VIABILIDADE DE ESPERMATOZÓIDES DE CÃES INCUBADOS A 37ºC POR UMA HORA, APÓS DILUIÇÃO EM TRIS-GEMA ACRESCIDO DE GLICEROL

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1 Ciência Animal,19(1):29-36,2009 VIABILIDADE DE ESPERMATOZÓIDES DE CÃES INCUBADOS A 37ºC POR UMA HORA, APÓS DILUIÇÃO EM TRIS-GEMA ACRESCIDO DE GLICEROL (Viability of dog sperm incubated at 37 C for 1 hour after dilution in Tris-Yolk egg plus glycerol) Cristiane Scavuzzi MOURA 1*, Zoraide Fernandes COLETO 1, Paulo César Vasco de Albuquerque PEIXOTO 1, Cibele Cavalcanti Souza de MELO 1, Alexandre Rodrigues SILVA 2 & Maria Madalena Pessoa GUERRA 1 1 Departamento de Medicina Veterinária/Universidade Federal Rural de Pernambuco; 2 Universidade Federal Rural do Semi-Árido RESUMO Objetivando-se avaliar a viabilidade de espermatozóides de cães, incubados a 37 o C por uma hora, após diluição em Tris-gema, acrescida de 6% de glicerol, visando sua utilização do método automatizado de congelação, foram utilizados cães adultos das raças Basset Hound (n=3) e Rottweiler (n=3), submetidos a quatro colheitas de sêmen, através de manipulação peniana. Após a colheita, as amostras de sêmen foram divididas em duas alíquotas, constituindo os grupos experimentais: G1 (sem adição do diluidor) e G2 (diluído em Tris-gema acrescido de 6% de glicerol). As amostras foram avaliadas a 0, 30 e 60 minutos de incubação (37 o C), quanto à motilidade progressiva (MP), vigor e integridade do acrossoma. Durante a incubação não foram observadas diferenças significativas (P>0,05) na MP e no vigor entre as amostras de sêmen dos Grupos G1 e G2. Todavia, as amostras sem diluição (G1) apresentaram maiores porcentuais (P<0,05) de acrossomas íntegros do que as amostras diluídas (G2). Constatou-se que os porcentuais de MP nos tempos 0 e 30 minutos foram maiores (P<0,05) nas amostras de sêmen dos cães Rottweiler do que nas do Basset Hound, nos dois grupos (G1 e G2). Conclui-se que, ao utilizar o método automatizado de congelação, as amostras de sêmen de cães devem ser incubadas, submetidas a análise e diluídas no momento do envase, antes da transferência para a máquina de congelação. PALAVRAS-CHAVE: teste de termo-resistência, danos espermáticos, integridade acrossomal. ABSTRACT Aiming to evaluate the viability of dog sperm incubated at 37 o C during 1 hour, after dilution in Trisyolk egg plus glycerol (6%), with the objective to use on freezing machine, it were used adult dogs of Basset Hound (n=3) and Rottweiler (n=3) races, which were submitted to four semen collection through digital manipulation. Immediately after collect, the semen samples were divided in two aliquots according to the experimental groups: G1 (no extensor) and G2 (extended in Tris-Yolk egg plus 6% glycerol). The samples were evaluated at 0, 30 and 60 minutes of incubation (37 o C) according to progressive motility (PM), vigor and acrosome integrity. During the incubation period there was no significant difference (P>0.05) on the PM and vigor between G1 and G2 groups. However, semen samples without dilution (G1) had higher percentage (P<0.05) of intact acrosome than diluted *Endereço para correspondência Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife-PE csmoura2000@yahoo.com.br Ciência Animal 19(1):29-36,

2 samples (G2). It was observed that the percentage of PM at 0 and 30 minutes were higher (P<0.05) in samples of Rottweiler than Basset Hound dogs, on the two groups (G1 and G2). So, it can be concluded that, using the freezing machine, the dog semen samples should be incubated, submitted to analyses and diluted at the time of fill the straws before transfering to the freezing machine. KEY WORDS: Term-resistance test (TRT), sperm damage, acrossomal integrity. INTRODUÇÃO Na tentativa de reduzir as oscilações de temperatura durante o processo de criopreservação e obter maior viabilidade espermática após a descongelação do sêmen, tem