EFEITO DO TEMPO NA INCLUSÃO DA LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO CRIOPRESERVADO

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1 EFEITO DO TEMPO NA INCLUSÃO DA LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO CRIOPRESERVADO Autor(es): Apresentador: Orientador: Revisor 1: Revisor 2: Instituição: SCHIAVON, Raquel Schiavon; CORCINI, Carine Dahl; PRESTES, Rodrigo Cavalli; CARVALHO, Cristiane; LAVADOURO, Bárbara Joseane Bastos; JULIANO, Flavio; LUCIA JR, Thomaz; DESCHAMPS, João Carlos; VARELA JUNIOR, Antonio Sergio Raquel Schiavon Schiavon Antonio Sergio Varela Junior Tiago Collares Marta Gonçalves Amaral Universidade Federal de Pelotas EFEITO DO TEMPO NA INCLUSÃO DA LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO CRIOPRESERVADO SCHIAVON, Raquel Schiavon 1 ; CORCINI, Carine Dahl 1 ; PRESTES, Rodrigo Cavalli 2 ; CARVALHO, Cristiane 2 ; LAVADOURO, Bárbara Joseane Bastos 2 ; JULIANO, Flavio 2 ; LUCIA JR, Thomaz 1 ; DESCHAMPS, João Carlos 1 ; VARELA JUNIOR, Antonio Sergio 2. 1 Laboratório de Reprodução Animal- Centro de Biotecnologia UFPel 2 Departamento de Ciências Morfo-Biológicas - FURG Campus Carreiros Avenida Itália, km 8 - CEP raquelsk2@gmail.com 1. INTRODUÇÃO Durante as últimas décadas vem aumentando a utilização de sêmen refrigerado e criopreservado em caninos. Entretanto, o processo de preservação pelo frio provoca alterações em diversos componentes das células espermáticas (acrossoma, núcleo, mitocôndria, axonema e membrana plasmática), reduzindo assim a qualidade do ejaculado quando comparado ao sêmen fresco (Amirat L et al, 2004; Watson PF, 2000). Conseqüentemente, os protocolos de resfriamento e/ou congelamento, através da utilização de diluentes, visam prevenir a formação de cristais de gelo intracelular e lesões na membrana celular e. Entretanto, as etapas de refrigeração e/ou congelamento podem provocar o choque térmico, diminuindo a viabilidade espermática. Isto se dá em função de alterações na estrutura e funcionalidade celular (Conacannon PW & Batista M, 1989), podendo causar alterações morfológicas e diminuição da motilidade espermática (Holt WV, 2000). Com o intuito de proteger o espermatozóide utiliza-se, como crioprotetor externo, a lipoproteína de baixa densidade (LDL), por associar-se à membrana

2 espermática protegendo os espermatozóides (Bergeron A et al, 2004; Watson PF, 1981). Foulkes (1977) e Graham & Foot (1987) sugerem que a LDL pode também se aderir à membrana celular durante o processo de preservação espermática. Segundo Anton et al. (2003), a LDL promove uma película interfacial entre ácidos graxos e a água. Entretanto, Bergerom et al. (2004) comprovaram que a LDL promove a entrada de fosfolipídios e colesterol para a membrana dos espermatozóides e também previne a saída dos mesmos da membrana espermática (Bergeron et al, 2004), formando um complexo com as proteínas do plasma seminal (Bergeron et al, 2004; Majunath P et al, 2002), de modo que estas não fiquem disponíveis para atuarem negativamente sobre a membrana. A prevenção do efluxo de fosfolipídios (Bergeron A et al, 2004; Thérien I et al, 1999) e colesterol (Bergeron et al, 2004), confere à célula espermática maior resistência ao choque térmico. Todavia, a entrada da LDL na membrana espermática é lenta, levando aproximadamente 8 horas a 5ºC para que ocorra o influxo máximo, divergindo assim do tempo de resfriamento considerado ideal na maioria dos protocolos para o congelamento seminal. O objetivo deste trabalho foi estabelecer o tempo ideal de exposição do espermatozóide canino à LDL à 5ºC, durante o processo de criopreservação. 2. MATERIAL E MÉTODOS Animais Foram utilizados 7 cães SRD (Sem Raça Definida) do biotério da FURG, com 8 repetições. Entretanto, quando o ejaculado não apresentava as condições mínimas (80% motilidade e de espermatozóides normais) este era desprezado, totalizando 35 ejaculados. Coleta dos ejaculados As coletas foram feitas através de manipulação digital (Christiansem IJ, 1986), em tubos cônicos estéreis de 50 ml, sendo utilizada somente a segunda fração, rica em espermatozóide. Avaliação dos ejaculados As avaliações de motilidade (percentagem de células móveis) espermática foram feitas logo após a coleta do sêmen, através de microscopia óptica (aumento de 200x), utilizando aproximadamente 10µl de sêmen em lâmina sob lamínula, ambas pré-aquecidas a 37 C (Christiansem IJ, 1986). O acrossoma foi avaliado através da técnica de coloração utilizando lâmina seca corada com Lectin Penout - FICT por 10 minutos, sendo que o acrossoma quando intacto ficava verde e lesado não se corava. A viabilidade espermática foi feita através de sondas de fluorescência (Iodeto de Propídio e Carboxi-fluroxeína), sendo categorizada como células viáveis as coradas em verde e células inviáveis as coradas em vermelho. Purificação do LDL da gema de ovo Separação da gema de ovo e diluição Os ovos foram quebrados manualmente e as gemas separadas das claras. Cada gema foi colocada sobre um papel filtro para remoção da chalaça e traços de clara aderida à membrana vitelínica, que foi rompida. A gema foi colocada em um Becker resfriado com gelo. Fracionamento do plasma

