Os Characiformes tem importância comercial como espécies ornamentais, aquicultura e pesca esportiva (RAMIREZ-MERLANO et al., 2011; GURGEL et al., 2012; GODINHO; VIVEIROS, 2009). Entre as espécies nativas de água doce, o tambaqui representa atualmente a maior produção na aquicultura brasileira, superado somente pelas espécies exóticas tilápia (Oreochromis niloticus) e carpa (Cyprinus carpio) (RECURSOS ), devido às suas excelentes características, como rusticidade ao manejo, rápido crescimento, com forte apelo esportivo e culinário (KUBITZA, 2004). É um peixe originário da bacia amazônica, nativo dos rios Solimões, Madeira e Orinoco e seus afluentes, com larga distribuição nesses rios, e em áreas próximas a Manaus. Na natureza há registros de que esse peixe atinge peso ao redor de 30 kg, sendo considerado o segundo maior peixe de escamas da bacia Amazônica, perdendo em porte somente para Arapaima gigas (pirarucu) (KUBITZA, 2004). Diante da importância econômica e ecológica, o tambaqui foi selecionado como uma das espécies aquáticas de maior interesse para pesquisa no Brasil (QUEIROZ et al., 2002). A pirapitinga é um peixe originário das bacias dos rios Amazonas e Orinoco (RAMIREZ-MERLANO et al., 2011). Tem grande importância econômica em escala comercial em diversos países da América do Sul (Brasil, Colômbia, Peru, Venezuela) e América Central (NASCIMENTO et al. 2010). Tanto o tambaqui como a pirapitinga têm hábitos onívoros, boa qualidade de carne e conversão alimentar, docilidade, resistência a doenças, mostrando assim excelentes condições de cultivo (RAMIREZ- MERLANO et al. 2011; ARAÚJO-LIMA; GOMES 2005). O Prochilodus brevis é uma espécie de peixe endêmica da região semi-árida do Brasil (CHELLAPPA et al., 2009) e é regionalmente conhecida como curimatã. Apesar de ser considerada economicamente importante no nordeste do Brasil, existem poucos conhecimentos sobre sua reprodução. 14

15 A desova dessas espécies é anual e total, e ocorrem de outubro a março, correspondente a época das enchentes dos rios, onde irão migrar do habitat de alimentação para o habitat reprodutivo (piracema) caracterizando-o como um peixe reofílico (VIEIRA et al., 1999). Essa migração é necessária, pois os estímulos ambientais e/ou sociais estimulam as gônadas e a produção de hormônios esteróides. Se tais estímulos não acontecem, há um bloqueio da ovulação nas fêmeas e uma baixa produção de sêmen nos machos (ROMAGOSA, 2009). Portanto, em cativeiro, os peixes reofílicos não se reproduzem naturalmente sendo necessária a indução hormonal da reprodução (ZANIBONI-FILHO; WEINGARTNER, 2007). O principal agente indutor aplicado em espécies nativas brasileiras é o extrato hipofisário de carpa (EHC) (ZANIBONI-FILHO; WEINGARTNER, 2007). Este proporciona a obtenção de sêmen de qualidade e um volume maior (VIEIRA, 2010). 2.2 Características do sêmen A produção espermática de peixes é muito alta, devido ao grande número de divisões espermatogoniais (BILLARD, 1995) e muito variada. Em algumas espécies o macho produz 100 bilhões de espermatozoides/ano/kg do peso corporal ou mais de 1 x 10 9 espermatozóides/g de testículo/dia, o que é 10 vezes maior do que a produção relatada para mamíferos (BILLARD; COSSON, 1992). Em tambaqui, Menezes et al., (2008) relataram uma concentração espermática de 35 x 10 9 espermatozóides/ml sêmen. Os espermatozóides de peixes teleósteos de água doce, quiescentes na osmolaridade do plasma seminal (condição isotônica de aproximadamente 300mOsmol/kg) começam a se mover quando suspensos em solução hipotônica (<300 mosml/kg) e exibem alta mobilidade em água doce (4 mosml/kg). De modo oposto os espermatozóides de teleósteos marinhos começam a se mover quando liberados em solução hipertônica (>300 mosmol/kg), e exibem sua mais alta qualidade aproximadamente em 1000 mosmol/kg, que é o equivalente ao encontrado na água do mar (MORISAWA; SUZUKI, 1980). Outra peculiaridade dos espermatozóides da maioria dos peixes, é o fato de não possuírem acrossoma (MARIA et al 2010), pois não precisam desta estrutura para a fecundação porque, ao serem liberados no meio, entram diretamente no ovócito através de um orifício chamado micrópila. No entanto, a duração da motilidade espermática em 15

