26 a 29 de novembro de 2013 Campus de Palmas

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1 AVALIAÇÃO DE ESTRUTURAS EMBRIONÁRIAS DE BOVINOS PÓS VITRIFICAÇÃO NA REGIÃO NORTE DO TOCANTINS Karina Almeida Maciel 1 ; Márcio Gianordoli Teixeira Gomes 2 ; Francisca Elda Ferreira Dias 3, 1 Aluno do Curso de Zootecnia; Campus de Araguaína; PIBIC/UFT 2 Orientador(a) dos Cursos de Medicina veterinária e Zootecnia ; Campus de Araguaína; 3 Co-orientador(a) dos Cursos de Medicina veterinária e Zootecnia; Campus de Araguaína; RESUMO Dentre as técnicas amplamente utilizadas em laboratórios comerciais para a preservação de embriões PIV, destaca-se a vitrificação. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a viabilidade de embriões bovinos pós-descongelação produzidos in vitro e vitrificados utilizando três diferentes concentrações de etilenoglicol e dimetilsulfóxido (DMSO), GI (5% etilenoglicol, 10% DMSO); G2 (10% etilenoglicol, 20% DMSO) e GIII (15% etilenoglicol, 25% DMSO). O uso da vitrificação para embriões PIV bovinos apresentou uma taxa de 42,42% resultado este semelhante ao encontrado em outro trabalho com taxa de 55%. Todavia as taxas obtidas ainda são inferiores quando comparados com embriões produzidos in vivo. Palavras-chave: crioprotetores; injúrias; reidratação INTRODUÇÃO A criopreservação de embriões produzidos in vitro assume grande importância por viabilizar a difusão de material genético, permitir o armazenamento dos embriões por longo período de tempo, proporciona a otimização do aproveitamento de gametas femininos, eliminados pelos fenômenos fisiológicos da reprodução, comercialização e transporte de material genético pelo mundo, além de permitir a preservação de material para o estabelecimento de bancos genéticos de reserva de material genético. Tornando essencial a congelação dos embriões em nitrogênio liquido e assim ter-se maior flexibilidade na utilização dos embriões (MEZZALIRA et al., 2002). A taxa de gestação de embriões transferidos logo após a colheita é sempre superior a embriões congelados. Isso está diretamente relacionado com as lesões

2 celulares que ocorrem durante o congelamento do embrião (REICHENBACH et al., 2002). Pesquisas vêm demonstrando que vários são os fatores que podem influenciar a criopreservação de embriões incluindo-se ai a espécie, estágio embrionário, os crioprotetores, dentre outros, assim como também a origem de produção destes embriões, uma vez que produzidos in vitro tem se mostrado mais sensíveis a criopreservação quando comparados aos embriões produzidos in vivo (GOEORGE et al, 2006). O objetivo deste trabalho foi comparar o uso de três diferentes doses de dois crioprotetores comumente utilizados na vitrificação de embriões bovinos produzidos in vitro na região Norte do Tocantins. MATERIAL E MÉTODOS O projeto foi conduzido no Laboratório Brio Genética e biotecnologia Ltda., localizado no município de Araguaína. Os ovários bovinos utilizados para a obtenção de ovócitos foram provenientes de abatedouro localizado no mesmo município. Os ovários coletados foram transportados em uma solução salina tamponada e mantidos a temperatura de 35º C até o inicio da aspiração folicular. Os oócitos foram aspirados de folículos com diâmetro de 2 a 8 mm, logo após a aspiração, os oócitos aspirados juntamente com o líquido folicular foram introduzidos em um banho em TCM 199 tamponado com Herpes adicionada de 10% de soro fetal bovino. A maturação foi realizada em meio TCM-199 sais de Earle adicionado de 26,2 mm de NaHCO3, 25 mm de Herpes, 0,2 mm de Piruvato de Sódio com 0,01 UI de FSH/mL, 0,5μg/mL de LH e 10% de soro fetal bovino. Após a lavagem, os oócitos foram colocados em até 30 oócitos por gota de 90micro litros com meio de maturação em placas de cultivo, mantido sob óleo mineral e levados à estufa com 5% de CO2 à temperatura de 38,8ºC e umidade saturada por 22 a 24 horas. A fecundação foi realizada utilizando 1x10 6 de espermatozóides de touros Bos taurus indicus, selecionados pelo método de migração ascendente swim-up. A fecundação foi feita através de agitação mecânica.