3 Separou-se a fração plasmática da gema, método descrito por McBee e Cotterill (1979), onde a gema de ovo é diluída já no Tris-glucose. Extração do LDL O LDL foi extraído do plasma da gema do ovo através de duas centrifugações a x g por 45 min, sendo sempre retirado o sobrenadante, rico em LDL. Separando desta forma os grânulos de minerais, células e subprodutos da gema que são prejudiciais à qualidade espermática. Diluentes Tris-glucose foi formulado com 3,025 g de Tris hidroximetil aminometano, 1,7 g de ácido cítrico, 1,25 g de glicose, 100 mg de benzilpenicilina, 100 mg de sulfato de dihidroestreptomicina para 100 ml de água destilada (Iguer-ouada M, 2001), adicionado de 8% de LDL e 5% de glicerol. O ph do diluente foi ajustado em 6,85 (Iguer-ouada M, 2001). Processamento do sêmen Após ser coletado, o sêmen foi diluído 1/4 (v/v) com diluente Tris Glicose a 37 C, em seguida, centrifugado a 800 x g por 5 min. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspendido no diluente padrão. O sêmen já diluído foi submerso em 200 ml de água isotérmica com o intuito de prevenir o choque térmico, em virtude das altas variações de temperatura (Linde-Forsberg C & Forsberg M., 1993). Durante o período experimental o sêmen permaneceu a 20 C por 1h e depois foi submetido a um resfriamento de duas horas até chegar a 5 C (tratamento controle =T1). Após as palhetas foram expostas ao vapor de N 2 líquido permanecendo a 5 cm do N 2 líquido por 10 min e após submersas no mesmo. Já no tratamento 2 e 3 (T2 e T3) o sêmen permaneceu mais 4 e 8h, respectivamente, a 5ºC. O descongelamento das amostras foi feito 7 dias após terem sido congeladas, à 70 C por 8 segundos e esta permaneceu a 37 C por 5 min para serem avaliadas. Análise estatística Os dados foram analisados utilizando o programa Statistix (Statistix 8 Analytical Software, 2003). Para as variáveis dependentes: motilidade, viabilidade e integridade de acrossoma foram feitas análise de variância com medidas repetidas com posterior comparação entre as médias através do teste Tukey. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0, RESULTADOS E DISCUSSÃO Está demonstrada na figura 1 a ação da coloração Lectin Penout FICT para análise se acrossoma e da fluorescência (Iodeto de Propídio e Carboxi-fluroxeina) para análise da viabilidade espermática. Figura 1: Espermatozóides com acrossoma lesado e com acrossoma intacto (foto da esquerda), espermatozóides viáveis e inviáveis (foto da direita)