sido utilizado o sistema automatizado de congelação (Coleto, 2006), o qual não permite a adição fracionada do crioprotetor à temperatura de 4ºC (Moura et al., 2002). Assim, após a retirada de alíquotas de sêmen para realização de análises espermáticas, as amostras são diluídas em meio acrescido de crioprotetor, e incubadas a 37 o C, durante o tempo de realização das análises, para, então, serem envasadas em palhetas e transferidas para a máquina, a fim de iniciar o processo de refrigeração e congelação (Peixoto, 2008). A diluição do sêmen é essencial para o sucesso da criopreservação, em virtude de fornecer condições para a sobrevivência dos espermatozóides, preservando a integridade da membrana plasmática (Polge et al., 1949). Apesar dos crioprotetores reduzirem as injúrias causadas pela congelação, essas substâncias podem ser tóxicas às células espermáticas (Rota et al., 1998). Vidament et al. (2000) conseguiram minimizar os efeitos tóxicos da adição de glicerol, ao reduzirem o tempo de exposição dos espermatozóides a esse crioprotetor, antes da congelação ou durante a refrigeração. As análises in vitro dos espermatozóides possibilitam determinar suas características biológicas e estruturais, sendo de especial interesse para a pesquisa fundamental e para o aprimoramento de técnicas de conservação de sêmen (Rota et al., 1997). O teste de termorresistência possibilita a verificação in vitro da longevidade espermática, através de repetidas observações de motilidade, em tempos variados, durante incubação em temperaturas similares à uterina (Cardoso et al., 2005) sendo considerado um bom método de avaliação da capacidade fertilizante dos espermatozóides (Peña et al., 1998). Ström et al. (1997) relataram que os espermatozóides de cães apresentam termoresistência pós-descongelação mais baixa do que os de outras espécies. Todavia, Moura et al. (2002) obtiveram ótima viabilidade espermática, após utilizarem o teste de termorresistência no sêmen de cães, possibilitando o seu uso na criopreservação ou inseminação artificial (IA), após 60 minutos de incubação. Apesar da motilidade e do vigor espermático serem os parâmetros rotineiramente utilizados para análise da qualidade espermática, essas técnicas são subjetivas e de baixa repetibilidade (Johnston et al., 2001). Dessa forma, objetivando utilizar métodos mais específicos e rápidos na avaliação de estruturas espermáticas fundamentais ao processo de fecundação, Sirivaidyapong et al. (2000) avaliaram a influência dos diluidores e da temperatura de adição do diluidor sobre a ocorrência de danos ao acrossoma de espermatozóides congelados de cães. Por conseguinte, visando determinar o melhor momento da adição do diluente em amostras de sêmen de cães a serem utilizadas no método automatizado, objetivou-se com este trabalho avaliar a viabilidade dos espermatozóides de cães, incubados a 37 o C por uma hora, após 30 Ciência Animal 19(1):29-36,2009

3 diluição em Tris-gema acrescido de 6% de glicerol. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados cães adultos de 24 a 48 meses, das raças Basset Hound (n=3) e Rottweiler (n=3), vacinados e vermifugados, alimentados com ração super Premium, duas vezes ao dia, além de água ad libitum, pertencentes a um criador particular, localizado no Município de Camaragibe, Pernambuco. Os animais foram submetidos a quatro colheitas de sêmen, a intervalos de três dias, através de manipulação peniana. Antes do processamento do sêmen, os animais foram submetidos a exame andrológico, constituído de avaliação clínica geral e do sistema reprodutor masculino, sendo utilizados apenas aqueles considerados aptos à reprodução. Imediatamente após a colheita, o sêmen foi mantido em banho-maria, à temperatura de 37ºC, durante o processo de avaliação macro e microscópica (Johnston et al., 2001). Os ejaculados foram avaliados quanto aos parâmetros macroscópicos de volume, cor e