AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ESTRUTURAL DA MEMBRANA PLASMÁTICA E DO ACROSSOMO DO ESPERMATOZÓIDE CRIOPRESERVADO DE TOUROS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ESTRUTURAL DA MEMBRANA PLASMÁTICA E DO ACROSSOMO DO ESPERMATOZÓIDE CRIOPRESERVADO DE TOUROS Isabel Ribeiro Orro CAMPO GRANDE MATO GROSSO DO SUL BRASIL MAIO DE 2007

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3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ESTRUTURAL DA MEMBRANA PLASMÁTICA E DO ACROSSOMO DO ESPERMATOZÓIDE CRIOPRESERVADO DE TOUROS Isabel Ribeiro Orro Orientadora: Prof. Dra. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, como requisito à obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Produção Animal. CAMPO GRANDE MATO GROSSO DO SUL BRASIL MAIO DE 2007

4 ISABEL RIBEIRO ORRO Avaliação da integridade estrutural da membrana plasmática e do acrossomo do Espermatozóide criopreservado de touros structural integrity assessment of plasma membrane and acrosome of cryopreserved bull sperm". Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, como parte dos requisitos do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Produção Animal APROVADO: 29/05/2007 Dra. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari Orientadora Dra. Eliane Vianna da Costa e Silva Dra. Margot Alves Nunes Dode

5 Tudo vale a pena se a alma não é pequena Fernando Pessoa

6 Ao meus pais, marido, irmãos e sobrinhos... dedico.

7 AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari pela oportunidade para que eu pudesse realizar meu trabalho de mestrado. À Profa. Dra. Eliane Vianna da Costa e Silva por toda a orientação recebida durante a realização da análise estatística. Ao Dr. Urbano Gomes Pinto de Abreu, pela análise estatística e por esclarecer inúmeras questões referente aos resultados. Ao CNPq pelo financiamento do projeto. À acadêmica de mestrado Thaíse Silva Passos, pelo companheirismo e agradável convívio. Às acadêmicas de iniciação científica Paula Rosa Carrijo e Patrícia Arakaki Leite pela agradável convivência durante a etapa laboratorial do trabalho. Aos meus pais que compreenderam a ausência do convívio familiar e do trabalho. Ao meu marido que forneceu o apoio suficiente. A todos que de uma forma ou de outra contribuíram para esta dissertação.

8 SUMÁRIO Página 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Capacitação Espermática Reação do Acrossomo Exames de Rotina Utilizados na Avaliação do Sêmen Motilidade Morfologia espermática Avaliação da Integridade Estrutural do Espermatozóide Integridade da membrana plasmática Diacetato de 6-carboxifluoresceína e iodeto de propídio Eosina nigrosina Integridade do acrossomo Aglutinina de Arachis hipogaea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína e iodeto de propídio Trypan blue Giemsa REFERÊNCIAS AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ESTRUTURAL DA MEMBRANA PLASMÁTICA E DO ACROSSOMO DO ESPERMATOZÓIDE CRIOPRESERVADO DE TOUROS Resumo Abstract Introdução Materiais e Métodos Resultados Discussão Conclusões Referências... 43

9 7 ABREVIATURAS CAP CFDA CTC DEF ma DEF me DEF TOT DMSO DNA EN FDA FITC FITC-PNA IA MAE MP PI PNA RA RAF RAV TALP TB TBG TNR ZP capacitação espermática diacetato de 6-carboxifluoresceína clortetraciclina defeitos maiores defeitos menores defeitos totais dimetilsulfóxido ácido desoxirribonucléico eosina nigrosina diacetato de fluoresceína isotiocianato de fluoresceína aglutinina de Arachis hypogea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína inseminação artificial membrana acrossomal externa membrana plasmática iodeto de propídio aglutinina de amendoim (Arachis hypogaea) reação do acrossomo reação do acrossomo falsa reação do acrossomo verdadeira meio de Tyrode trypan blue trypan blue e Giemsa taxa de não retorno ao cio zona pelúcida

10 8 Avaliação da Integridade Estrutural da Membrana Plasmática e do Acrossomo do Espermatozóide Criopreservado de Touros Resumo A criopreservação causa danos irreversíveis nas membranas espermáticas como a ruptura das plasmática e acrossomal. A integridade da membrana plasmática tem sido estudada usando diferentes técnicas incluindo as sondas fluorescentes diacetato de 6-carboxifluoresceína associada ao iodeto de propídio (CFDA/PI) e eosina-nigrosina (EN); e a integridade do acrossomo incluindo a lecitina Arachis hypogaea conjugada a sonda fluorescente isotiocianato de fluoresceína associada ao PI (FITC-PNA/PI) e o corante trypan-blue/giemsa (TBG). O objetivo deste estudo foi a utilização desses testes para avaliar a integridade da membrana plasmática e do acrossomo e verificar se os resultados desses testes têm correlação com a fertilidade in vivo. Inseminações foram realizadas em 2036 matrizes Nelore em duas propriedades e quatro estações de monta. Amostras de sêmen pós descongelação de 22 touros Nelore foram avaliadas quanto a motilidade, concentração, morfologia e os testes para avaliar a integridade da membrana plasmática e do acrossomo. Foi realizada análise dos componentes principais e os resultados laboratoriais foram avaliados por correlação de Pearson (SAS Institute, Cary, USA, 1995). Correlação positiva foi encontrada entre concentração (r=0,98; p<0,0001), integridade de membrana com FDA (r=0,92; p<0,0001) e EN (r=0,70; p=0,0002) e do acrossomo com FITC- PNA (r=0,92; p<0,0001) e TBG (r=0,90; p<0,0001) com fertilidade in vivo. Os testes CFDA/PI, EN, FITC-PNA/PI e TBG juntos responderam por 78% da variação na taxa de prenhez. Portanto, a integridade da membrana plasmática e do acrossomo podem ser consideradas importantes variáveis para a função espermática e esses testes podem ser usados para avaliar a qualidade de uma amostra de sêmen destinado a IA. Palavras-chave: Sêmen congelado de touro, avaliação do sêmen, integridade da membrana plasmática, integridade do acrossomo, fertilidade.