16 teleósteos de água doce é muito curta, sendo de menos de um minuto em Brycon orthotaenia (MELO; GODINHO, 2006). Essa duração da motilidade espermática tem grande importância para a fertilização na natureza, pois os espermatozoides expelidos na água precisam encontrar e entrar na micrópila antes desta fechar-se pela hidratação. Portanto, um dos principais problemas limitantes de pesquisas em motilidade espermática de peixes consiste nessa curta duração, dificultando a avaliação (COSSON et al., 1999). 2.3 Bioquímica do plasma seminal O sêmen é definido como plasma seminal mais espermatozoides. O plasma seminal tem composição única, contendo substancias de suporte a viabilidade das células espermáticas e algumas substâncias refletem a função do sistema reprodutivo e dos espermatozoides (CIERESZKO, 2007). Estudos sobre peixes teleósteos revelam que os testículos, ducto testicular principal e ductos espermáticos estão envolvidos na produção do plasma seminal (LAHNSTEINER et al. 1993). Tal plasma tem como função primordial imobilizar e nutrir os espermatozoides até o momento da sua liberação no meio aquático. O plasma seminal é um importante constituinte do sêmen e tem papel vital no metabolismo, função, sobrevivência e motilidade espermática. Sua composição tem boa influência sobre a qualidade biológica do sêmen e a determinação da sua composição pode ajudar no entendimento dos itens necessários para o preparo de soluções de plasma artificial apropriado (BOZKURT et al., 2011). Conhecimentos sobre a bioquímica do plasma seminal também pode ser usado para selecionar machos maduros de alta qualidade para fertilização de óvulos em operações comercial na aquicultura e, como resultado, reduzir o número de machos no plantel, aumentando a eficiência econômica. O plasma seminal de salmonídeos tem sido cuidadosamente estudado, particularmente a truta arco-íris e o salmão(munkittrick; MOCCIA, 1987; LAHNSTEINER et al., 1998). No entanto, por possuirem caracteristicas especieespecificas, a composição do plasma seminal deve ser avaliada em cada espécie a ser trabalhada. Algumas diferenças podem ser devido a atividade secretória dos órgãos reprodutivos acessórios(ducto testicular principal e ductos espermáticos) (ALAVI et al. 16

17 2004). Além disso, tem sido frequentemente reportado que a composição iônica do plasma seminal depende do tipo de hormônio utilizado para indução da espermiação (ex.: hormônio hipofisário de carpa), dose do tratamento hormonal (1-3 mg/kg de peso vivo), tempos entre a indução hormonal e espermiação (14-18h) e frequência da espermiação (intervalo superior a 30 dias) (PIROS et al. 2002; ZHANG et al. 2003; LINHART et al. 2003; ALAVI; COSSON, 2006; PSENICKA et al. 2008). A maioria dos estudos sobre bioquímica do plasma seminal de peixes observa os ions, como cloretos (Cl - ) e cálcio (Ca2 + ), pois estão envolvidos na regulação da motilidade espermática, na contribuição na composição iônica intracelular ou com seu efeito osmótico (LINHART et al. 1991; BILLARD; COSSON 1992; ALAVI; COSSON, 2006). Dentre as substâncias orgânicas, a glicose está presente na maioria dos estudos pois é a maior fonte energética para os espermatozoides (BAJPAI et al. 1998). Além da glicose, os espermatozoides também podem contar com a frutose e os triglicerídeos (LAHNSTEINER et al. 1993). 2.4 Conservação seminal São muitas as razões que justificam a importância do uso de técnicas para o armazenamento de sêmen de peixes, tanto ligadas às questões ambientais quanto econômicas. A pesca em período de reprodução e a construções de barragens são uns dos fatores que estão levando ao declínio dos estoques de peixes, especialmente das espécies de piracema (migratórias). A utilização e a implantação de bancos genéticos, incluindo o congelamento de sêmen, constituem soluções potenciais para minimizar perdas decorrentes da ação do homem sobre os peixes nativos, garantindo a diversidade genética tanto para os programas de repovoamento, como para a produção comercial. Amostras de sêmen de peixes obtidos na natureza poderiam ser criopreservadas e parte delas utilizada nos procedimentos de desova artificial para repovoamento. O restante poderia ser mantido em bancos genéticos para a conservação desses materiais (SHIMODA et al., 2004). Segundo Viveiros e Godinho (2009), pode ser citada uma série de benefícios relacionados ao desenvolvimento das técnicas de criopreservação de gametas, tais como: a recuperação de estoques silvestres ameaçados de extinção; 17