aspecto e microscópicos, motilidade progressiva, vigor, concentração e morfologia espermática. Para análise da motilidade progressiva (MP) e do vigor espermático, 10 ìl de cada ejaculado foi depositado sobre lâmina, previamente aquecida a 37ºC e conduzida a um microscópio ótico, sendo submetidas à congelação as amostras que apresentaram MP e 70% e vigor e 3. A concentração espermática foi avaliada através da câmara de Neubauer e os resultados expressos em milhões de espermatozóides/ml, enquanto a análise morfológica das células espermáticas foi avaliada através de câmara úmida, sendo considerados os porcentuais de células espermáticas normais, encontrados nas amostras de sêmen (Mies Filho, 1987). A análise de integridade do acrossoma foi realizada, através da preparação de esfregaços, os quais foram armazenados a 4 o C, protegidos da luz. Após uma semana, as lâminas foram analisadas pela técnica de FITC-conjugada ao Peanut aglutinina (FITC-PNA) (Roth et al., 1998). No momento da análise, as lâminas foram coradas com 30 ìl de solução de PNA [20 ì L de PNA (Sigma, Saint Louis, MO, USA) ìl de PBS]. Em seguida, as lâminas foram refrigeradas (4ºC) durante 20 minutos, imersas em 50 ml de PBS e colocadas dentro de caixa isotérmica para secagem em temperatura ambiente. Após secagem, alíquotas de 5 µl da solução UCD [5 mg de Azida sódica; 0,5 ml de PBS, 0,1 % w/v de Fenilenediamina (Sigma, Saint Louis, MO, USA), 4,5 ml de Glicerol; ph 8,0] foram colocadas entre lâmina e lamínula e observadas em microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão), utilizando o filtro de fluoresceína ( nm, espelho dicromático de 510 nm), onde foram contados 200 espermatozóides/lâmina e classificados em: a) acrossomas intactos (AI), quando a região acrossomal apresentava fluorescência verde; b) acrossomas reagidos (AR), quando apresentavam fluorescência verde na região equatorial da cabeça espermática ou não apresentavam fluorescência verde na cabeça. As amostras de sêmen in natura foram divididas em duas alíquotas, constituindo os grupos experimentais: G1 = sem adição de diluidor; e G2 = diluídas em Tris-gema (1:1) (80% de Tris e 20% de gema de ovo) acrescidos de 6% de glicerol. As amostras foram mantidas a 37ºC e avaliadas após 0, 30 e 60 minutos de incubação quanto a MP, vigor e integridade acrossomal. Os dados foram expressos na forma de média e desvio padrão. Os resultados de motilidade espermática e integridade acrossomal foram submetidos à transformação angular em Arcoseno. Comparações entre os tratamentos foram realizadas através da Análise de Variância Ciência Animal 19(1):29-36,

4 Tabela 1. Características do sêmen in natura de cães das raças Basset Hound e Rottweiler Parâmetros seminais Basset Hound Rottweiler Total Volume (ml) 4,83 ± 1,14 A 3,17 ± 1,49 B 4,00 ± 1,55 Motilidade Progressiva (%) 92,92 ± 4,50 96,25 ± 3,11 94,58 ± 4,15 Vigor (0-5) 4,92 ± 0,29 4,29 ± 0,29 4,92 ± 0,28 Espermatozóides normais (%) 90,42 ± 4,56 A 86,17 ± 3,46 B 88,29 ± 4,52 Acrossomas íntegros (%) 96,75 ± 2,22 98,08 ± 0,79 97,42 ± 1,77 Concentração (X 10 6 /ml) 326,67 ± 61,02 329,58 ± 42,97 328,13 ± 51,64 Letras maiúsculas distintas, na mesma linha, indicam diferença significativa (P<0,05) entre raças. (ANOVA), seguida do teste de Tukey, exceto para o vigor, sendo utilizado o teste de Mann-Whitney para determinação deste parâmetro. Diferenças entre os cães utilizados no experimento foram avaliadas pelo teste de Kruskall Wallis. Para analisar o efeito da raça sobre a motilidade e integridade acrossomal, utilizou-se ANOVA seguido do teste de Tukey. Todos os testes foram realizados a P<0,05, utilizando-se o programa Statview 5.0 (SAS Institute Inc., 1998). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os ejaculados dos cães apresentaram aspecto normal, coloração branca e aparência leitosa. As análises de volume, motilidade progressiva, vigor, morfologia espermática, integridade de acrossomas e concentração espermática encontram-se na Tab. 1, sendo considerados normais para a espécie canina (Johnston et al., 2001). No entanto, ao comparar os valores obtidos nas duas raças estudadas, observou-se diferença significativa (P<0,05) no volume da fração espermática e no porcentual de células morfologicamente normais, demonstrando maiores valores nas amostras de sêmen dos cães da raça Basset Hound, em comparação à raça Rottweiler. Tabela 2. Motilidade Progressiva (MP), vigor e integridade do acrossoma de espermatozóides de cães, sem diluição (G1) ou diluídos em Tris-gema acrescido de 6% de glicerol (G2), após 0, 30 e 60 minutos de incubação (37 o C). Parâmetro espermático Motilidade Progressiva (%) Grupo Experimental TTR (min) G1 94,58 ± 4,15 A 92,50 ± 3,30 B 80,42 ± 18,99 C G2 94,58 ± 4,15 A 92,71 ± 3,90 B 88,54 ± 11,56 C vigor (0-5) G1 4,92 ± 0,28 A 4,79 ± 0,41 A 4,08 ± 0,93 B G2 4,92 ± 0,28 A 4,79 ± 0,41 A 4,25 ± 0,53 B acrossomas íntegros (%) G1 97,42 ± 1,77 Aa 96,46 ± 1,77 Ba 95,42 ± 2,41 Ca G2 90,08 ± 4,17 Ab 83,17 ± 5,44 Bb 76,88 ± 5,91 Cb Letras maiúsculas distintas, na mesma linha, indicam diferença significativa (P<0,05) entre tempos de incubação (0, 30 e 60 minutos) em cada grupo experimental (G1 e G2); Letras minúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa (P<0,05) entre grupos experimentais (G1 ou G2), em cada tempo de incubação (0, 30 e 60 minutos). 32 Ciência Animal 19(1):29-36,2009

5 Tabela 3. Motilidade Progressiva, vigor e integridade do acrossoma de espermatozóides de cães das raças Basset Hound (n=3) e Rottweiler (n=3), sem diluição (G1) ou diluídos em Tris-gema acrescido de 6% de glicerol (G2), após 0, 30 e 60 minutos de incubação (37 o C). Parâmetro espermático Motilidade progressiva (%) Raça TTR (min) Grupo BH G1 92,92 ± 4,50 b 90,83 ± 3,59 b 76,25 ± 16,11 G2 92,92 ± 4,50 b 90,83 ± 4,69 b 87,50 ± 5,44 Rottweiler G1 96,25 ± 3,11 a 94,17 ± 1,95 a 84,50 ± 21,37 G2 96,25 ± 3,11 a 94,58 ± 1,44 a 87,50 ± 15,73 vigor (0-5) BH G1 4,92 ± 0,29 4,75 ± 0,45 3,92 ± 0,67 G2 4,92 ± 0,29 4,75 ± 0,45 4,08 ± 0,51 Rottweiler G1 4,92 ± 0,29 4,83 ± 0,39 4,25 ± 1,14 G2 4,92 ± 0,29 4,83 ± 0,39 4,42 ± 0,51 acrossomas íntegros (%) BH G1 96,75 ± 2,22 A 95,92 ± 2,31 A 95,50 ± 3,21 A G2 88,17 ± 4,82 B 82,42 ± 6,39 B 76,75 ± 6,57 B Rottweiler G1 98,08 ± 0,79 A 97,00 ± 0,75 A 95,33 ± 1,37 A G2 92,00 ± 2,26 B 83,92 ± 4,46 B 77,00 ± 5,46 B BH= Basset Hound; Letras minúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa (P<0,05) entre raças no mesmo grupo experimental (G1 e G2) em cada tempo de incubação (0, 30 e 60 minutos); Letras maiúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa (P<0,05) grupo experimental (G1 e G2) na mesma raça em cada tempo de incubação (0, 30 e 60 minutos). Os parâmetros de MP e vigor do sêmen de cães durante o teste de termorresistência (Tab. 2) não demonstraram diferença significativa (P>0,05) entre as amostras dos Grupos G1 e G2. Entretanto, as amostras submetidas à diluição em meio acrescido de glicerol (G2) reduziu (P<0,05) o porcentual de espermatozóides com acrossomas íntegros, em relação às amostras não diluídas (G1), após 0, 30 e 60 minutos de incubação. Observou-se que a manutenção do sêmen a 37ºC reduz gradativamente todos os parâmetros avaliados, MP, vigor e integridade acrossomal, independente do grupo experimental. Apesar dos porcentuais de espermatozóides com acrossomas íntegros após o período de incubação ser considerado ótimo, estas amostras ainda serão submetidas à congelação, o que determina danos à membrana celular (Polge et al., 1949). Por conseguinte, a análise de integridade do acrossoma evidencia em ambos os grupos (G1 e G2), durante todo o período de incubação, a importância da agilidade no processamento do Ciência Animal 19(1):29-36,2009 sêmen antes da criopreservação, visando preservar a integridade desta estrutura espermática e, consequentemente, obter