11 9 Structural Integrity Assessment of Plasma Membrane and Acrosome of Cryopreserved Bull Sperm Abstract Cryopreservation imposes irreversible damage to sperm membranes such as disruption of plasma and acrosome membranes. Plasma membrane integrity has been widely studied using different techniques, including fluorescent probes as 6-carboxifluorescein diacetate and propidium iodide (CFDA/PI) and eosin nigrosin (EN); and the acrosome integrity by Arachis hypogaea lectin conjugated with a fluorescent probe, fluorescein isothiocyanate and PI (FITC- PNA/PI) and trypan-blue/giemsa (TBG). The aim of this study was to combine these tests to evaluate membrane and acrosome integrity and determine if the results of these assays were associated with in vivo fertility. Insemination was performed in 2036 Nelore bovine female in two properties at four breeding season. Semen samples pos thawing of 22 Nelore bulls was assessed to motility, concentration, morphology and to membrane and acrosome integrity. PRINCOMP procedure was made and the laboratorial results was correlated by Pearson (SAS Institute, Cary, USA, 1995). Positive correlation was observed between membrane FDA (r=0,92; p<0,0001) and EN (r=0,70; p=0,0002) and acrosome integrity with FITC-PNA/PI (r=0,92; p<0,0001) and TBG (r=0,90; p<0,0001) and in vivo fertility. The tests CFDA/PI, EN, FITC- PNA/PI and TBG together account for 78% of variation in fertilization rates. Therefore membrane and acrosome integrity can be considered important variables for normal sperm function and these tests can be used to assess the quality of a semen sample used for AI. Keywords: Frozen-thawed bovine spermatozoa, semen assay, membrane integrity, acrosome integrity, fertility.

12 10 1. INTRODUÇÃO A inseminação artificial (IA) é uma biotécnica de primeira geração com significativa contribuição para o melhoramento genético dos rebanhos, além de ser de fácil acesso e domínio técnico (ASBIA, 2006). Apesar desta técnica estar sendo utilizada desde a década de 40, uma avaliação mais precisa da fertilidade do sêmen bovino criopreservado é de extrema importância. A maior desvantagem do processo de criopreservação é ser prejudicial ao espermatozóide. O processo de criopreservação resulta em diminuição da fertilidade quando comparado a do sêmen a fresco e causa um decréscimo de aproximadamente 50% da viabilidade espermática (THOMAS et al., 1998; WATSON, 2000). Este prejuízo surge da combinação de dois aspectos, morte celular e danos na capacidade funcional dos espermatozóides sobreviventes (CORMIER et al., 1997; DEN DAAS et al., 1998; PETRUNKINA et al., 2005; WATSON, 2000). Embora o espermatozóide possua poucas organelas, é uma célula complexa (GRAHAM, 2001; GILLAN et al., 2005) com vários compartimentos celulares, diferentes composições de membrana e estruturas subcelulares, que devem estar íntegros para que ocorra a fecundação (GRAHAM, 2001). Ocorrem mudanças morfológicas na organização, fluidez, permeabilidade, composição lipídica (THOMAS et al., 1998) e até ruptura das membranas espermáticas (HOLT, 2000). Do ponto de vista biológico apenas espermatozóides viáveis e contendo informações genéticas intactas são potencialmente fertéis (JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002). Desta forma, alguns processos fisiológicos são necessários e requerem múltiplos atributos celulares (GRAHAM, 2001) como a capacitação espermática (CAP) e a reação do acrossomo (RA). Uma vez capacitado, o espermatozóide exibe elevada taxa metabólica, mudanças no potencial de membrana, aumento da sua permeabilidade e assim, condições para sofrer a RA (YANAGIMACHI, 1994). Apenas espermatozóides capacitados e com o acrossomo íntegro são capazes de se ligar a zona pelúcida (ZP), sofrer a RA e fertilizar o ovócito. Portanto, a viabilidade espermática é crítica para ocorrência da RA e penetração do espermatozóide através da ZP (KITIYANANT et al., 2002). A avaliação tradicional da qualidade do ejaculado por centrais de coleta e processamento de sêmen tem se baseado na análise da motilidade, morfologia e concentração, aspectos que têm