18 a redução do número de reprodutores (machos) utilizados em programas de propagação artificial com consequente redução dos custos; a eliminação do problema da assincronia na maturidade gonadal entre reprodutores, principalmente das espécies migratórias (ou de piracema) quando machos e fêmeas não estão preparados simultaneamente para a reprodução; o estabelecimento de programas de melhoramento genético com a utilização de machos selecionados ou manipulados geneticamente (triplóides, transgênicos); a facilidade de transporte, difusão e troca de material genético entre organizações atuantes na área com risco reduzido de transmissão de patógenos; o fornecimento de materiais genéticos para a identificação de populações ou estoques por meio de técnicas de biologia molecular; o estabelecimento de programa de hibridização utilizando espécies com períodos reprodutivos diferentes. Portanto o congelamento de sêmen em nitrogênio líquido constitui uma forma de manutenção dos gametas masculinos por longos períodos. Este fato torna a criopreservação espermática, cada vez mais, uma importante técnica para a aquicultura. Esta técnica vem produzindo importantes resultados na preservação a longo prazo do sêmen de algumas espécies de peixes Characiformes das família Prochilodontidae, Anostomidae e Characidae. 2.5 Diluidores para sêmen de peixes Para a congelação do sêmen é necessário a adição de um diluidor, composto por diluente(s) e crioprotetor(es). O diluidor deve manter a viabilidade da célula e prevenir as crioinjúrias durante a congelação e descongelação. Portanto, condições mínimas são requeridas para que um diluente seja adequado, tais como: isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade espermática; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen; condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os espermatozóides; esterilidade, ou seja, não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas. É importante que a motilidade dos espermatozóides não seja ativada antes da congelação e nem durante a descongelação, 18

19 pois pode exaurir a reserva energética necessária à fertilização (LEGENDRE & BILLARD, 1980). Além disso, o diluente deve conter nutrientes como fonte de energia, aumentar o volume do sêmen e, finalmente, servir de carreador de crioprotetores. Em relação aos crioprotetores, estes podem ser classificados como intracelulares e extracelulares. Os crioprotetores intracelulares atuam desidratando e reduzindo o ponto crioscópio do interior das células dificultando a formação de cristais de gelo intracelulares que danificam a célula. Os crioprotetores extracelulares auxiliam na proteção celular recobrindo a superfície da célula e estabilizando a membrana (WATSON, 1995). Em estudo de criopreservação de sêmen de Characiformes, o crioprotetor interno mais utilizado é o dimetilsulfóxido (DMSO) que já foi testado com sucesso para várias espécies como B. cephalus 68% de motilidade(ninhaus-silveira et al., 2006); B. insignis 86% de motilidade (SHIMODA et al., 2004),B. orthotaenia 89% de motilidade(melo; GODINHO, 2006); P. brachypomus 51% de motilidade(nascimento et al., 2010), C. macropomum -55% de motilidade (VIEIRA, 2010). Uma das inovações mais recentes da biotecnologia do sêmen de peixe é a utilização de água de coco como meio diluente seminal, pois é um meio natural e estéril composto por sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular e diversos eletrólitos, podendo exercer uma ação benéfica sobre a conservação celular. Trabalhos realizados por Nunes (1987) demonstraram a viabilidade da água de coco como diluente de refrigeração e congelação do sêmen caprino, o que levou à elaboração de um meio comercial de conservação, padronizado e estabilizado, à base de água de coco em pó (ACP - ACP Biotecnologia, Brasil). A água de coco sob a forma de pó apresenta os mesmos constituintes bioquímicos da forma in natura, porém é padronizada e mais eficazmente conservada, o que facilita sua comercialização para regiões onde o fruto não existe (SILVA et al., 2006). A ACP foi testado inicialmente como diluidor de sêmen de caprino (SALGUEIRO et al., 2002), e mais recentemente foi adaptado para a criopreservação de sêmen de peixes, recebendo a classificação de ACP-104 (específico para peixes). O ACP-104 já foi testado com sucesso em várias espécies como B. orbignyanus, P. lineatus, L. obtusidens 19

