Coleta, Avaliação e Criopreservação de Sêmen

Transcrição

1 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologias Manipulação de Gametas e Embriões 4ª Aula: Coleta, Avaliação e Criopreservação de Sêmen Priscila Marques Moura de Leon Doutoranda PPGB, Médica Veterinária Setembro, 2011

2 Conceitos... Sêmen: suspenção celular contendo espermatozoides e fluído secretado pelos órgãos acessórios do trato genital masculino. Porção Celular: espermatozoides (formados no interior dos túbulos seminíferos dos testículos) Porção fluída: plasma seminal (transportador e protetor dos espermatozoides, fonte varia de acordo a espécie)

3 Célula Espermática Cauda do Espermatozoide Peça Intermediária Cabeça do Espermatozoide Acrossomo

4 Morfologia Espermática: Célula Espermática Cabeça do Espermatozóide núcleo achatado de forma oval contendo cromatina altamente condensada (DNA + protaminas); Acrossomo cobertura com dupla camada de membrana que envolve o núcleo (Acrosina, hialuronidase, enzimas hidrolíticas) Cauda do Espermatozóide colo, peças intermediária, principal e terminal. (*intermediária: numerosas mitocôndrias) Principais componentes: Ácidos nucléicos Proteínas Lipídeos * 1/3 do peso é constituído pelo núcleo

5 Comparação de espermatozoides de animais domésticos

6 Bovino Equino Humano Suíno Caprino Camundongo Rato Canino

7 Seleção de Machos para Criopreservação de Sêmen * Seleção prévia ao processamento e congelamento de sêmen para comercialização. 1. Zootécnicos: teste de performance faz parte do exame fenotípico para a escolha dos reprodutores, leva-se em consideração o desempenho obtido. Ex.: produção de carne, performance esportiva. Teste de progênie: o conhecimento da descendência de um reprodutor tem mais valor doqueoexamedesuagenealogia.ex.:produçãodeleitedasvacasfilhas. 2. Sanitários: devem ser livres de doenças infectocontagiosas, devendo ser submetidos a exame andrológico e a testes de diagnóstico. Ex.: Brucelose, Leptospirose, Tuberculose 3. Nutricional: Deficiências nutricionais podem provocar infertilidade. Machos selecionados para congelamento de sêmen devem receber alimentação de alta qualidade. 4. Reprodutivos: Exame andrológico completo (teste de comportamento sexual, genitália externa e interna, Espermograma, 5. Burocráticos: medidas de credenciamento junto às associações de criadores para a exploração comercial

8 Métodos de Coleta de Sêmen Vagina Artificial Eletroejaculação Método de Excitação Mecânica

9 Métodos de Coleta de Sêmen Vagina Artificial Vagina Artificial: Corresponde à melhor técnica de coleta de sêmen, pois simula a cópula natural. Método utilizado para: Bovinos, Equinos, Caprinos e Ovinos, coelhos. A vagina artificial é composta por um tubo rígido com válvula, mucosa de borracha, cone flexível e tubo coletor, recoberto por capa de térmica. Através da válvula do tubo coloca-se a água a temperatura de C e regula-se a pressão. A temperatura interna deve estar entre 39 e 42 C. Vantagens:obtêm sêmen com maior densidade e concentração, menor risco de contaminação ambiental. Desvantagem: necessidade de treino para os machos doadores.

10 Coleta de Sêmen por Vagina Artificial Vagina Artificial de Ovinos e Caprinos Vagina Artificial de Equinos Vagina Artificial de Bovinos

11 Coleta de Sêmen Equino - Vagina Artificial Manequim Artificial Égua em Cio

12 Coleta de Sêmen Bovino- Vagina Artificial Vaca em Cio

13 Métodos de Coleta de Sêmen - Eletroejaculação Eletroejaculação: Método consiste em induzir a passagem de uma corrente alternada pela medula ao nível da 4 a vértebra lombar, este estímulo produz a ejaculação. O eletroejaculadoré inserido no reto, com eletrodos em forma de anéis ou longitudinais irão promover a estimulação elétrica. A eletroejaculaçãoé particularmente indicada para coleta de sêmen de touros e carneiros. Desvantagens:correspondem ao estresse gerado e maior diluição seminal quando comparado à coleta com vagina artificial (eletroejaculadorexacerba a secreção das glândulas sexuais acessórias) que pode ocasionar problemas de congelabilidade desse sêmen.