melhor taxa de fertilização dos ovócitos. Ao avaliar o efeito da adição do diluente acrescido de glicerol, de acordo com a raça, o grupo experimental e o tempo de incubação (Tab. 3), observou-se diferença significativa (P<0,05) no porcentual de células com MP entre as raças Basset Hound e Rottweiler no mesmo grupo experimental, após 0 e 30 minutos de incubação com valores superiores para as amostras de sêmen dos cães Rottweiler, em relação às amostras dos Basset Hound. Além disso, apesar de não terem sido mostrados os resultados individuais dos cães, foram observadas diferenças significativas (P<0,05) entre cães, durante o período de incubação, o que pode ser comprovado pelo elevado desvio padrão das médias aos 60 minutos de incubação. No entanto, nas análises de vigor espermático, não foram evidenciadas diferenças significativas (P>0,05) entre raças, grupos e 33

6 tempo de incubação. A análise da integridade do acrossoma constatou diferenças significativas (P<0,05) entre os grupos experimentais em todos os tempos analisados, não evidenciando diferença (P>0,05) entre raças neste parâmetro. As células espermáticas dos cães das raças Basset Hound e Rottweiler de todos os grupos (com ou sem diluição) apresentaram, ao término do período de incubação, valores mínimos de MP, vigor e integridade acrossomal (MP >76,25%, vigor >3,92 e integridade acrossomal >76,75%, respectivamente), considerados excelentes para utilização na IA ou criopreservação (Johnston et al., 2001). No entanto, vale ressaltar que, após 60 minutos de incubação, as amostras de sêmen do Grupo G2 dos cães das raças Basset Hound e Rottweiler apresentaram valores de 76,75 e 77,00% de espermatozóides com acrossomas íntegros, respectivamente. Estes valores, apesar de serem compatíveis para uso na congelação ou IA, demonstram redução de 11,42 e 15,00% no percentual de células com acrossomas íntegros durante o teste de TTR, respectivamente, demonstrando que a presença do diluidor contendo glicerol (6%) induziu mais danos ao acrossoma. Assim, considerando que o TTR é um bom indicador da avaliação da fertilidade espermática (Peña et al., 1998; Cardoso et al., 2005), apesar de não haver sido realizada IA, estes resultados podem indicar menor capacidade fecundante das células espermáticas submetidas à diluição (G2). Os resultados desse experimento são similares aos relatos de Berndston & Foote (1969) e Vidament et al. (2000), ao demonstrarem que quanto menor o tempo de exposição ao glicerol, menor também serão os efeitos tóxicos desencadeados por esse agente no interior da célula espermática. O meio utilizado para diluir o sêmen, bem como a temperatura de adição do diluidor tem influência sobre a ocorrência de danos espermáticos (Sirivaidyapong et al. (2000). Esses autores comprovaram que as amostras de sêmen mantidas a 37 ºC e diluídas (1:1) em Trisgema de ovo apresentam maior percentual de células com acrossomas íntegros, do que aquelas diluídas após incubação a 20 o C. Uma vez que neste experimento não foi realizada a congelação do sêmen, estes resultados não podem ser comparados com aqueles obtidos por Coleto (2006) e Peixoto (2008), utilizando o método automatizado de congelação. Entretanto, vale ressaltar que Peixoto (2008) obteve grande redução no percentual de células com acrossomas íntegros, após congelação (média de 50,00%), quando comparado às amostras de sêmen in natura (média de 90,00%). Assim, considerando que quase 50% das células espermáticas perderam o acrossoma durante o processamento e a congelação do sêmen e que esse autor diluiu as amostras de sêmen em meio acrescido de crioprotetor, antes da incubação (37 o C) e análise, evidencia-se a importância de se promover a congelação de amostras de sêmen que possuam grandes porcentuais de células com acrossomas íntegros. No entanto, poucos trabalhos relatam o tempo ideal para processamento das amostras de sêmen