20 (VIVEIROS et al., 2010), P. brachypomus (VELÁSQUEZ-MEDINA, 2008) e C. macropomum (VIEIRA, 2010). Outro produto de origem vegetal que possui componentes que podem fornecer nutrição e proteção para células espermáticas é o extrato de Aloe vera. Segundo Veloso e Peglow (2003), estre produto possui glicose, galactose, xilose, tanino, esteróides, ácidos orgânicos, substâncias antibióticas, enzimas de vários tipos, resíduos de açúcar, uma proteína com 18 aminoácidos, vitaminas, minerais, sulfato, ferro, cálcio, cobre, sódio, potássio e manganês. Relatos na literatura utilizando o gel de Aloe vera são datados da década de 80, quando Rodriguez et al. (1988) utilizaram o gel desta planta para substituir o diluidor seminal na inseminação cervical e intrauterina em ovelhas. Por conseguinte, em 2006, Gutiérrez e colaboradores utilizaram a Aloe vera para congelação do sêmen ovino encontrando resultados satisfatórios de qualidade seminal. Melo (2010) utilizou o extrato bruto de Aloe vera em combinação com o ACP para conservação de sêmen caprino a 4ºC, e observou que esta combinação foi capaz de manter a qualidade espermática em até 48 horas. Além disso, concluiu que este produto pode ser considerado um crioprotetor eficiente na conservação das células espermáticas de machos caprinos, em substituição à gema de ovo, para sua posterior utilização nos processos de criopreservação. Não há relatos da utilização de Aloe vera na conservação de sêmen de peixes, o que gera o interesse para o estudo dos efeitos deste produto. 2.6 Avaliação seminal pós-descongelação Cinética espermática A taxa de espermatozoides móveis é o critério mais utilizado para avaliar a qualidade seminal após o descongelação. Viveiros et al. (2011) relataram que a taxa de motilidade do sêmen descongelado de dourado (Salminus brasiliensis) revelava o número de espermatozoides com membranas intactas, demonstrando a íntima relação da motilidade com a viabilidade espermática e com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes. Geralmente essa avaliação é feita de forma subjetiva, na qual o avaliador deve estimar uma taxa de espermatozoides móveis numa escala de 0 a 100% (TAITSON et al., 2008). Alguns pesquisadores utilizam uma escala de 1 a 5 que representam escores referentes à qualidade do movimento, também chamado de vigor espermático (0=sem movimento; 5=espermatozoides nadando rapidamente) (VIVEIROS et al., 2011). 20

21 Atualmente os métodos objetivos de avaliação da motilidade seminal têm sido considerados mais relevantes na pesquisa em reprodução. Usando imagens digitais da trajetória de cada célula espermática, o SCA (Sperm Class Analyser) pode analisar, além das taxas de motilidade, as propriedades de trajetória e velocidade dos espermatozoides: VCL= velocidade curvilinear; VSL= velocidade em linha reta; VAP = velocidade média (VERSTEGEN et al., 2002). Essas velocidades vêm sendo relacionadas com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes, principalmente a VCL (VIVEIROS et al., 2011). Em estudos de criopreservação de sêmen de Characiformes, o SCA já foi utilizado para analisar a motilidade espermática pós-descongelação de algumas espécies Characiformes como P. brachypomus (NASCIMENTO et al., 2010), P. lineatus(viveiros et al., 2010) e C. macropomum (LEITE et al., 2011). 21

22 3 JUSTIFICATIVA Os peixes characiformes têm importância comercial como peixes ornamentais, culinária, aquicultura e pesca esportiva. Seus espermatozoides se encontram imóveis no testículo e adquirem motilidade quando entram em contato com soluções hiposmóticas em relação ao plasma seminal. No entanto, essa motilidade cessa após poucos minutos. Assim é importante o conhecimento sobre a motilidade espermática durante o período em que os espermatozoides estão ativos. Mas, apesar da importância econômica e ecológica do tambaqui, pirapitinga e curimatã não se sabe a qualidade espermática dessas espécies em diferentes tempos após a ativação. Espécies characiformes como o tambaqui e a pirapitinga são peixes de piracema e para se reproduzirem em cativeiro o ano todo são necessários estímulos como a indução hormonal. No entanto, não existem trabalhos que avalie as características físicas e químicas do sêmen, a cinética espermática e a bioquímica do plasma seminal dessas espécies afim de saber se existem variações de acordo com a estação reprodutiva. Devido o grande interesse comercial por espécies characiformes como o tambaqui, é observada uma redução dos seus estoques naturais, encontrando-se em sobre pesca. A criopreservação do sêmen é uma biotécnica que permite a conservação de espécies ameaçadas de extinção. E apesar de existirem experimentos de criopreservação de sêmen de tambaqui, ainda não foram realizados testes de criopreservação utilizando oaloe vera na composição do diluente. Dessa forma não se sabe quais os efeitos do Aloe vera sobre a motilidade e morfologia dos espermatozoides pós descongelação. 22

23 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA O Aloe Vera protege a célula espermática de tambaqui contra danos causados pelo frio durante o processo de criopreservação. Os espermatozóides de tambaqui, curimatã e pirapitinga se mantem com altas taxas de motilidade e velocidades espermáticas até 2 minutos após a ativação. A composição do plasma seminal de tambaqui e pirapitinga sofre influencia da estação reprodutivamesmo em cativeiro. 23