14 Coleta de Sêmen por Eletroejaculação Sistema de Eletroejaculação Coleta de Sêmen Bovino Coleta de Sêmen de Animais Silvestres

15 Métodos de Coleta de Sêmen Excitação Mecânica Método de Excitação Mecânica: utilizado por Spalanzani (1780) para a obtenção de sêmen de cão. Foi o método utilizado para realizar a primeira inseminação artificial em um animal de fecundação interna. A técnica consiste na excitação manual do corpo do pênis. Utilizado em Cães e Suínos. Suínos Método da Mão Enluvada Desvantagens: método restrito a animais mansos e treinados e oferece um risco potencial de contaminação do sêmen por sujidades ambientais.

16 Coleta de Sêmen Canino -Excitação Mecânica O sêmen canino é composto de três frações distintas: 1ª fração: é constituída por um líquido claro, aquoso, que representa o produto de secreção das glândulas uretrais e seu volume pode variar de 0,25 a 5 ml; 2ª fração:de cor branca e consistência viscosa, contém os espermatozoides, o volume pode variar de 0,5 a 3 ml; 3ª fração: clara, aquosa, pouco consistente, cujo volume varia de 3 a 30 ml, representa a secreção prostática. * A concentração média da ejaculação completa seria de por ml.

17 Coleta de Sêmen Suíno Mão Enluvada.Sêmen é coletada em 3 frações: Fração Pré-espermática: translúcida Fração rica em espermatozoides: esbranquiçada e opaca Fração Pós-espermática: translúcida

18 Outros métodos de coleta de sêmen Coleta de Sêmen de Aves Massagem Abdominal Coleta de Sêmen de Camundongos Retirada do Epidídimo e ducto deferente Coleta de Sêmen de Peixes Massagem Abdominal

19 Testículo

20 Métodos de Avaliação de Sêmen * A avalição do sêmen deve ser realizada logo após a coleta; * Nenhum teste isolado é capaz de predizer a fertilidade, é necessário um conjunto de testes; Análises: Análises Imediatas Análises Morfológicas Análises de Viabilidade Sondas Fluorescentes Sistemas Automatizados * Importante: todo material deve ser sempre mantido 37 C

21 Métodos de Avaliação de Sêmen Aparência e Volume: Coloração uniforme e aparência opaca (indica alta concentração espermática); Volume é utilizado para cálculo da dose espermática (estimativa do número total de células); Volume médio ejaculado : Bovino: 5 8 ml Ovino: 0,8 1,2 ml Caprino: 0,8 1,2 ml Suíno: ml Equino: ml Galo: 0,2 0,5 ml Sêmen Bovino

22 Métodos de Avaliação de Sêmen Motilidade e Vigor: Estimativa subjetiva da viabilidade e qualidade espermática; Análise realizada em Microscópio óptico; Avaliação pode ser dificultada em altas concentrações espermáticas; 10 a 20µL de sêmen são colocados entre lâmina e lamínula; Motilidade:células móveis são contadas e estimado o percentual; Vigor:velocidade que as células atravessam o campo e formam ondas; Motilidade média do ejaculado é 70 a 90%; Vigor é estimado entre 0 a 5, média e ideal entre 3 e 4;

23 Valores médios de Motilidade: Bovino: 40 75% Ovino: 60 80% Caprino: 60 80% Suíno: 50 80% Equino: 40 75% Galo: % Vídeos Motilidade Espermática

