ACONDICIONAMENTO DE SÊMEN CANINO PARA TRANSPORTE UTILIZANDO DIFERENTES DILUENTES. (Packaging of canine semen for transport using different extenders)

Transcrição

1 Ciência Animal, 17(1):37-44,2007 ACONDICIONAMENTO DE SÊMEN CANINO PARA TRANSPORTE UTILIZANDO DIFERENTES DILUENTES (Packaging of canine semen for transport using different extenders) Maykeline Valeska do NASCIMENTO, Antonio Cavalcante MOTA-FILHO & Alexandre Rodrigues SILVA * Departamento de Ciências Animais, Universidade Federal Rural do Semi-Árido RESUMO Este trabalho objetivou determinar o período máximo de conservação do sêmen canino diluído em Tris ou leite UHT desnatado armazenado em caixas de isopor de 3L, mimetizando as condições de transporte. O sêmen de oito cães foi coletado por manipulação digital. A fração espermática foi avaliada quanto ao volume, coloração, motilidade progressiva, morfologia espermática, integridade acrossomal, função de membrana plasmática e concentração espermática. Em seguida, foi dividida em duas alíquotas: a primeira foi diluída em Tris e a segunda em leite UHT desnatado. O sêmen foi armazenado em caixas térmicas contendo gelo reciclável, fazendo-se novas avaliações microscópicas às 12 h, 18 h, 24 h, 30 h e 36 h. No uso do leite UHT, a motilidade espermática progressiva (60,6 ± 15,0%) foi conservada de maneira aceitável até as 24 h. No uso do Tris, a motilidade espermática (61,9 ± 15,1%) manteve-se dentro da faixa aceitável para realização de inseminações artificiais por até 36 h. Não foram verificadas diferenças significativas entre os diluentes testados com relação à conservação da morfologia espermática, integridade acrossomal e função da membrana plasmática (P > 0,05). Em conclusão, o sêmen canino pode ser acondicionado para transporte em caixas de isopor de 3L por até 24 h utilizando-se o diluente leite UHT ou por até 36 h no uso do diluente Tris, ambos acrescidos de gema de ovo. PALAVRAS-CHAVE: sêmen, cão, conservação, Tris, leite ABSTRACT This study aimed to determine the maximum time for conservation of canine semen extended in Tris or UHT skim milk, stored in 3L styrofoam boxes for transport. Semen from eight dogs was collected by digital manipulation. The sperm fraction was evaluated for volume, color, progressive motility, sperm morphology, acrossomal integrity, plasmatic membrane function and sperm concentration. Then it was divided in two aliquots: the first was diluted in Tris and the second in UHT skim milk. The semen samples were stored in thermal boxes containing recyclable ice. New microscopic evaluations were performed at 12 h, 18 h, 24 h, 30 h and 36 h. With the use of milk extender, sperm motility (60.6 ± 15.0%) was acceptably conserved up to 24 h. With the use of Tris, sperm motility (61.9 ± 15.1%) was in the acceptable range for artificial insemination, up to 36 h. Significant differences were not found between the extenders regarding conservation of sperm morphology, acrossomal integrity and plasmatic membrane function (P> 0.05). The conclusion is that canine semen can be packaged for transport in 3L styrofoam boxes for up 24 h by using UHT milk extender or for up 36 h with the use of Tris extender, both plus egg yolk. KEY-WORDS: semen, dog, conservation, Tris, milk *Endereço para correspondência: DCAN/UFERSA, s/n, BR 110, Km 47, Costa e Silva, , Mossoró RN, Brasil legio2000@yahoo.com Ciência Animal, 17(1):37-44,