24 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a cinética espermática, criopreservar o sêmen e verificar a composição bioquímica do plasma seminal de diferentes espécies de peixes Characiformes 5.2 Objetivos específicos Comparar a motilidade e morfologia espermática do sêmen fresco e pós descongelação de tambaqui criopreservado com Aloe vera; Observar se existe correlação entre os parâmetros cinéticos e morfológicos do sêmen de tambaqui fresco e criopreservado com Aloe vera; Verificar a cinética espermática de tambaqui, pirapitinga e curimatã 10, 30, 60 e 120 segundos após a ativação; Determinar as concentrações de cálcio (Ca2 + ), cloretos (Cl - ), triglicerídeo, glicose e frutose no sêmen de tambaqui e pirapitinga e observar se há influência da estação reprodutiva na constituição do plasma seminal; Verificar se há correlação entre os parâmetros bioquímicos do plasma seminal, cinética espermática e aspectos físicos e químicos do sêmen, de tambaqui e pirapitinga. 24

25 6 CAPÍTULO 1 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE CHARACIFORMES BRASILEIROS (Methods for evaluating the quality of cryopreserved sperm from brasilian Characiforms) Mônica Aline Parente MELO-MACIEL, Carminda Sandra Brito SALMITO- VANDERLEY, Liliane Veras LEITE, Cassia Evangelista de OLIVEIRA, Mayara Setúbal OLIVEIRA, Júlia Trugilio LOPES, José Ferreira NUNES Artigo publicado no periódico Ciência Animal em

26 RESUMO A criopreservação de gametas traz inúmeras vantagens para a produção e a reprodução de diversas espécies, porém esta técnica promove danos estruturais às células que prejudicam os resultados de fertilização. Vários métodos são empregados para avaliar a conservação seminal entre elas motilidade, morfopatologias, morfometria e fertilização. O primeiro método é mais comumente utilizado, pois é uma técnica rápida de avaliar a qualidade seminal, o segundo e o terceiro permitem avaliar os danos morfológicos causados pelo processo de criopreservação, porém o último é a técnica mais segura para garantir que a metodologia de conservação gamética foi satisfatória. Palavras-Chave: congelação, motilidade, morfologia, fertilização. ABSTRACT The cryopreservation of gametes brings many advantages for the production and reproduction of many species, but this technique promotes structural damage to the cells that affect the results of fertilization. Various methods are employed to assess the conservation seminal including motility, morfophatology, mophorlogy and fertilization. The first method is more, commonly used because it is a rapid technique to assess sperm quality, the second and third to assess morphological damage caused by the cryopreservation process, but the latter is the safest technique to ensure that the methodology of conservation gametic was satisfactory. Keywords: freezing, motility, morphology, fertilization. INTRODUÇÃO A capacidade técnica de preservação de gametas e embriões de peixes e de invertebrados aquáticos tem se expandido rapidamente nos últimos anos, impulsionada, primariamente, pela indústria aquícola e pela exigência social (Miliorini, 2006). A busca por técnicas cada vez mais apuradas de preservação de sêmen de peixes vem ao encontro às questões econômicas e ecológicas atuais, sejam elas em programas de melhoramento genético ou de conservação da biodiversidade (Streit Jr et al., 2009), dessa forma, a aplicação dessa técnica em peixes está em amplo desenvolvimento (Murgas et al., 2007). 26

27 A criopreservação constitui uma biotécnica importante na rotina da reprodução induzida por, sobretudo, acelerar a melhoria genética de espécies de peixe, sendo ainda indicada para minimizar a assincronia na maturação dos gametas, no uso seletivo de reprodutores ou mesmo no transporte de gametas (Godinho, 2000). No entanto, os processos de congelamento e descongelamento levam a uma redução do número de espermatozoides normais, além de reduzir a taxa de motilidade e vigor, dificultando a fertilização (Salmito-Vanderley, 2010). Diante disso, vários métodos são utilizados para avaliar a qualidade seminal pós-descongelamento, uma vez que a avaliação das características seminais são imprescindíveis na rotina de reprodução artificial em qualquer espécie (Murgas et al., 2011). Na presente revisão são abordados os principais métodos utilizados para avaliar a qualidade do sêmen de Characiformes após o processo de criopreservação na última década. Motilidade Espermática A taxa de espermatozoides móveis é o critério mais utilizado para avaliar a qualidade seminal após o descongelamento (Tab 1) (Murgas et al., 2011). Além da taxa de espermatozoides móveis, outro critério importante para o sucesso da reprodução é a duração da motilidade, pois normalmente os espermatozoides de teleósteos permanecem móveis por um curto período de tempo, sendo inferior a um minuto (Melo e Godinho, 2006). Essa duração da motilidade espermática tem grande importância para a fertilização, pois os espermatozoides precisam encontrar e penetrar a micrópila do ovócito antes desta fechar-se pela hidratação (Morales, 1986). Muitos fatores podem influenciar o tempo de motilidade dos espermatozoides de peixes como a solução ativadora e sua osmolaridade (Alavi et al., 2009) e temperatura (Billard et al., 1995), estado nutricional e sanitário dos animais, condições de análise e espécie estudada (Murgas et al., 2011). Entre as soluções ativadoras empregadas para avaliar a motilidade do sêmen descongelado de Characiformes, a solução de bicarbonato de sódio 1% (NaHCO3) é a mais comum. A solução de cloreto de sódio (NaCl) em diferentes concentrações também é utilizada com sucesso para ativar sêmen descongelado de Characiformes. As 27