13 11 uma capacidade limitada no que se refere a estimativa do potencial fertilizante de um ejaculado (ASBIA, 2006; GILLAN et al., 2005). O processo de fecundação envolve eventos bioquímicos e moleculares complexos que não são analisados na avaliação de rotina. O objetivo do presente estudo foi avaliar a integridade estrutural da membrana plasmática e do acrossomo do sêmen criopreservado de touros e verificar a correlação entre estas técnicas e destas com a fertilidade in vivo. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Capacitação Espermática A capacitação espermática é um evento fisiológico altamente complexo que envolve uma série de modificações bioquímicas que ocorem no trato genital da fêmea, conferindo ao espermatozóide a capacidade de penetrar o ovócito (FELIX, 2005; BREITBART et al., 2005). Em bovinos, nos quais os espermatozóides são depositados na vagina durante o coito, a CAP pode ter início durante a passagem do espermatozóide pelo muco cervical. Embora alguns espermatozóides estejam num estágio avançado de CAP, após a passagem pelo muco, não se sabe se são capazes de ingressar no oviduto para participar da fecundação (YANAGIMACHI, 1994). Já, no istmo, uma molécula ligante de carboidrato, presente na superfície do espermatozóide, se une a uma porção oligossacarídica do epitélio e proteínas secretadas pelo epitélio preservam a viabilidade, suprimem a motilidade hiperativada dos espermatozóides e retardam a RA (BOQUEST et al., 1999), para aguardarem o momento da ovulação e fecundação.

14 Reação do Acrossomo O acrosssomo é uma vesícula especializada que recobre a porção anterior da cabeça do espermatozóide, composta pelas membranas acrossomal externa e interna, dividindo-se nos segmentos apical e equatorial. Enquanto o segmento apical contém enzimas hidrolíticas, o segmento equatorial não possui enzimas. A reação do acrossomo, uma forma modificada de exocitose, altera o espermatozóide tanto estrutural quanto funcionalmente (YANAGIMACHI, 1994). A RA envolve a fusão entre as membranas plasmática (MP) e acrossomal externa (MAE), seguida da liberação do conteúdo do acrossomo, um processo que permite o espermatozóide a penetrar o ovócito e fertilizá-lo. Apenas espermatozóides capacitados podem sofrer a RA ao se ligarem a ZP (PEREIRA et al., 2000; BREITBART et al., 2005). A avaliação do status acrossomal classifica os espermatozóides em: a) vivo aquele viável e com acrossomo intacto; b) morto lesado, mas com acrossomo intacto; c) reação do acrossomo verdadeira (RAV) onde o espermatozóide apresenta-se vivo e o acrossomo ausente e; d) reação do acrossomo falsa (RAF) lesado/morto e com o acrossomo ausente. Em qualquer amostra de sêmen a percentagem de espermatozóides vivos e com acrossomo intacto diminui ao longo do tempo, consequentemente a percentagem de mortos e sem o acrossomo aumenta. Isto sugere que subpopulações de espermatozóides estão sofrendo um ciclo contínuo de CAP, RAV e morte celular (DIDION et al., 1989). 2.3 Exames de Rotina Utilizados na Avaliação do Sêmen Motilidade A avaliação subjetiva da motilidade espermática pós-descongelação é o parâmetro mais usado para estimar a qualidade do sêmen destinado a IA. Embora seja um bom indicador da viabilidade espermática e de relevância para a fecundação, não é um bom indicador de fertilidade (AMANN, 1989; WHITFIELD; PARKINSON, 1995; RODRIGUEZ-MARTINEZ,

15 ; GRAHAM, 2001; JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002; JANUSKAUSKAS et al., 1999). Com a criopreservação a eficiência do transporte espermático pode ser reduzida severamente (HOLT, 2000), pois enquanto uma percentagem da população exibe motilidade progressiva satisfatória, outra mostra algum grau de prejuízo que parece ter uma contribuição importante para o menor potencial fertilizante dos gametas quando introduzidos no trato reprodutivo da fêmea, após a IA. O transporte para o local de fecundação requer um mínimo de capacidade de deslocamento (WATSON, 2000). A presença de motilidade progressiva e um acrossomo intacto são dois dos maiores responsáveis pelo sucesso da IA (HOLT, 2000; BRITO et al., 2003; GILLAN et al., 2005). Mas, de acordo com Amann (1989), uma queda da fertilidade tem ocorrido mesmo quando o sêmen pós-descongelação contém um percentual adequado de espermatozóides com motilidade progressiva. Um estudo de Blottner et al. (1990) mostrou correlação positiva entre motilidade e fertilidade, tanto pela taxa de não retorno ao cio (TNR; r = 0,61; p < 0,05), como pelos resultados da fecundação in vitro (r = 0,62; p < 0,05). Da mesma forma, Januskauskas et al. (2000) e Corrêa et al. (1997) obtiveram correlação significativa entre motilidade e TNR (TNR- 56 dias, r = 0,53, p < 0,05; e TNR dias, r = 0,53, p < 0,01; respectivamente) em sêmen congelado de touro. Também Den Daas (1997) obteve correlação significativa entre motilidade e TNR-56 dias (r = 0,52; p < 0,05). Em relação a fertilidade in vitro, de acordo com a taxa de clivagem, Brito et al. (2003) observaram que a motilidade é um bom parâmetro, explicando 18% de sua variação. Porém, Phillips et al. (2004) avaliando sêmen criopreservado de touros não observaram correlação significativa da motilidade tanto com TNR, quanto com a taxa de concepção. Garner et al. (1986) relataram correlação positiva (r = 0,55; p < 0,05) entre motilidade progressiva e viabilidade espermática analisada pela associação de diacetato de 6- carboxifluoresceína e iodeto de propídio (CFDA/PI). Já, Thomas et al. (1998), avaliando a integridade de membrana com SYBR-14/PI, encontraram r = 0,98 (p < 0,05) com a motilidade. Com o uso da clortetraciclina (CTC) para avaliar a ocorrência de capacitação espermática,