2 INTRODUÇÃO O desenvolvimento de protocolos de preservação espermática que viabilizem o transporte de sêmen dentro e entre países desperta o interesse de médicos veterinários e criadores de cães, visto que este procedimento permite o intercâmbio de material genético entre regiões distantes. HARROP (1956) foi o primeiro a descrever a obtenção de crias viáveis a partir de inseminação artificial após o transporte intercontinental do sêmen canino refrigerado e diluído em leite. Esta substância foi demonstrada como um excelente diluente para a manutenção da viabilidade do sêmen canino por curto período em inúmeros estudos (GILL et al., 1970, ENGLAND & PONZIO, 1996). Na atualidade, entretanto, diluentes à base de Tris associados à gema de ovo têm sido mais amplamente utilizados com o propósito de conservar o sêmen canino (TSUTSUI et al., 2003, PONGLOWHAPAN et al., 2004, VERSTEGEN et al., 2005, SHAHIDUZZAMAN & LINDE- FORSBERG, 2007). Segundo ROMAGNOLI (2002), a diluição do sêmen canino em uma solução composta por leite desnatado adicionado de 20% de gema de ovo permitiria sua conservação por 24 a 36 h, por outro lado, a diluição em Tris-gema conservaria o sêmen canino por até 5 dias. Na atualidade, o interesse pelo aperfeiçoamento das técnicas de refrigeração do sêmen de cães tem sido novamente despertado. Devido à distância entre os laboratórios que realizam a criopreservação de sêmen canino, vários trabalhos têm mostrado a possibilidade do acondicionamento do sêmen sob refrigeração, visando seu transporte até o local de processamento e posterior criopreservação (CHIRINÉA et al., 2006; HERMANSSON & LINDE-FORSBERG, 2006). Apesar da maioria dos experimentos sobre refrigeração do sêmen canino ser realizada utilizando-se refrigeradores convencionais (STRÖM-HOLST et al., 2000, PONGLOWHAPAN et al., 2004, CARDOSO, 2006, SHAHIDUZZAMAN & LINDE- FORSBERG, 2007), as caixas térmicas de isopor (LINDE-FORSBERG, 2001, SILVA et al., 2004, UCHOA et al., 2007) têm sido utilizadas como uma alternativa viável e de baixo custo para a conservação visando o transporte de sêmen. Em eqüinos, um estudo recente procurou estabelecer parâmetros seguros para o uso comercial deste equipamento no acondicionamento e transporte de sêmen (NUNES, 2007). Entretanto, em cães, este uso tem sido realizado empiricamente, pois estudos sistemáticos objetivando a determinação do período máximo de conservação nesses recipientes são praticamente inexistentes. Essa informação permitiria uma programação confiável para o envio de sêmen entre regiões distantes, contribuindo para a redução de perdas de qualidade do material. O presente estudo objetivou determinar o período máximo de conservação da viabilidade in vitro do sêmen canino diluído em Tris ou leite UHT desnatado armazenado em caixas de isopor de 3L, mimetizando as condições de transporte. MATERIAL E MÉTODOS Animais experimentais Utilizaram-se ejaculados de 8 cães adultos da raça American Pit Bull Terrier, com idade variando de 12 a 24 meses, oriundos de canis particulares localizados na cidade de Mossoró-RN. Os animais foram alimentados com ração comercial uma vez ao dia, tendo livre acesso à água. Coleta e avaliação de sêmen Cada animal foi submetido a uma coleta de sêmen por manipulação digital do bulbo peniano, retendo-se a fração espermática para uso no experimento. Após a coleta, foi feita a avaliação do sêmen (JOHNSTON et al., 2001), observando-se o volume e coloração da amostra. A motilidade progressiva (%) foi avaliada por microscopia de luz (400x). Apenas as amostras que apresentaram motilidade progressiva > 80% foram utilizadas no experimento. Um esfregaço de sêmen foi confeccionado e corado com Rosa de Bengala para avaliação das alterações morfológicas e da integridade acrossomal, sendo contadas 200 células sob microscopia de luz 38 Ciência Animal, 17(1):37-44,2007