24 Análise Computadorizada de Motilidade Sistemas de análises computadorizadas da motilidade espermática estão disponíveis; O Sistema de Análise Espermática Computadorizado - CASA (Computer Assisted Sperm Analysis): sistema automatizado (Hardware e Software) para visualizar e digitalizar imagens sucessivas dos espermatozoides; processando, analisando e fornecendo informações da cinética individual das células e valores estatísticos Têm sido propostos e aplicados na tentativa de minimizar os efeitos da avaliação convencional do sêmen, Incrementar o estudo da andrologia através da análise de diversos parâmetros de motilidade;

25 CASA-Computer Assisted Sperm Analysis Motilidade Total (%), Motilidade Progressiva (%) Velocidade de Trajeto (VAP, μm/s) Velocidade Progressiva (VSL, μm/s) Velocidade Curvilinear(VCL, μm/s) Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH, μm) Freqüência de Batimentos (BCF, Hz) Retilinearidade(STR, %)(VSL/VAP) Linearidade (LIN, %) (VSL/VCL) Velocidade Rápida (%; Arruda, 2000).

26 Métodos de Avaliação de Sêmen Concentração Espermática: Pode ser determinada por: Hemocitômetro e Espectrofotômetro Sêmen deve ser diluído em formol salina ou água para facilitar a contagem (10X -100X); Rotineiramente é utilizada Câmara de Neubauer para contagem celular; Concentração média espermática milhões/ml: Bovino: x 10 6 sptz/ml Ovino: x 10 6 sptz/ml Caprino: x 10 6 sptz/ml Suíno: x 10 6 sptz/ml Equino: x 10 6 sptz/ml Galo: x 10 6 sptz/ml

27 Câmara de Neubauer Contagem Espermática Diluir amostra (formol salina ou água); Montar câmara; Esperar 5 min para contagem; Contagem de 5 quadrantes; Contar as Linhas em L ; Contar nos 2 compartimentos (diferença deve ser menor de 10%); Caso haja disparidade fazer nova amostra;

28 Morfologia: Métodos de Avaliação de Sêmen Estimativa do percentual de células normais e das patológicas; Amostra é diluída e conservada em formol salina; Avaliação através de esfregaço e coloração (Hematoxilina-eosina ou Giemsa, Rosa de Bengala) 100 a 200 sptzdevem ser avaliados; Morfologia espermática ideal para congelamento é de 90%; Espermatozóides morfológicamente normais: Bovino: 65 95% Ovino: 80 95% Caprino: 80 95% Suíno: 70 90% Equino: 60 90% Galo: 85 90%

29 Confecção Esfregaço Espermático

30 Morfologia Espermática: Classificação das Anormalidades espermáticas: Primárias: associadas a cabeça e acrossomo; Secundárias: gotas citoplasmáticas; Terciárias: defeitos de cauda;

31 Avaliação automatizada da morfometria espermática Avaliação automatizada da morfometria espermática - ASMA (Automated Sperm MorphometryAnalyses): avaliações da morfometria espermática pelo sistema computadorizado realizadas por esfregaços corados (1.000 x); As imagens destinadas à avaliação da morfometria da cabeça dos espermatozoides são avaliadas pelo software; Concentração de 200 x 10 6 sptz/ml Padrões morfométricos médios para equino: cabeças espermáticas com 5,85 μmde comprimento, 2,97 μmde largura, 13,15 μm 2 de área, 14,85 μmde perímetro e 0,51 μmpara o coeficiente largura/comprimento. * Espermatozoides são mais delgados quando subférteis

32 ASMA - Automated Sperm Morphometry Analyses

33 Métodos de Avaliação de Sêmen Testes de Viabilidade de membrana: Teste Hiposmótico: em uma solução hiposmótica(150 mosm) a água entra no espermatozoide na tentativa de se alcançar o equilíbrio osmótico; capacidade do flagelo de se dobrar na presença de uma solução hiposmóticaindica que a membrana está íntegra e funcional; O Teste Hiposmóticoé um teste simples, prático e confiável;