16 14 Januskauskas et al. (1999) relataram que o percentual de células não capacitadas teve correlação com a motilidade subjetiva (r = 0,41; p < 0,001) e computadorizada (r = 0,51; p < 0,001). Em estudo realizado por Garner et al. (1997) foi observado alta correlação entre função mitocondrial avaliada pelo iodeto de 5,5,6,6 -tetracloro-1,1,3,3 -tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1), rhodamina 123 (R123) e Mito Tracker Green FM (MITO) com viabilidade avaliada com SYBR-14/PI (r = 0,99; r = 0,98; e r = 0,97; p < 0,01; respectivamente) além de alta correlação entre si. Ainda, viabilidade teve alta correlação com motilidade (r = 0,97; p < 0,01). De acordo com estudo retrospectivo de Graham (2001), as correlações entre fertilidade a campo e apenas um atributo do sêmen congelado de touros variam consideravelmente entre estudos, sendo com a motilidade espermática de 0,15 a 0,84; para morfologia, de 0,06 a 0,86 e; entre fertilidade e integridade da membrana plasmática de 0,33 a 0, Morfologia espermática A morfologia espermática é um dos parâmetros rotineiros utilizados para a avaliação da qualidade do sêmen de touros e permite eliminar aqueles com baixo potencial fertilizante, priorizando a entrada de bons reprodutores em programas de teste de progênie e preservação do sêmen (AMANN, 1981; JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002). As causas de defeitos espermáticos podem ser ambientais, genéticas ou a combinação de ambas (CHENOWETH, 2005). Corrêa et al. (1997), avaliando sêmen criopreservado de touros, observaram correlação significativa entre morfologia normal e TNR dias (r = 0,59 p < 0,01). Além disso, Phillips et al. (2004) avaliando motilidade, concentração, morfologia e viabilidade espermática observaram que morfologia foi o parâmetro individual mais consistente para estimar a capacidade fertilizante de uma amostra de sêmen bovino pós-descongelação, medida pela TNR (r 2 = 70; p < 0,001). E, ainda, Brito et al. (2003) observaram que a morfologia é um bom indicador da fertilidade in vitro, explicando 16% da variação da taxa de clivagem.

17 15 De acordo com Tartaglione e Ritta (2004) a integridade da membrana plasmática (eosina) e do acrossomo (trypan blue/giemsa-tbg) são melhores para estimar a fertilidade in vitro que a avaliação da morfologia e motilidade espermáticas e, de acordo com o relato de Rodriguez-Martinez (2000), morfologia e motilidade têm demonstrado diferentes associações com fertilidade. 2.4 Avaliação da Integridade Estrutural do Espermatozóide Integridade da membrana plasmática A integridade da membrana plasmática reflete a viabilidade espermática sendo o principal local onde ocorrem lesões durante a criopreservação do sêmen (JANUSKUSKAS; ZILINSKAS, 2002). Porém, a teca perinuclear (MARTINEZ et al., 2006), região pós acrossomal, anulus (ANZAR et al., 1997) e outros elementos do citoesqueleto (WATSON, 2000) também podem ser lesados e, assim, contribuírem para a redução da viabilidade do sêmen criopreservado, sugerindo que a diminuição da viabilidade pode ser atribuída não apenas à lesão primária da membrana plasmática (HOLT, 2000) Diacetato de 6-carboxifluoresceína e iodeto de propídio Vários eventos relacionados a fecundação como a CAP, RA e fusão com o ovócito, requerem uma membrana plasmática e acrossomo intactos (TARTAGLIONE; RITTA, 2004; BRITO et al., 2003) já que, uma vez lesado o espermatozóide não é capaz de regenerar a membrana plasmática comprometida (NUR et al., 2005). Assim, a avaliação de sua viabilidade pode ser útil para predizer a capacidade fertilizante do espermatozóide. O desenvolvimento de técnicas de coloração usando fluorocromos tem fornecido novas ferramentas para avaliar o sêmen pós-descongelação. Isolados ou em combinação podem ser usados para determinar a integridade das membranas e podem ser visualizados simultânea ou separadamente, usando diferentes filtros (RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2000; JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002; GILLAN et al., 2005).