3 (1000x). A concentração espermática foi determinada, utilizando-se um hemocitômetro. Para avaliação da função de membrana dos espermatozóides, uma alíquota de 10 µl de sêmen foi incubada a 38 C em 90 µl de água destilada (0mOsm/L). Após 30 minutos, procedeu-se avaliação de 200 células por meio da microscopia (400x). As células que apresentavam resposta osmótica típica, representada pelo encurvamento e edemaciação da cauda, foram consideradas como portadoras de uma membrana plasmática funcional (QUINTELA et al., 2004). Diluição do sêmen Após análise inicial, a fração espermática foi dividida em duas alíquotas, as quais foram diluídas na proporção de uma parte de sêmen para duas partes (1:2) de diluente. A primeira alíquota foi diluída em uma solução constituída por 3,028g de Tris-hidroximetil-aminometano, 1,78g de ácido cítrico mono-hidratado, e 1,25g de frutose, diluídos em 100mL de água destilada. O diluente foi acrescido de um teor de 20% de gema de ovo (SILVA et al., 2002). A segunda alíquota foi diluída em uma solução composta por 2,4 ml de leite UHT desnatado (Betânia ), acrescido de 0,6 ml de gema de ovo (ROMAGNOLI, 2002). Cada diluente foi adicionado de 1000 UI de penicilina/ml e 10 µg de estreptomicina/ml de diluente. Processamento do sêmen As amostras diluídas em Tris ou leite foram divididas em 5 alíquotas e agrupadas em pares formados por uma amostra com cada diluente. Cada par foi mantido em tubos plásticos (1,5 ml))individuais revestidos por papel alumínio, e acondicionados em caixa térmica de isopor (3 L; 11 x 19 x 14cm), contendo 1L de gelo reciclável (SILVA et al., 2004). Foram utilizadas cinco caixas de isopor, enumeradas de 1 a 5. O par de alíquotas da caixa 1 foi analisado 12 h após o acondicionamento. Os pares seguintes foram avaliados a cada 6 h, até completar 36 h de conservação. A cada avaliação, o sêmen refrigerado foi analisado quanto à motilidade progressiva, morfologia espermática, integridade acrossomal e resposta osmótica, conforme citado para o sêmen fresco. A temperatura interna das caixas foi mensurada através de um termômetro digital (Digi09 Mercúrio ). Análise estatística Foram realizadas 8 repetições para cada tratamento. Os resultados foram expressos como média e desvio padrão. Os dados percentuais foram submetidos à transformação em ArcoSeno e expressos em graus. O efeito dos diluentes sobre as características seminais microscópicas foi verificado pela ANOVA, seguida do teste de Tukey (P < 0,05). O efeito do tempo sobre as características seminais foi verificado pela ANOVA seguida do teste t de Student (P < 0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO A fração espermática dos ejaculados apresentou coloração branco-opalescente, volume de 1,2 ± 0,4 ml, com concentração de 576,4 ± 165,1 espermatozóides/ml. Foram observados 98,5 ± 5,1% de espermatozóides com movimento progressivo, sendo verificados 78,8 ± 13,4% de espermatozóides morfologicamente normais, com 99,6 ± 0,6% de integridade acrossomal e 98,4 ± 0,6% de membranas plasmáticas funcionais. Essas características evidenciam que o sêmen fresco estava dentro da normalidade para a espécie canina (JOHNSTON et al., 2001). A partir das 12h, a motilidade espermática progressiva foi melhor conservada no uso do diluente Tris em todos os momentos de avaliação (Tab. 1). Um declínio gradativo da motilidade foi verificado no uso do diluente Tris a partir das 18h de conservação (P<0,05). No uso do Leite UHT, observou-se redução significativa da motilidade já a partir das 12h de conservação (P<0,05). Este declínio provavelmente deve-se ao consumo do substrato energético e à produção de catabólitos oriundos do metabolismo espermático (CARDOSO, 2006). A motilidade é a manifestação da competência estrutural e funcional da célula Ciência Animal, 17(1):37-44,