28 concentrações mais comuns são NaCl 0,15% (Melo e Godinho, 2006) e 0,29% (Orfão, 2010). Tabela: 1Motilidade como método de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado de Characiformes brasileiros. Espécie Motilidade Referência P. lineatus 1 Subjetiva Água destilada NaHCO 3 119mM Método de avaliação Solução ativadora P. lineatus 1 Subjetiva P. lineatus 1 Subjetiva SCA ) L. obtusidens 2 Subjetiva L. macrocephalus 2 Subjetiva Água destilada NaHCO 3 60 mm NaHCO mm Água destilada NaCl 25 mm NaCl 50 mm NaHCO3 119mM Milliorini, 2006 Murgas et al., 2007 Viveiros et al., 2009b NaCl 50 mm Viveiros et al., 2010 NaCl 50mM NaHCO3 119 mm NaCl 25mM NaHCO3 119 mm Água destilada Taitson et al, 2008 Ribeiro e Godinho, 2003 S. brasiliensis 3 Subjetiva NaCl 50mM Viveiros et al., 2009a P. brachypomus 3 Subjetiva SCA ) NaCl 50 mm Nascimento et al., 2010 P. mesopotamicus 3 Subjetivo Água destilada Streit Jr et al., 2006 P. brachypomus 3 P. lineatus 1 Subjetiva Objetiva-(CASA- Objetiva-(CASA- Objetiva-(CASA- SCA ) NaCl 50 mm Melo, 2010 B. orbignyanus 3 Subjetiva NaHCO3 119 mm Murgas et al.,

29 B. orbignyanus 3 Subjetiva NaCl 50 mm Maria et al., 2006 B. amazonicus 3 Subjetiva NaHCO3 119 mm Velasco-Santamaria et al., 2006 B. nattereri 3 Subjetiva NaCl 50 mm Oliveira et al., 2007 B. opalinus 3 Subjetiva NaCl 50 mm Orfão et al., 2010 B. insignis 3 Subjetiva NaCl 50mM NaHCO3 119 mm Viveiros et al., 2011 C. macropomun 3 Subjetiva NaHCO3 119 mm Menezes et al., 2008 C. macrompomun 3 Objetiva (CASA-SCA ) NaCl 50mM Vieira, Família Prochilodontidae; 2 Família Anostomidae; 3 Família Characidae. Apesar dos métodos subjetivos serem utilizados rotineiramente, os métodos objetivos de avaliação da motilidade seminal têm sido considerados mais relevantes na pesquisa em reprodução (Oliveira et al., 2007). O sistema de análise seminal auxiliado por computador (CASA) é formado por um microscópio de contraste de fase conectado à uma câmera de vídeo que reproduz imagens para um computador com o software Sperm Class Analyzer (SCA ). Esse programa fornece os meios para uma classificação objetiva e rápida de uma determinada população de espermatozoides. Com a utilização do CASA é possível obter dados com altos níveis de confiança e repetibilidade permitindo a comparação de estudos realizados em diversas partes do mundo. Utilizando imagens digitais da trajetória de cada célula espermática, o CASA analisa, além das taxas de motilidade, as propriedades de trajetória e velocidade dos espermatozoides (Verstegen, Iguer-Ouada e Onelin, 2002). Apesar das inúmeras vantagens da utilização de um sistema computadorizado, seu uso não é rotineiro devido aos altos custos de aquisição do equipamento. Morfopatologias Espermáticas A integridade das estruturas espermáticas (cabeça, peça intermediária e cauda) são essenciais para o bom desempenho dos espermatozoides (Kavamoto et al., 1999). A avaliação da morfologia espermática auxilia, portanto, na definição da qualidade seminal, pois está relacionada ao potencial fertilizante dos espermatozoides. A análise 29