18 16 Os estudos iniciais para a avaliação da membrana plasmática dos espermatozóides de touros com CFDA/PI foram realizados em citômetro de fluxo (GARNER et al., 1986). Só em 1990, Harrison e Vickers acrescentaram o uso de baixas concentrações de formaldeído, permitindo assim, a avaliação em microscopia de epifluorescência, aumentando a aplicabilidade da técnica. A combinação do diacetato de 6-carboxifluoresceína (CFDA) com iodeto de propídeo (PI) permite determinar a viabilidade dos espermatozóides devido às suas características moleculares. A membrana plasmática intacta é permeável ao CFDA e esterases intra-celulares o convertem em composto fluorescente, a fluoresceína. Esta é incapaz de atravessar a membrana intacta, sendo retida no citoplasma (GILLAN et al., 2005; HOLT; NORTH, 1994), corando em verde. Corantes para ácido nucléico como o PI, identificam espermatozóides mortos corando seu núcleo em vermelho, pois a membrana plasmática intacta impede sua entrada na célula (GARNER et al., 1986). Assim, quando o CFDA é usado com o PI, três populações de células podem ser identificadas, como descrito por Harrison e Vickers (1990): vivas, se coram em verde; mortas, em vermelho e uma terceira população se cora com ambos acrossomo em verde e núcleo em vermelho e são considerados semi-lesados. Pintado et al. (2000) observaram que o PI é um bom indicador de células lesadas, apresentando correlação positiva tanto com Hoechst (r = 0,80; p < 0,01) quanto com eosina/nigrosina/giemsa (r = 0,69; p < 0,01). Garner et al. (1986) usando a associação CFDA/PI, observaram que, embora não significativa (p = 0,06), houve correlação negativa (r = 0,57) entre o aumento de células lesadas e decréscimo de espermatozóides íntegros com a fertilidade (TNR-90 dias). Já, Brito et al. (2003) não obtiveram correlação entre a taxa de clivagem e integridade de membrana plasmática. Da mesma forma, Phillips et al. (2004) avaliando integridade de membrana (SYBR- 14/PI) do sêmen congelado de touro, não observaram correlação significativa com TNR, nem com a taxa de concepção.

19 Eosina nigrosina O corante supravital eosina é indicador da integridade da membrana plasmática, corando apenas espermatozóides mortos, ou seja, com a membrana plasmática lesada, e é comumente associado a nigrosina, que é responsável pelo contraste do fundo da lâmina (BARTH; OKO, 1989). Essa coloração foi descrita pela primeira vez em 1951 por Swanson e Bearden, e desde então vem sendo amplamente usada. A habilidade da eosina/nigrosina (EN) de diferenciar células mortas foi confirmada por Pintado et al. (2000) que, avaliando sêmen de touro pós-descongelação, observaram alta correlação entre EN e iodeto de propídeo (PI) (r = 0,83; p = 0,0009). Brito et al. (2003), avaliando sêmen criopreservado de touro, observaram que as proporções de espermatozóides com membrana plasmática íntegra identificados pela dupla coloração EN ou Trypan blue (TB) foi maior (p <0,0001) que aquelas detectadas pelas sondas fluorescentes CFDA/PI ou SYBR/PI. Apesar da correlação entre a coloração EN com CFDA/PI (r = 0,92; p < 0,01), SYBR/PI (r = 0,58; p < 0,01) e TB (r = 0,93; p < 0,01), nenhum desses testes apresentaram correlação significativa com a taxa de clivagem. Já, Tartaglione e Ritta (2004) associando EN com o teste hiposmótico, para avaliar sêmen criopreservado de touros, observaram correlação com a fertilidade in vitro (r = 0,62; p < 0,05), mas quando analisados separadamente, os testes não foram bons estimadores da fertilidade Integridade do acrossomo Aglutinina de Arachis hipogaea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína e iodeto de propídio O teste ideal para determinar a percentagem de espermatozóides que sofreram RA deve ser preciso, rápido, não deve comprometer a função espermática e ser capaz de distinguir a RAV da RAF (CROSS; MEIZEL, 1989). As lecitinas são aglutininas que conjugadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC), uma sonda fluorescente, são utilizadas para a verificação do status acrossomal (SUZUKI et al.,