3 Em seguida a 24 h de cultivo as estruturas clivadas continuaram acondicionadas na incubadora. No 3 o dia (D3) após a fertilização foi feita a avaliação da clivagem, quando se observa o número de embriões com duas ou mais células. No 6 o dia (D6) após a fecundação, foi realizada a avaliação dos futuros blastocistos e, 24 horas após (D7), foi o número embriões no estágio de blastocisto ou estágios mais avançados. Os blastocistos expandidos (Bx) e blastocistos (Bl) foram vitrificados com diferentes protocolos. Utilizando a técnica de OPS chamada Open Pulled Straw foi desenvolvida por Vajta et al. (1997). O congelamento dos embriões foi realizado através da máquina PK1000; seguindo o limite de 5 embriões por palheta. Os blastocistos selecionados foram divididos aleatoriamente em três grupos com 200 embriões submetidos a três tratamentos diferentes de vitrificação. Grupo I Os Blastocistos (n=60) foram expostos por um minuto a uma solução composta por 5% de etileno glicol (EG) adicionado de 10% de Dimetil Sulfóxido (DMSO), seguida de exposição por 20 segundos a solução de vitrificacão contendo 20% de etileno glicol (EG) adicionado de 20 % de DMSO e 50% de meio de manutenção (composto de TCM % de Soro Fetal Bovino). Grupo II Os Blastocistos (n=74) foram expostos por 1 minutos a solução contendo 10% de etileno glicol (EG) adicionado de 20% de Dimetil Sulfóxido (DMSO), seguido de 20 segundos em solução de vitrificação contendo 20% de etileno glicol (EG) adicionado de 20 % de DMSO e 50% de meio de manutenção (composto de TCM % de Soro Fetal Bovino). Grupo III Os Blastocistos (n=66) foram expostos a solução constituída de 15% de soro de etileno glicol (EG) adicionado de 25% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) por um minuto. Seguido de 20 segundos em solução de vitrificação contendo 20% de etileno glicol (EG) adicionado de 20 % de DMSO e 50% de meio de manutenção (composto de TCM % de Soro Fetal Bovino). Os embriões foram envasados e armazenados em nitrogênio liquido para posterior descongelação e avaliação da viabilidade dos embriões utilizando como

4 parâmetro a taxa de eclosão após o reaquecimento e reintrodução nas incubadoras.a descongelação dos grupos foi realizada em duas passagens: 5 Segundos no ar e 15 Segundos em banho-maria a C. RESULTADOS E DISCUSSÃO No total foram produzidos 200 embriões. No grupo I: 60 embriões, dos quais nenhum embrião foi reidratado e eclodido; grupo II :74 embriões, onde 7 embriões foram reidratados e o embriões eclodidos, o que representa uma taxa de 9,45%; grupo III: 66 embriões, onde 28 embriões foram reidratados e 20 eclodidos, o que representa uma taxa de 42,42% (Tabela 1). Tabela 1. Total de embriões por tratamento com suas respectivas taxas e médias. TRATAMENTO TOTAL EMBRIÕES MÉDIAS 5%/10% Etileno/DMSO 60 0% a 10%/20% Etileno/ DMSO 74 9,45% a 15%/25% Etileno/DMSO 66 42,42% b Letras diferentes indicam efeito significativo (P<0,05) Não foram observadas diferenças significativas em relação à reidratação e eclosão dos embriões nos três grupos (P>0,05) (Tabela 2), entre os tratamentos I e II, todavia o resultado obtido no tratamento III se assemelha com a taxa de 55% encontrado por Mezzalira e colaboradores (2002). Tabela 2. Número de embriões reidratados e eclodidos pós-descongelamento. TRATAMENTO EMBRIÕES REIDRATADOS EMBRIÕES ECLODIDOS 5%/10% Etileno/DMSO %/20% Etileno/ DMSO %/25% Etileno/DMSO A estratégia de vitrificação é baseada na eliminação total da formação de gelo. Porém, as altas concentrações de crioprotetores aumentam os danos osmóticos e tóxicos (PYLES, 2003). Podendo justificar desse modo os baixos índices encontrados no presente trabalho. Werlich e colaboradores (2006) afirmam que, a taxa de eclosão de embriões vitrificados em relação aos embriões não vitrificados é caracteriza da por danos que

5 comprometem o posterior desenvolvimento dos embriões. Ou seja, há indícios que as substâncias crioprotetoras juntamente com a técnica podem causar injúrias irreversíveis ao embrião, pois uma vez danificado o metabolismo e as estruturas embrionárias o embrião terá seu futuro desenvolvimento comprometido. Acredita-se que as associações de Etilenoglicol + DMSO podem ser utilizadas na criopreservação de embriões PIV de bovinos, com resultados in vitro satisfatórios. Porém, são necessários outros estudos aplicados a campo, para se observar como os embriões vitrificados submetidos a estas soluções se comportam depois de descongelados e transferidos para o útero de receptoras sincronizadas (SANCHES, 2009). Podendo influenciar também no desenvolvimento fetal dos animais oriundos deste procedimento. LITERATURA CITADA GEORGE, F; VRANCKEN, M.; VERHAEGHE, B.; et al. freezing of in vitro produced bovine embryos in animal protein-free medium containing vegetal peptones. Theriog., v.66, p , MEZZALIRA, A.; VIEIRA, A. D.; BARBIERI, D. P.; et al. Vitrificação de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro e expostos à citocalasina. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v. 39, n. 5, p , PYLES, E.S.C.S. Criopreservação de embriões bovinos. Monografia, 23p. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP- Botucatu-Sp, REICHENBACH, H.D.; OLIVEIRA, M.A.L.; LIMA, P. F. Transferência e criopreservação de embrião bovino. Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Varela, p. SANCHES,B.V. Uso de propanediol ou DMSO na vitrificação de embriões bovinos produzidos in vitro, cultivados ou não na presença de forskolin. Dissertação (mestrado), 52p. Escola de Medicina Veterinária. Universidade federal de Goiás, WERLICH, D.E.; BARRETA, M.H.; MARTINS,L.T.et al. Embriões bovinos PIV vitrificados em diferentes soluções crioprotetoras com ou sem o uso de nitrogênio super-resfriado. Acta Sci. Vet., v.34, n.1, p , AGRADECIMENTOS Ao laboratório BRIO genética. O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT.

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