34 Métodos de Avaliação de Sêmen Testes de Viabilidade de membrana: Live/Dead(Invitrogen): SYBR 14 e Iodeto de Propídio; PI cora células com danos de membrana; O Live/Deadé um kit para teste de viabilidade de membrana utilizado após congelamento/descongelamento; Sêmen Bovino Sêmen Equino

35 FITC-PSA: Métodos de Avaliação de Sêmen para avaliar a integridade do acrossomode células espermáticas, através da capacidade de ligação a glicoproteínas específicas Teste utilizado para avaliar crioinjúriasapós Congelamento/Descongelamento; * Fluorescein Isothiocyanate-conjugated-Pisum sativum agglutinin Sêmen Caprino Sêmen Equino Sêmen Camundongo

36 Parâmetros seminais humanos segunda a Organização Mundial de Saúde

37 Criopreservação de Sêmen A criopreservação do sêmen busca a suspensão do metabolismo espermático e a manutenção de suas características por um período de tempo prolongado; O sucesso da criopreservação do sêmen depende da manutenção do potencial fertilizante dos espermatozóides (integridade e funcionalidade): Flagelo (para garantir produção de ATP e motilidade); Núcleo(para manter estável o armazenamento do DNA); Acrossomo (para manter a fecundação); Segmento Equatorial (para que ocorra a ativação do oócito);

38 Criopreservação de Sêmen Uso do Sêmen Congelado: Comercialização nacional e internacional; Biobancos(armazenamento de material genético); Inseminação Artificial; Produçãoinvitrodeembriões(FIVeICSI); Transferência de Gametas(GIFT); Programa de Transferência de embriões; Pesquisa Científica;

39 Criopreservação de Sêmen A preservação das estruturas espermáticas ao congelamento/descongelamento é obtida através do uso de: Diluidores e Crioprotetores; Curvas de Resfriamento buscam minimizar os danos causados pelo choque térmico, formação de cristais de gelo e desidratação celular;

40 Resfriamento: altera as propriedades físicas da membrana celular. Crioprotetores:alteram o volume celular, com desidratação e penetrando na célula Armazenamento: estado de dormência celular. Descongelamento:reidratação celular, com a recuperação e expansão da membrana Verificação dos danos celulares

41 Espermatozoides Equino Criopreservados

42 Criopreservação de Sêmen Passos da criopreservação do sêmen: 1. Diluição 2. Resfriamento 3. Congelamento 4. Armazenamento 5. Descongelamento

43 Criopreservação de Sêmen -Diluição 1. Diluição: Diluentes Seus componentes devem garantir nutrição, proteção, ph (6,5 a 6,9) e osmolaridade adequados (300mOsm), e atividade antibacteriana; O sêmen logo após a coleta deve ser diluído em meio de manutenção para dar suporte até o processamento de criopreservação (transporte); Diluição na Proporção 1:1 (sêmen:diluente)

44 Exemplo de Diluidores de Sêmen Sêmen Bovino Sêmen Equino Sêmen Suíno

45 Criopreservação de Sêmen -Diluição 1. Diluição: Crioprotetores Classificados como Externose Internos de acordo a capacidade de penetração da membrana plasmática ; Devem provocar a desidratação celular, proteger e estabilizar a membrana plasmática e evitar formação de cristais de gelo;

46 Criopreservação de Sêmen -Diluição Crioprotetores Crioprotetores Internos: São moléculas pequenas que atravessam a membrana plasmática; glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida; atuam nos meios intra e extracelulares; possuem o ponto de congelação muito mais baixo do que o da água; aumentam a osmolaridadedo meio extracelular e promovem a saída de água da célula (até recuperar volume inicial); evitando o acúmulo de água e a formação de cristais de gelo intracelular;