20 ). As lecitinas têm afinidade específica por determinadas moléculas sacarídicas (carboidratos) da matriz acrossomal ou da membrana acrossomal externa (MAE) (FLESCH et al., 1998; CHAN et al., 2002; MAGARGEE et al., 1988; SIRIVAIDYAPONG et al., 2000) e requerem permeabilidade celular (CROSS; MEIZEL, 1989). Uma das lecitinas mais usadas é a Arachis hypogaea - aglutinina do amendoim (PNA), que se liga à membrana acrossomal externa (CHAN et al., 2002; KITIYANANT et al., 2002). Assim, a aglutinina de Arachis hipogaea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína (FITC-PNA) tem sido usada para determinar a ocorrência da RA em várias espécies como em humano (CROSS; MEIZEL, 1989), ovino (MAGARGEE et al., 1988), suíno (FAZELI et al., 1997), cão (SIRIVAIDYAPONG et al., 2000) e equino (CHENG et al., 1996). O FITC-PNA foi usado pela primeira vez para verificar o status acrossomal em espermatozóide bovino por CROSS e WATSON (1994). Mas, só recentemente foi associado ao PI, distinguindo assim, vivos e mortos, RAV e RAF (NAGY et al., 2003). Uma MP intacta e funcional se torna impermeável ao FITC-PNA e nenhum sinal de fluorescência é observado. Quando o espermatozóide sofre RA, ocorrem pontos de fusão entre a MP e MAE, resultando na formação de poros, que dão acesso às membranas acrossomais e seu conteúdo e o acrossomo apresenta-se corado em verde RA verdadeira. Quando ocorre a fusão completa entre a MP e MAE, isto resulta na completa perda da capa acrossomal e o espermatozóide apresenta fluorescência apenas no segmento equatorial ou simplesmente não exibe fluorescência (CROSS; MEIZEL, 1989; KITIYANANT et al., 2002; HOLLINSHEAD et al., 2004; CHENG et al., 1996). Dependendo da MAE restante, o FITC-PNA cora com várias intensidades de fluorescência e contraste e não gera dúvidas na leitura como as demais colorações (FAZELI et al., 1997; CROSS; MEIZEL, 1989). O FITC-PNA vem sendo comumente usado em combinação com o PI, que identifica em vermelho células mortas. Espermatozóides com PI e PNA positivo morto com acrossomo reagido, sofreram RA falsa, pois podem ter perdido seu acrossomo com a morte celular (KITIYANANT et al., 2002; FAZELI et al., 1997). Esta técnica necessita de alternância entre microscopia de epifluorescência e campo claro já que o espermatozóide vivo não se cora nem com o FITC-PNA nem com o PI.

21 19 As membranas acrossomais são especialmente propensas a danos causados pela criopreservação (RISOPATRÓN et al., 1996), assim, o status acrossomal de uma população espermática é de especial interesse porque o número de espermatozóides que apresentam RA, quando induzida com cálcio ionóforo A23187, tem correlação positiva com a fertilidade (TNR- 90 dias) do sêmen criopreservado de touro (r = 0,86; p < 0,001) de acordo com estudo realizado por Whitfield e Parkinson (1995). Porém, Assumpção et al. (2002), avaliando RA induzida com heparina e cálcio ionóforo A23187, não observaram correlação com fertilidade in vivo. Kitiyanant et al. (2002) usando FITC-PNA e ethidium homodimer-1 (EthD-1) para avaliar RA induzida com heparina e cálcio ionóforo em sêmen criopreservado de búfalo, obtiveram 78% de espermatozóides vivos com acrossomo intacto e 9% de RAV e usando FITC- PNA/TBG obtiveram 80% de vivos e 10% de RAV tanto pela heparina quanto pelo cálcio ionóforo. Além disso, alta correlação foi observada entre as duas técnicas de coloração (r > 0,90), reforçando a capacidade do FITC-PNA de avaliar a RA. Já, Prathalingam et al. (2006) avaliando a integridade do acrossomo com FITC-PNA/PI encontraram 1,16 ± 0,9% de RAV em sêmen de touro pós descongelação Trypan blue/giemsa A primeira descrição do uso do trypan blue/giemsa (TBG) para determinar simultaneamente viabilidade espermática e status acrossomal foi feita por Didion et al. (1989). Desde então tem sido usada por ser uma técnica acessível, simples, eficiente, de baixo custo (KITIYANANT et al., 2002) e pode ser empregada para estimar o potencial fertilizante de amostras de sêmen bovino destinadas a fecundação in vitro ou IA (TARTAGLIONE; RITTA, 2004). O TB é um corante vital que detecta espermatozóides mortos, com membrana lesada, corando-os em azul, enquanto espermatozóides intactos (vivos) não se coram (SUTTIYOTIN; THWAITES, 1994; TALBOT; CHACON, 1981). Já, o Giemsa indica ausência ou presença do acrossomo, corando em roxo ou rosa escuro o acrossomo intacto (TARTAGLIONE; RITTA, 2004; WAY et al., 1995). Essa coloração é útil para estudar a ocorrência da RA (SUTTIYOTIN; THWAITES, 1991), pois permite a diferenciação de espermatozóides que sofreram RAV