4 Os resultados das avaliações seminais, após o descongelamento, de motilidade espermática, viabilidade e percentual de células com acrossomas intactos estão apresentado na Tabela 1. Tabela1: Resultados das avaliações de motilidade espermática, viabilidade e acrossomas intactos dos tratamentos após o descongelamento (média ± erro padrão da média). Tratamento Motilidade Viabilidade Acrossomas intactos T1 55,1 ± 2,9 54,3 ± 2,6 62,5 ± 3,5 T2 60,8 ± 2,8 56,1 ± 2,3 65,2 ± 3,2 T3 57,4 ± 3,1 57,8 ± 1,8 67,6 ± 2,4 Não existiu diferença estatística (P>0,05) entre os tratamentos, na mesma coluna. Não ocorreu diferença estatística entre os tratamentos para as variáveis dependentes motilidade, viabilidade e acrossomas intactos. Desta forma podemos utilizar qualquer um dos tempos de permanência a 5 C, optando pelo que melhor se adequar a rotina do laboratório. Apesar de Bergeron et al (2004) ter comprovado que o platô de influxo de fosfolipídios é alcançado somente após 8h a 5ºC, este tempo não é necessário para que ocorra a máxima proteção aos espermatozóides. Isto foi corroborado quando as análises da qualidade seminal (motilidade, viabilidade e acrossomas intactos) dentre os tratamentos T1, T2 e T3 não apresentaram diferenças (P>0,05) significativas. Desta forma o processo de congelamento pode ocorrer coletando-se vários machos simultaneamente e congelando nos momentos de maior disponibilidade de tempo, espaço e mão de obra. 3. CONCLUSÕES Concluímos que podemos utilizar qualquer um dos protocolos de congelamento, pois não existiu diferença entre os tratamentos nas variáveis motilidade, viabilidade e integridade do acrossoma. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMIRAT L; TAINTURIER D; JEANNEAU L; THORIN C; GERARD O; COURTENS JL; ANTON M. Bull semen in vitro fertility after cryopreservation using egg yolk LDL: a comparison with Optidyl, a commercial egg yolk extender. Theriogenology, 2004, 61, p ANTON M; MARTINET V; DALGALARRONDO M; BEAUMAL V; DAVID-BRIAND E; RABESONA H. Chemical and structural characterization of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Food Chemistry 2003, 83, p BERGERON A; CRÊTE MH; BRINDLE Y; MANJUNATH P. Low-density lipoprotein fraction from hen`s egg yolk decreases the binding of the major protein of bovine seminal plasma to sperm and prevents lipid efflux from the sperm membrane. Biol Reprod, 2004, 70 p CONACANNON PW; BATISTA M. Canine semen freezing and artificial insemination. In:Veterinary Terapy ; 10. Philadelphia W. B, 1989, p CHRISTIANSEN IJ. Reprodução no cão e no gato. Ed. Manole, São Paulo-SP FOULKES JA. The separation of lipoproteins from egg yolk and their effect on the motility and integrity of bovine spermatozoa. J. Reprod Fertil, 1977, 49, p

5 GRAHM JK; FOOTE RH. Effect of several lipids fatty acyl chain length and degree of unsaturation on the motility of bull spermatozoa after cold shock and freezing. Crybiology 1987, 24, p HOLT WV. Fundamental aspects of sperm cryobiology: the importance of species and individual differences. Theriogenology, 2000, 53, IGUER-OUADA M, VESTEGEN Long-term preservation of chilled canine semen : Effect of commercial and laboratory prepared extenders. Theriogenology, 2001, 55, p LINDE-FORSBERG C; FORSBERG M. Results of 527 controlled artificial inseminations in dogs. J Reprod Fertil Suppl p MAJUNATH P; NAUC V; BERGERON A; MENARD M. Major Proteins of bovine seminal plasma bind to the low-density lipoprotein fraction of hen s egg yolk. Biol Reprod, 2002, 67 p MCBEE L; COTTERILL 0. Ion exchange chromatography and electrophoresis of egg yolk. J Food Sci 1979, 44, p STATISTIX. Statistix 8 Analytical Software. User s manual. Tallahassee p THÉRIEN I; MOREAU R; MANJUNATH P. Bovine seminal plasma phopholipidbinding Proteins stimulate phospholipid efflux from epididymal sperm. 1999, 61, p WATSON PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci 2000, 60 61, p WATSON PF. The roles of lipid and protein in the protection of ram spermatozoa at 5 degrees C by egg-yolk lipoprotein. J Reprod Fertil, 1981, 62, p