47 Criopreservação de Sêmen -Diluição Crioprotetores Crioprotetores Externos: são moléculas grandes e não conseguem atravessar a membrana plasmática; Proteínas (da gema do ovo -LDL - e do leite desnatado), Açúcares (frutose, glicose, manose, rafinose ou trealose) Polímeros sintéticos (polivinilpirrolidonae metilcelulose) agem como solutos ou colóides, pois contribuem para as propriedades osmóticas e afetam o movimento de água para dentro e para fora da célula

48 Criopreservação de Sêmen -Diluição Toxicidade dos Crioprotetores: Crioprotetoressão tóxicos ao espermatozoide, pois causam injúrias bioquímicas e danos osmóticos; Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetores desestabilizam os lipossomos, dissolvendo os fosfolipídeos; Enquanto que em concentrações moderadas, previnem os efeitos prejudiciais da desidratação; * Bovinos: Tris-gema e Glicerol melhores resultados * Equino: Dimetilformamida é mais usada * Caprinos: leite desnatado + glicose + glicerol 1949: Christopher Polge criopreserva sêmen bovino com sucesso

49 Exemplo de Crioprotetoresde Sêmen Sêmen Bovino Sêmen Equino Kit Sêmen Humano

50 Criopreservação de Sêmen -Diluição 2. Resfriamento: O resfriamento lento abaixo de 0 C promove maior saída de água da célula, podendo levar a desidratação celular intensa; O resfriamento rápido é insuficiente para permitir a saída da água, o que acarreta a formação de cristais de gelo intracelular. A taxa de resfriamento ideal: resulta em suficiente retirada de água intracelular, formando pequenos de cristais de gelo intracelulares e sobrevivência após o descongelamento. * A velocidade de descongelamento deve ser compatível a velocidade utilizada de congelamento.

51 Curva de Resfriamento/Congelamento Curva de Resfriamento 5 C/1h e 15min (0,25 C/min); Curva de Congelamento até -80 C (-15 C/min); Curva de Congelamento até -120 C (-10 C/min); Imersão em Nitrogênio líquido (-196 C); Armazenagem

52 Palhetas para Criopreservação de Sêmen Palhetas de 0,5mL e 0,25mL Raques

53 Curva de Resfriamento Banho-Maria na geladeira Sistemas de transporte e resfriamento de sêmen

54 Curva de Resfriamento/Congelaamento Bio Cool: Sistema que resfria por curva padrão até 80 C; Utilizado para sêmen, embriões e outras células

55 Curva de Resfriamento - Congelamento

56 Criopreservação de Sêmen -Diluição 4. Armazenamento: Em Botijões de Nitrogênio Líquido (-196 C); As palhetas são colocadas em raques identificadas; Nível do NL é verificado e mantido periodicamente (15 dias); Armazenamento por tempo ilimitado;

57 Criopreservação de Sêmen -Diluição 5. Descongelamento: Retira do Nitrogênio líquido e coloca em Banho-Maria; Em Banho-Maria a 37 C/30 segundos; Cortar uma das extremidades da palheta para retirada do sêmen;

58 Seleção do Macho Doador Coleta de Sêmen Avaliação Seminal Congelamento/Descongelamento Avaliação Seminal

59 Protocolo de Criopreservação de Sêmen Sêmen é centrifugado (eliminado plasma seminal e diluente); Ressuspendidona concentração de 100 x 10 6 sptz/ml; Após a diluição, o sêmen é mantido a 37 C/10 min para estabilização; Homogeneização e Envase nas palhetas de 0,5mL ou 0,25mL; Identificação das palhetas; Curva de Resfriamento 5 C/1h e 15min; Curva de Congelamento até -80 C ; Curva de Congelamento até -120 C ; Palhetas são imersas em Nitrogênio líquido (-196 C); Palhetas são raqueadas e armazenadas em botijões de NL; Descongelamento: em Banho-Maria a 37 C/30 segundos;