22 20 daqueles que sofreram RAF e tem sido usada em várias espécies como bovino, suíno, ovino e equino (DIDION et al., 1989). Quando o sêmen é corado com TBG, quatro categorias são consideradas: a) vivo com acrossomo intacto; b) morto com acrossomo intacto; c) vivo sem acrossomo (RAV) e d) morto sem acrossomo (RAF). Os acrossomos de espermatozóides mortos são corados mais intensamente que os acrossomos de vivos, e a região sem acrossomo de espermatozóides mortos também é mais escura que a mesma área nos vivos (DIDION et al., 1989). A percentagem de espermatozóides corados com TB aumenta com o aumento da concentração do corante, aumento da temperatura de incubação de 30 a 40 C sendo ótima entre 37 a 40 C e tempo de exposição ao corante que deve ser o mínimo de tempo possível até 15 minutos. A exposição ao corante por mais de 60 minutos resultou no aumento de células coradas em 6,1% (p < 0,01). Entre 1 a 15 minutos não houve diferença significativa, mas o número de espermatozóides corados com TB foi maior aos 30 minutos que com 1 minuto (55,7% e 50,5%, respectivamente; p < 0,05) (SUTTIYOTIN; THWAITES, 1991). Porém Talbot e Chacon (1981) avaliando sêmen humano a fresco, observaram que a incubação deve ser no mínimo de 15 minutos antes da lavagem e fixação. O procedimento ideal deve ser rápido, preciso e sem efeitos tóxicos. Suttiyotin e Thwaites (1991), avaliando sêmen fresco de ovino, observaram correlação significativa entre a percentagem conhecida de espermatozóides mortos e células coradas com TB (r = 0,95; p < 0,05). Já, Didion et al. (1989) observaram que a motilidade é semelhante à percentagem de espermatozóides vivos, não corados com TB e a associação do Giemsa com TB não modificou sua habilidade de diferenciar vivos e mortos e o TBG foi idêntico ao contraste de interferência diferencial na avaliação da ocorrência da RA, confirmando a validade da técnica. A técnica possui várias vantagens, pois os esfregaços são observados em microscópio de campo claro, podem ser lidos em momento conveniente, podem ser fixados com rápida secagem por secador e as lavagens não influenciam o status acrossomal (TBG). Uma desvantagem é que não diferencia espermatozóide morto que perdeu o acrossomo após a morte celular (RAF) de espermatozóide que sofreu a RAV e então morreu antes da fixação (DIDION et al., 1989). Portanto, considerando que a fecundação é um processo multifatorial, a avaliação de vários atributos permite melhor acurácia na estimação da capacidade fertilizante do

23 21 espermatozóide (AMANN; HAMMERSTEDT, 1993). Testes laboratoriais podem ter grande utilidade na avaliação do sêmen antes da estação de monta e são necessários para que touros de baixo potecial fertilizante não entrem em programas de IA. Desta forma, estudos têm sido realizados com o objetivo de identificar qual teste ou associação de testes tem maior correlação com a fertilidade in vivo.

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32 30 Avaliação da Integridade Estrutural da Membrana Plasmática e do Acrossomo do Espermatozóide Criopreservado de Touros Resumo A criopreservação causa danos irreversíveis nas membranas espermáticas como a ruptura das plasmática e acrossomal. A integridade da membrana plasmática tem sido estudada usando diferentes técnicas incluindo as sondas fluorescentes diacetato de 6-carboxifluoresceína associada ao iodeto de propídio (CFDA/PI) e eosina-nigrosina (EN); e a integridade do acrossomo incluindo a lecitina Arachis hypogaea conjugada a sonda fluorescente isotiocianato de fluoresceína associada ao PI (FITC-PNA/PI) e o corante trypan-blue/giemsa (TBG). O objetivo deste estudo foi a utilização desses testes para avaliar a integridade da membrana plasmática e do acrossomo e verificar se os resultados desses testes têm correlação com a fertilidade in vivo. Inseminações foram realizadas em 2036 matrizes Nelore em duas propriedades e quatro estações de monta. Amostras de sêmen pós descongelação de 22 touros Nelore foram avaliadas quanto a motilidade, concentração, morfologia e os testes para avaliar a integridade da membrana plasmática e do acrossomo. Foi realizada análise dos componentes principais e os resultados laboratoriais foram avaliados por correlação de Pearson (SAS Institute, Cary, USA, 1995). Correlação positiva foi encontrada entre concentração (r=0,98; p<0,0001), integridade de membrana com FDA (r=0,92; p<0,0001) e EN (r=0,70; p=0,0002) e do acrossomo com FITC- PNA (r=0,92; p<0,0001) e TBG (r=0,90; p<0,0001) com fertilidade in vivo. Os testes CFDA/PI, EN, FITC-PNA/PI e TBG juntos responderam por 78% da variação na taxa de prenhez. Portanto, a integridade da membrana plasmática e do acrossomo podem ser consideradas importantes variáveis para a função espermática e esses testes podem ser usados para avaliar a qualidade de uma amostra de sêmen destinado a IA. Palavras-chave: Sêmen congelado de touro, avaliação do sêmen, integridade da membrana plasmática, integridade do acrossomo, fertilidade.