30 da morfologia espermática, muitas vezes, poderá explicar a redução da motilidade do espermatozoide e, por consequência, perda da capacidade fertilizante dos ovócitos (Streit Jr, 2008). Patologias como flagelo dobrado, cabeça isolada, gotas citoplasmáticas proximal e distal são geradas durante a espermatogênese em decorrência de causas que acometem os reprodutores, tais como enfermidades, consanguinidade, restrição alimentar e estresse ambiental, sendo conhecidas como patologias primárias ou maiores. Por outro lado, patologias como flagelo quebrado, enrolado, degenerado, macrocefalia e microcefalia são, geralmente, associadas à coleta e manipulação do sêmen, e são classificados como patologias secundárias ou menores (Herman, Mitchell e Doak, 1994). Esse método deanálise é realizado por meio da observação dos espermatozoides em microscopia óptica, e a classificação da patologia é feita de forma subjetiva. Em estudos de criopreservação de sêmen de Characiformes, poucos trabalhos avaliam a morfologia espermática como critério de definição da qualidade seminal pósdescongelamento (Tab 2). Tabela: 2Morfopatologias e morfometria como métodos de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado de Characiformes brasileiros. Espécie Morfopatologias Morfometria Referência Métodohist Método de Coloração ológico avaliação Miliorini et al., Lâminalamínula coloração Sem P. lineatus Corante Rosa Streit Jr et al., P. mesopotamicus 3 Esfregaço -- Bengala 2006 P. brachypomus ASMA-SCA Melo Família Prochilodontidae; 2 Família Anostomidae; 3 Família Characidae; -- Parâmetro não avaliado Em procedimento de avaliação de sêmen de mamíferos, a morfopatologia dos espermatozoides é considerada um parâmetro importante, e o Colégio Brasileiro de 30

31 Reprodução Animal (1998) recomenda não utilizar, na inseminação artificial ou monta natural de mamíferos, sêmen com índices de espermatozoides com anormalidade acima de 30%, em bovinos e equinos e de 20%, em ovinos e suínos. Para peixes essas referências ainda não foram estabelecidas. Apesar dos processos de criopreservação do sêmen provocarem danos à morfologia espermática, esse método de avaliação dos espermatozoides é pouco observado em estudos de criopreservação do sêmen de peixes. Sugere-se, portanto, que os exames morfopatológicos dos espermatozoides de peixes devem ser incorporados à rotina de avaliação do sêmen após a criopreservação (Taddei et al., 2001). Morfometria espermática Estudos têm descrito a ultraestrutura de espermatozoides de peixe e examinando sua morfologia através da microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão (Cabrita et al., 2010), no entanto a microscopia eletrônica requer reagentes e equipamentos caros e um maior tempo é necessário para realização das análises (Marco-Jiménez et al., 2008). Dessa forma, uma boa alternativa é a utilização de sistemas computadorizados desenvolvidos para análise da morfometria da cabeça de espermatozoides. Um desses sistemas é o ASMA (Assisted Sperm Morphometry Analyser), que permite a avaliação de um grande número de espermatozoides de forma rápida e objetiva, sem qualquer interferência do avaliador. O ASMA já foi utilizado para mensurar as medidas morfometricas da cabeça dos espermatozoides de tambaqui, C. Macropomum (Leite et al., 2011) e espermatozoides frescos e após criopreservação de pirapitinga, P. brachypomus (Melo, 2010) (Tab 2). Apesar de diversos estudos utilizarem a morfologia espermática como forma de avaliação da qualidade espermática, está é uma análise subjetiva que vem sendo substituída gradativamente por métodos objetivos, como o ASMA, que permitem saber exatamente as medidas da cabeça dos espermatozoides (Asturiano et al., 2007; Marco- Jimenez et al., 2008). 31

32 Fertilidade Embora os métodos de avaliação descritos nos tópicos anteriores possam ser utilizados como critério de qualidade espermática após o descongelamento, eles não garantem a capacidade fertilizante do sêmen. Portanto, o teste de fertilização é, sem dúvida, o método mais apropriado e seguro para garantir a qualidade do sêmen. Para avaliar a capacidade fertilizante do sêmen descongelado é utilizado o método conhecido como fertilização a seco, no qual o sêmen é depositado sobre os ovócitos e, após a homogeneização dos gametas, é acrescentada uma solução hiposmótica para ativação dos espermatozoides e hidratação dos ovos, que posteriormente são transferidos para incubadoras. Esse método otimiza a utilização do sêmen criopreservado pela aproximação prévia dos gametas. A solução de bicarbonato de sódio 1% (NaHCO3) é utilizada com frequência para a hidratação dos ovos e ativação espermática após a homogeneização dos gametas em testes de capacidade fertilizante do sêmen criopreservado de Characiformes (Carolsfeld et al., 2003; Ribeiro e Godinho, 2003; Velasco-Santamaria, Medina-Robles, Cruz-Casallas, 2006). Outra solução também utilizada para hidratação dos ovos é a de Cloreto de Sódio 50 mm (NaCl) (Taitson, Chami e Godinho, 2008). Alguns pesquisadores utilizaram também água do tanque (Maria et al., 2006; Viveiros et al., 2010) ou água destilada (Miliorini, 2006). Outro critério que deve ser levado em consideração nos testes de capacidade fertilizante do sêmen criopreservado é a proporção ideal de espermatozoides por ovócito. Essa proporção é muito variável dependendo da espécie e da qualidade do sêmen utilizado. Vale a pena ressaltar que, no caso de sêmen criopreservado, a proporção de espermatozoides por ovócito é geralmente superior à utilizada para o sêmen fresco devido a diminuição da qualidade espermática após o descongelamento. De fato, nosso grupo de pesquisa também tem trabalhado na determinação da dose espermática ótima (dados não publicados) e tem observado que, para a fertilização com sêmen descongelado, há a necessidade de uma proporção espermatozoide/ovócito mais alta que aquela utilizada com sêmen fresco, na espécie tambaqui. Viveiros et al. (2009) observaram que a proporção ideal de espermatozoides pósdescongelamento por ovócito foi 20,5 vezes superior à proporção ideal para sêmen fresco em Salminus brasiliensis. Maria (2005) utilizou uma proporção 10 vezes maior 32