4 Tabela 1. Motilidade espermática progressiva (%) no sêmen canino fresco e diluído em Tris ou leite UHT, após conservação em caixas térmicas de isopor de 3L por até 36h. Tris Leite UHT Sêmen fresco 98,5 ± 5,1 A Sêmen diluído 97,9 ± 2,5 aa 96,4 ± 2,0 aa 12h 94,4 ± 1,8 aa 79,4 ± 17,2 bb 18h 85,6 ± 7,8 ab 67,5 ± 20,4 bc 24h 80,6 ± 5,0 ac 60,6 ± 15,0 ad 30h 72,5 ± 10,7 ad 47,5 ± 14,6 be 36h 61,9 ± 15,1 ad 26,3 ± 23,7 bf espermática (PEÑA-MARTINEZ, 2004). Segundo CONCANNON & BATTISTA (1989), o valor ideal mínimo para a realização de inseminações artificiais é de 50% de espermatozóides com motilidade progressiva. Desse modo, no uso do leite UHT, a motilidade (60,6 ± 15,0%) foi conservada de maneira aceitável até as 24 h. No uso do diluente Tris, os valores de motilidade (61,9 ± 15,1%) mantiveram-se dentro da faixa aceitável até 36 h. Segundo OETTLÉ (1993), a fertilidade em cães só seria afetada caso amostras de sêmen com menos de 60% de espermatozóides normais fossem utilizadas em inseminações artificiais. No experimento aqui tratado, observou-se que o procedimento de conservação adotado foi eficiente em preservar a morfologia espermática, visto que em ambos os diluentes as alterações nunca foram superiores a 30% (Tab. 2). As principais alterações morfológicas espermáticas observadas foram secundárias, provavelmente originadas do choque térmico e dos procedimentos de manipulação do sêmen (SEAGER, 1986). Porém, é importante enfatizar que a avaliação da morfologia espermática através da microscopia de luz é limitada, e não permite a visualização de danos na ultra-estrutura espermática, sendo sugestivo o emprego de outras técnicas como a microscopia eletrônica (CHIRINÉA et al., 2006). Espermatozóides que apresentem uma motilidade de boa qualidade podem ser incapazes de fertilizar um oócito caso apresentem danos acrossomais (STRÖM-HOLST et al., 1997). Neste trabalho, foi verificado que ambos os Tabela 2. Morfologia espermática (%) no sêmen canino fresco e diluído em Tris ou leite UHT, após conservação em caixas térmicas de isopor de 3L por até 36h Alterações Avaliações Diluentes Normais Primárias Secundárias Totais Sêmen fresco 78,8 ± 13,4 1,5 ± 1,1 19,7 ± 13,7 21,2 ± 13,4 12h Tris 70,3 ± 9,9 1,0 ± 1,1 28,7 ± 10,4 29,7 ± 9,9 Leite UHT 75,0 ± 12,4 1,5 ± 2,1 23,5 ± 13,5 25,0 ± 12,4 18h Tris 71,2 ± 14,2 0,8 ± 1,0 28,0 ± 13,9 28,8 ± 14,2 Leite UHT 72,8 ± 10,0 2,0 ± 1,9 25,5 ± 11,1 27,4 ± 10,4 24h Tris 69,1 ± 8,1 2,9 ± 1,8 28,0 ± 8,8 30,9 ± 8,1 Leite UHT 76,0 ± 11,1 0,9 ± 2,1 22,7 ± 10,7 23,7 ± 11,0 30h Tris 74,7 ± 11,9 1,3 ± 1,1 24,0 ± 11,9 25,3 ± 11,9 Leite UHT 78,3 ± 7,4 1,6 ± 2,0 20,1 ± 8,2 21,7 ± 7,4 36h Tris 71,1 ± 10,8 1,8 ± 1,9 27,0 ± 11,4 28,9 ± 10,8 Leite UHT 76,5 ± 7,4 1,9 ± 1,7 21,7 ± 8,3 23,5 ± 7,4 Não foram evidenciadas diferenças entre grupos ou entre avaliações - P > 0, Ciência Animal, 17(1):37-44,2007

5 diluentes foram eficazes em conservar a integridade acrossomal no decorrer de todos os tempos de avaliação (Fig. 1). A Fig. 2 mostra que os diluentes testados foram similares na conservação da resposta osmótica das células espermáticas no decorrer das avaliações (P>0,05). Por outro lado, a função das membranas espermáticas no uso dos dois diluentes foi afetada pelo tempo de conservação (P<0,05). A habilidade dos espermatozóides em dobrar ou enrolar a região da cauda quando submetido a um estresse hipo-osmótico, implica na integridade funcional das membranas espermáticas. Segundo INAMASSU et al. (1999), a resposta osmótica das células espermáticas é indicativa da integridade e da função das membranas espermáticas, porém a motilidade espermática depende não somente do transporte de substâncias que atravessam as membranas, mas também de um grande número de outras funções bioquímicas, como o metabolismo e a ação microtubular das fibras