33 31 Structural Integrity Assessment of Plasma Membrane and Acrosome of Cryopreserved Bull Sperm Abstract Cryopreservation imposes irreversible damage to sperm membranes such as disruption of plasma and acrosome membranes. Plasma membrane integrity has been widely studied using different techniques, including fluorescent probes as 6-carboxifluorescein diacetate and propidium iodide (CFDA/PI) and eosin nigrosin (EN); and the acrosome integrity by Arachis hypogaea lectin conjugated with a fluorescent probe, fluorescein isothiocyanate and PI (FITC- PNA/PI) and trypan-blue/giemsa (TBG). The aim of this study was to combine these tests to evaluate membrane and acrosome integrity and determine if the results of these assays were associated with in vivo fertility. Insemination was performed in 2036 Nelore bovine female in two properties at four breeding season. Semen samples pos thawing of 22 Nelore bulls was assessed to motility, concentration, morphology and to membrane and acrosome integrity. PRINCOMP procedure was made and the laboratorial results was correlated by Pearson (SAS Institute, Cary, USA, 1995). Positive correlation was observed between membrane FDA (r=0,92; p<0,0001) and EN (r=0,70; p=0,0002) and acrosome integrity with FITC-PNA/PI (r=0,92; p<0,0001) and TBG (r=0,90; p<0,0001) and in vivo fertility. The tests CFDA/PI, EN, FITC- PNA/PI and TBG together account for 78% of variation in fertilization rates. Therefore membrane and acrosome integrity can be considered important variables for normal sperm function and these tests can be used to assess the quality of a semen sample used for AI. Keywords: Frozen-thawed bovine spermatozoa, semen assay, membrane integrity, acrosome integrity, fertility.

34 32 Introdução A inseminação artificial (IA) tem fornecido uma significativa contribuição genética para o melhoramento do rebanho bovino. Entretanto esse impacto não seria possível sem a criopreservação do sêmen, porém os efeitos da criopreservação sobre o espermatozóide variam desde a injúria letal (WATSON, 2000) àquelas que prejudicam a estrutura celular (HAMMERSTEDT et al., 1990). Além disso, apenas metade dos espermatozóides sobrevive ao processo de criopreservação (JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002). Para que ocorra a fertilização é necessário que haja uma percentagem de espermatozóides com total potencial, sendo assim, um espermatozóide precisa expressar e suprimir adequadamente vários atributos numa seqüência correta, com local e tempo adequados como a capacitação (CAP) e a reação do acrossomo (RA) (AMANN; HAMMERSTEDT, 1993). Exames laboratoriais comumente usados para avaliar a qualidade de uma amostra de sêmen antes do seu uso na IA têm envolvido uma observação da percentagem de espermatozóides móveis, morfologicamente normais e a concentração de uma dose de sêmen (ASBIA, 2006; GILLAN et al., 2005), mas esses exames não são suficientes para estimar a fertilidade de uma amostra (GILLAN et al., 2005). Nesse contexto, a avaliação da integridade da membrana plasmática e do acrossomo é de particular importância desde que uma membrana e acrossomo intactos são necessários para o metabolismo, CAP, RA e, finalmente, fecundação (JEYENDRAN et al., 1984). A eosina nigrosina (EN) que é um corante supravital e o diacetato de 6-carboxifluoresceína (CFDA), um corante fluorescente comumente associado ao iodeto de propídio (PI) permitem avaliar a integridade da membrana plasmática. O trypan blue associado ao Giemsa e a lecitina Arachis hypogaea conjugada ao isotiocianato do fluoresceína (FITC-PNA) associada ao PI avaliam o status acrossomal de uma população de espermatozóides. Muitos métodos estão sendo usados para estimar o potencial fertilizante de uma amostra de sêmen e a correlação com a fertilidade in vivo (RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2006). O objetivo do presente estudo foi a utilização de exames para avaliar a integridade da membrana plasmática e a integridade do acrossomo e verificar a correlação entre as técnicas e destas com a fertilidade in vivo.

35 33 Materiais e Métodos Animais e local Os dados de campo foram obtidos junto a duas propriedades rurais, sendo a Fazenda 1 localizada a ,96 S e ,05 O, no município de Juti MS e a Fazenda 2 a ,62 S e ,89 O no município de Aquidauana MS. Foram submetidas a inseminação artificial fêmeas da raça Nelore, pertencentes a diferentes categorias reprodutivas sendo vacas, 256 primíparas e 406 novilhas das quais matrizes pertencentes a fazenda 1 e 710 a fazenda 2. Os dados compreenderam quatro estações de monta: 2002/2003, 2003/2004, 2005/2005 e 2006/2006, com observações de cio no início da manhã e final da tarde, e o diagnóstico de gestação por palpação retal foi realizado 90 dias após o término da estação de monta. Nas Fazendas 1 e 2, seis e dois inseminadores, realizaram as inseminações artificiais com doses de 12 e 10 touros Nelore, respectivamente. A taxa de gestação foi usada como índice para aferir a fertilidade dos touros a campo. Avaliações das características físicas e morfológicas do sêmen Motilidade As doses utilizadas encontravam-se acondicionadas em palhetas de 0,5 ml e 0,25 ml, estocadas em nitrogênio líquido e foram avaliadas no Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal-UFMS. Para a descongelação as palhetas foram imersas em banho-maria (MD 100 Fanem) a uma temperatura de 37 C por 30 segundos. Avaliou-se a motilidade espermática depositando uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula, mantidas a 37ºC. A avaliação subjetiva foi feita sob microscopia de campo claro (Axiolab, Zeiss, Alemanha), com objetiva de 10 e 40X. O resultado foi expresso em percentagem conforme a estimativa da proporção total de espermatozóides móveis. Concentração Procedia-se a diluição do sêmen em solução de formol-salina-tamponada na proporção de 1:20, a amostra era homogeneizada e depositada em Câmara de Neubauer, sendo realizada a