33 em relação ao sêmen fresco de Brycon. Por outro lado, alguns pesquisadores afirmam que o excesso de espermatozoides para fertilização encobre a qualidade dos espermatozoides criopreservados, dificultando as comparações entre protocolos (Viveiros, So e Komen, 2000), e utilizam a mesma proporção de espermatozoides: ovócito tanto para o sêmen fresco quanto para o descongelado (Viveiros et al., 2010) (Tab 3). Além da taxa de fertilização, a eclodibilidade e a taxa de sobrevivência de larvas oriundas da fertilização de oócitos por células espermáticas criopreservadas é uma variável que deve ser observada em protocolos reprodutivos em peixes. Apesar de sua importância, a eclodibilidade e a taxa de sobrevivência larval são pouco observados emtrabalhos com Characiformes (Fresneda et al. 2004; Maria, 2005; Viveiros e Godinho, 2009). Tabela: 3Fertilização como método de avaliação da qualidade do sêmen criopreservado de Characiformes brasileiros. Espécie Fertilização Referência Meio de hidratação Dose inseminante* P. lineatus 1 Água destilada NaHCO3 119mM 43,6 x 10 5 Miliorini et al., 2006 P. lineatus 1 Água do tanque 5 x 10 5 Viveiros et al., 2009b P. lineatus 1 Água do tanque 8 x 10 5 Viveiros et al., 2010 L. obtusidens 2 NaCl 50mM Taitson et al, 2008 S. brasiliensis 3 Água do tanque 28,7 x 10 5 Viveiros et al., 2009a B. orbignyanus 3 Água do tanque 46 x 10 5 Maria et al., 2006 B. amazonicus 3 NaHCO3 119 mm Velasco-Santamaria et al., 2006 B. opalinus 3 Água do tanque 4,1 x 10 5 Órfão et al., 2010 C. macropomun 3 NaHCO3 119 mm -- Menezes et al., 2008 *Espermatozoides:ovócito; 1 Família Prochilodontidae; 2 Família Anostomidae; 3 Família Characidae; -- Parâmetro não avaliado 33

34 CONCLUSÕES As técnicas subjetivas vêm sendo substituídas pelas objetivas no intuito de diminuir as variáveis entre análises, principalmente em relação à motilidade espermática. A análise da morfologia dos espermatozoides, apesar de ser pouco utilizada entre os pesquisadores, é de suma importância para a determinação da qualidade seminal. Em peixes, há uma grande necessidade de se desenvolver técnicasmais precisas de avaliação seminal, inclusive para se determinar parâmetros direcionadores do que seria ou não um sêmen criopreservável ou criopreservado de boa qualidade, como já existe para diversas espécies mamíferas. Apesar da importância dos métodos citados, a fertilização continua sendo a técnica mais confiável para avaliar a eficácia da criopreservação de sêmen de Characiformes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALAVI, S.M.H.; RODINA M.; VIVEIROS A.T.M.; COSSON J.; GELA D.; BORYSHPOLETS S.; LINHART O. Effects of osmolality on sperm morphology, motility and flagellar wave parameters in Northern pike (Esox lucius L.). Theriogenology, v. 72, p , ASTURIANO, J.F; MARCO-JIMÉNEZ F.; PEÑARANDA D.S; GARSON D.L; PÉREZ L.; VICENTE J.S; JOVER M. Effect of sperm cryopreservation on the European Eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Dom. Anim, v. 42, p , BILLARD, R.; COSSON J.; PERCHEC G.; LINHART O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture, v. 129, p , CABRITA, E.; SARASQUETE C.; MARTINEZ-PARAMO S.; ROBLES V. BEIRAO J.; PEREZ-CEREZALES S.; HERRAEZ MP. Cryopreservation of fish sperm: applications and perspectives. J. Appl. Ichthyol, v. 26, p ,