da região da cauda dos espermatozóides. A mensuração da temperatura interna das caixas de isopor evidenciou um aumento gradativo da mesma, tendo sido observados os seguintes valores: 3,5 ± 1,8ºC imediatamente após o fechamento das caixas, 8,1 ± 1,5ºC às 12h, 8,8 ± 1,1ºC às 18h, 12,1 ± 1,9ºC às 24h, 17,9 ± 3,4ºC às 30h, e 22,5 ± 3,0 às 36h. Estes achados comprovam que a caixa térmica de isopor de 3L não possibilita a manutenção de uma temperatura interna constante, o que poderia interferir negativamente com os resultados. Segundo demonstrado por NUNES et al. (2007), o uso de uma caixa térmica de maiores dimensões (25,0 x 17,1 x 20,4 cm), contendo uma maior quantidade de gelo biológico (2,5L), permite a manutenção adequada da temperatura (2,1ºC) por um período de até 24 h, conferindo uma maior segurança à preservação da qualidade espermática. A elevação da temperatura dentro da caixa térmica poderia contribuir para a alteração do ph do meio, podendo ser deletério à célula espermática. Porém, o delineamento experimental do presente trabalho não previu a avaliação do ph e da osmolaridade dos meios no decorrer da conservação. Em todo caso, TSUTSUI et al. (2003) mostraram que em dois dias, o ph e a osmolaridade do sêmen canino diluído em Tris em condições de refrigeração permanecem estáveis. Em adição, ROTA et al. (1995) demonstraram que o ph altera-se apenas a partir do segundo dia de conservação do sêmen canino sob refrigeração em ambos os diluentes Tris e leite, mas a osmolaridade no leite alterase significativamente já desde o primeiro dia. É possível que uma alteração na osmolaridade do leite possa ter contribuído de maneira negativa na conservação do sêmen canino após as 24 h neste estudo. Resultados similares foram demonstrados por CARDOSO et al. (2007) que conservaram o sêmen canino Integridade acrossomal (%) ,5 95 Fresco 12h 18h 24h 30h 36h T empos de avaliação T ris Leite UHT Figura 1. Integridade acrossomal (%) no sêmen canino diluído em Tris ou leite UHT, após conservação em caixas térmicas de isopor com gelo reciclável por até 36h (P > 0,05). Ciência Animal, 17(1):37-44,

6 100 Respostas osmótica (%) 97, , ,5 85 Fresco 12h 18h 24h 30h 36h T ris Leite UHT T empos de avaliação (Sem diferenças entre diluentes - P > 0,05; ABC Diferenças significativas entre tempos P < 0,05) Figura 2. Resposta osmótica (%) das células espermáticas no sêmen canino diluído em Tris ou Leite UHT, após conservação em caixas térmicas de isopor com gelo biológico por até 36h. diluído em leite-gema mantido sob refrigeração a 5ºC por apenas 24h. Do mesmo modo, NUNES et al. (2007) verificaram que o sêmen de eqüinos pode ser também conservado por 24h em caixa térmica de isopor no uso deste mesmo diluente. MICHAJOLOV (1950) demonstrou que o leite aquecido poderia ser utilizado como diluente para sêmen, apresentando-se como um líquido orgânico com importante propriedade biológica para a conservação dos espermatozóides, visto que apresenta capacidade tampão e abundância de carboidratos, que seriam utilizados pelos espermatozóides na produção de energia. Acredita-se que a principal substância do leite responsável pela preservação da célula espermática seja a caseína, associada a um efeito benéfico da lactose (BERGERON & MANJUNATH, 2006). O uso do leite UHT desnatado simplifica o processo de diluição do sêmen do cão, pois além de sua ampla disponibilidade comercial, não requer o aquecimento prévio do leite, tendo sido demonstrada sua eficiência na conservação do sêmen de eqüinos (MEIRELLES et al., 1998), bovinos e ovinos (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Com relação à gema de ovo, esta tem sido incorporada em diferentes soluções para a conservação de sêmen