de cães após diluição, bem como a ação dessas substâncias sobre a célula espermática. Assim, com base nos resultados desse experimento, onde foi observado aumento no percentual de células com acrossomas danificados nas amostras do G2, podendo-se supor que diluidores à base de gema de ovo acrescido de glicerol (6 %) desencadeiam a hiperativação e a reação do acrossoma, determinando a criocapacitação espermática (Vidament et al., 2000). De acordo com os percentuais de espermatozóides com acrossomas danificados após diluição e incubação a 37 o C, recomenda-se 34 Ciência Animal 19(1):29-36,2009

7 que, quando submetidas ao método automatizado de congelação, as amostras de sêmen de cães devem ser incubadas, submetidas à análise e somente diluídas no momento do envase, antes da transferência para a máquina de congelação, visando minimizar danos celulares pré-congelação e preservar a viabilidade pós-congelação. AGRADECIMENTOS Os autores deste trabalho agradecem a Tatiana Pagliane e sua equipe, por cederem os animais do canil Brave Basset Kennel para a realização desse experimento; ao Prof. Dr. Lêucio Câmara Alves, por ceder o microscópio de fluorescência para a análise de integridade do acrossoma e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de estudo durante a realização do curso de Doutorado. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BERNDSTON, W.E.; FOOTE, R.H. The survival of frozen bovine spermatozoa following minimum exposure to glycerol. Cryobiology, v. 5, p , CARDOSO, R.C.S.; SILVA, A.R.; SILVA, L.D. Comparison of two diluition rates on canine semen quality after cryopreservation in a coconut water extender. Animal Reproduction Science, v. 92, p , COLETO, Z.F. Congelamento do sêmen da espécie canina adicionado de antioxidantes f. (Tese de Doutorado) Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife. JOHNSTON, S.D.; KUSTRITZ, M.V.R.; OLSON, P.N.S. Canine and feline theriogenology. Philadelphia: W.B. Saunders, p. MIES FILHO, A. Reprodução dos animais e inseminação artificial 6ª ed. Porto Alegre: Sulina, p. MOURA, C.S.; CAVALCANTI, M.C.O; GUERRA, M.M.P. et al. Teste de avaliação in vitro e criopreservação do sêmen de cão utilizando diferentes diluidores. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v. 9, n. 2, p , PEIXOTO, P.C.V.A. Adição dos antioxidantes Trolox e glutationa reduzida ao diluidor de criopreservação de sêmen de cães, f. (Dissertação de Mestrado) Recife.Universidade Federal Rural de Pernambuco. PEÑA, A.I.; BARRIO, F.; QUINTELA, L.A.; HERRADON, P.G. Effect of different glycerol treatments on frozen-thawed dog sperm longevity and acrosomal integrity. Theriogenology, Stoneham,v. 50, p , POLGE, C.; SMITH, A.U.; PARKES, A.S. Revival of spermatozoa after vitrification at low temperatures. Nature, v. 164, p , ROTA, A.; STRÖM, B.; LINDE-FORSBERG, C. ; RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. Effects of Equex STM paste on viability of frozen-thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38ºC. Theriogenology, v. 47, p , ROTA, A.; LINDE-FORSBERG, C.; VANNOZZI, J. et al. Cryosurvival of dogs spermatozoa at different glycerol concentrations and freezing/ thawing rates. Reproduction in Domestic Animal, v. 33, p , ROTH, T.L.; WEISS, R.B.; BUFF, L.M.; WILT, D.E.; BUSH, M. Heterologous in vitro fertilization and sperm capacitation in an endangered African antelope, the Scimiltar-Horned Oryx (Oryx dammah). Biology of Reproduction, v. 58, p , SAS Institute Inc., 1998: Statview Version 5.0: Statview Reference. SAS Institute Inc., Cary, NC. SIRIVAIDYAPONG, S.; CHENG, F.P.; MARKS, A.; VOORHOUT, W.F.; BEVERS, M.M.; COLENBRANDER, B.. Effect of sperm diluents on the acrosome reaction in canine sperm. Theriogenology, v. 53, p , STRÖM, B.; ROTA, A.; LINDE-FORSBERG, C. In vitro characteristics of canine spermatozoa Ciência Animal 19(1):29-36,

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