por prevenir a ocorrência de dano celular decorrente de choque térmico. Seu princípio ativo foi demonstrado como uma lipoproteína de baixa densidade (LDL), a qual se especula que promova uma associação com a membrana plasmática da célula, provendo-lhe proteção e estabilidade (BERGERON & MANJUNATH, 2006). Resultados superiores ao leite foram obtidos com o diluente à base de Tris acrescido de gema de ovo, o qual foi eficiente na manutenção da viabilidade espermática por até 36h. De fato, estudos recentes utilizando equipamentos que mantêm a estabilidade térmica por vários dias têm demonstrado que esse diluente pode conservar a viabilidade do sêmen canino por oito dias (PONGLOWHAPAN et al., 2004), ou mesmo por até três semanas (VERSTEGEN et al., 2005; HERMANSSON & LINDE-FORSBERG, 2006). A partir destes resultados, conclui-se que o sêmen canino pode ser eficientemente acondicionado para transporte em caixas de isopor de 3L por até 24 h utilizando-se o diluente leite UHT ou por até 36 h no uso do diluente Tris, ambos acrescidos de gema de ovo. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Prof. Dr. Benito Soto Blanco, por ter cedido as instalações do Laboratório Clínico do Hospital Veterinário da UFERSA para a realização do experimento. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BERGERON, A.; MANJUNATH, P. New insights towards understanding the mechanisms of sperm protection by egg yolk and milk. Molecular 42 Ciência Animal, 17(1):37-44,2007

7 Reproduction and Develoment, v. 73, p , CARDOSO, J.F.S. Uso do diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106 ) para o resfriamento a 4ºC do sêmen canino. 68f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CARDOSO, P.B.S.; CRUSCO, S.E.; RODRIGUES, M.P.; NICHI, M.; GOES, P.A.A.; BARNABE, V.H. Avaliação da viabilidade espermática in vitro do sêmen canino no diluidor gema de ovo-leite desnatado refrigerado a 5ºC por 48 horas. In: XVII Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 2007, Curitiba. Anais... Curitiba, 2007, Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, p.170. CHIRINÉA, V.H.; MARTINS, M.I.M.; SOUZA, F.F.; TEBET, J.M,; PAPA, F.O.; LOPES, M.D. Características morfofuncionais do sêmen canino refrigerado e congelado, usando dois diferentes meios diluentes. Ciência Animal Brasileira, v.7, p , CONCANNON, P.W., BATTISTA, M. Canine semen freezing and artificial insemination. In: KIRK R.W. (Ed), Current veterinary therapy, Philadelphia: WB Saunders, p ENGLAND, G. C. W.; PONZIO, P. Comparison of the quality of frozen-thawed and cooled-rewarmed dog semen. Theriogenology, v.46, p , GILL, H.P.; KAUFMAN, C.F.; FOOTE, R.H.; KIRK, R.W. Artificial insemination of Beagle bitches with freshly collected, liquid stored and frozen-stored semen. American Journal of Veterinary Research, v.31, p , HAFEZ, E. S. E., HAFEZ, B. Reprodução Animal. 7ª ed. São Paulo: Manole, p. HARROP, A.E. Artificial insemination in dogs the first transatlantic conception. British Veterinary Journal, v.112, p , HERMANSSON, U.; LINDE-FORSBERG, C. Freezing of stored, chilled dog spermatozoa. Theriogenology, v.65, p , INAMASSU, A.; UECHI, E.; LOPES, M.D. Viabilização do teste hipo-osmótico em cães e sua relação com outras variáveis espermáticas. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.23, p , JOHNSTON, S. D.; KUSTRITZ, M. V. R.; OLSON, P. N. S. Canine and feline theriogenology. Philadelphia: W.B.Saunders, p. LINDE-FORSBERG, C. Regulations and recommendations for international shipment of chilled and frozen canine semen. In: CONCANNON, P.W., ENGLAND, G., VERSTEGEN, J., LINDE- FORSBERG, C. Recent advances in Small Animal Reproduction. New York: International Veterinary Information Service, DOI: A MICHAJOLOV, N.N. Milk as a semen diluent. Journal of American Veterinary Medical Association, v.117, p. 337, MEIRELLES, L.S.; MALSCHITSKY, E.; NEVES, A.P.; VIEIRA, M.J.; KELLER, A.; HOTT, A.K.; MORAIS, I.M.A.; GARBADE, P.; GREGORY, R.M.; MATTOS, R.M. Leite em pó desnatado não inativado e leite desnatado UHT para a preservação e fertilidade do sêmen eqüino resfriado. Ciência Rural, v.28, p , NUNES, D.B., ZORZATTO, J.R., COSTA E SILVA, E.V., ZÚCCARI, C.E. Efficiency of short-term storage of equine semen in a simple-design cooling system. Animal Reproduction Science, v.104, p , OETTLÉ, E.E. Sperm morphology and fertility in the dog. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47, p , PEÑA-MARTINEZ, I. Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Animal Reproduction Science, v.82-83, p , PONGLOWHAPAN, S.; ESSÉN-GUSTAVSSON, B.; LINDE-FORSBERG, C. Influence of glucose and frutose in the extender during long-term storage of chilled canine semen. Theriogenology, v.62, p , QUINTELA, A.T.; GUSMÃO, A.L.; LOPES, M.D.; SILVA, J.C.; ALVARENGA, M.A., RESENDE, J.; MENEZES, M.; PORTELA, A.P.; ALMEIDA, A.K. Hyposmotic test with distillated water to evaluate sperm plasma membrane integrity of dog semen preliminary data. In: 15 th International Congress of Animal Reproduction, Porto Seguro. Anais Porto Seguro, Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, p.518. ROMAGNOLI, S. Canine artificial insemination with fresh, refrigerated and frozen semen. In: Veterinary Sciences Congress, 2002, Oeiras. Anais Oeiras, 2002, Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias, p ROTA, A., STROM, B., LINDE-FORSBERG, C. Effects of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 4ºC. Theriogenology, v.44, p , SEAGER, S.W.J. Artificial insemination in dogs. In: BURKE, T.J. (Ed). Small Animal Reproduction and Infertility: A Clinical Approach to Diagnosis and Treatment. Philadelphia: Lea & Febiger, 1986, p. Ciência Animal, 17(1):37-44,

8 SHAHIDUZZAMAN, A.K.; LINDE-FORSBERG, C. Induced immotility during long term storage at +5ºC degrees C does not prolong survival of dog spermatozoa. Theriogenology, v. 68, p , SILVA, A. R.; CARDOSO, R.C.S.; UCHOA, D.C.; SILVA, L.D.M. Effect of Tris-buffer, egg yolk and glycerol on canine semen freezing. The Veterinary Journal, v.164, p , SILVA, A. R.; SATZINGER, S.; LEITE, L. G.; SILVA L. D. M. Gestação obtida por inseminação artificial com sêmen canino refrigerado transportado à distância relato de caso. Clínica Veterinária, n. 50, p , STRÖM, B.; ROTA, A.; LINDE-FORSBERG, C. In vitro characteristics of canine spermatozoa subjected to two methods of cryopreservation. Theriogenology. v. 48, p , STRÖM-HOLST, B., LARSSON, B., LINDE- FORSBERG, C., RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. Evaluation of chilled and frozen-thawed canine spermatozoa using a zona pellucida binding assay. Journal of Reproduction and Fertility, v.119, p , TSUTSUI, T.; TEZUKA, T.; MIKASA, Y.; SUGISAWA, H.; KIRIHARA, N.; HORI, T.; KAWAKAMI, E. Artificial insemination with canine semen stored at a low temperature. Journal of Veterinary Medical Science, v.65, p , UCHOA, D.C.; SATZINGER, S.; AMARAL, M.C.; SILVA, L.D.M. O uso de diferentes diluidotes para inseminação artificial com sêmen canino refrigerado. In: XVII Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 2007, Curitiba. Anais... Curitiba, 2007, Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, p.182. VERSTEGEN, J.P.; ONCLIN, K.; IGUER- OUADA, M. Long-term motility and fertility conservation of chilled canine semen using egg-yolk added Tris-glucose extender: in vitro and in vivo studies. Theriogenology, v.64, p , Recebido em: Aceito em: Ciência Animal, 17(1):37-44,2007