CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN CAPRINO: EFEITO DA CURVA DE RESFRIAMENTO E DO TEMPO DE EQUILÍBRIO

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1 Ciência Animal, 17(2):75-82,2007 CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN CAPRINO: EFEITO DA CURVA DE RESFRIAMENTO E DO TEMPO DE EQUILÍBRIO (Cryopreservation of goat semen: the effect of freezing rate and equilibration time) Rodrigo Freitas BITTENCOURT 1*, Antônio de Lisboa RIBEIRO FILHO 2, Sidney Gonçalves Gonzalez ALVES 2, Carmo Emanuel BISCARDE 2, Marta Freitas VASCONCELOS 2 & Eunice OBA 1 1 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/UNESP, 2 Escola de Medicina Veterinária/UFBA RESUMO Dez amostras de sêmen de dois caprinos adultos, colhidas com a utilização de vagina artificial, foram submetidas a criopreservação com o objetivo de verificar a influência da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio à temperatura de 5 o C, sobre a congelabilidade do sêmen caprino. O sêmen colhido foi avaliado, diluído em meio à base de Tris-gema de ovo e envasado em palhetas de 0,25mL, com dose inseminante de 100 x 10 6 espermatozóides. As amostras de sêmen foram distribuídas nos diferentes protocolos de resfriamento e tempo de equilíbrio: curva de resfriamento lenta com 1h de tempo de equilíbrio (CL1); curva de resfriamento lenta com 2h de tempo de equilíbrio (CL2); curva de resfriamento rápido com 1h de tempo de equilíbrio (CR1) e curva de resfriamento rápida com 2h de tempo de equilíbrio (CR2). Os grupos CL1 e CL2 foram resfriados a uma taxa de 0,46 o C/min e os grupos CR1 e CR2 foram submetidos à curva mais rápida de resfriamento de 1,07 C/min, até atingirem a temperatura de 5 C. Posteriormente, as amostras foram mantidas a temperatura de 5 o C até completarem 1h de tempo de equilíbrio total (CL1 e CR1) ou 2h de tempo de equilíbrio (CL2 e CR2). Ao final foi efetuado o processo de congelação em vapor de nitrogênio líquido. A descongelação foi realizada em banho-maria a 37 o C por 30 segundos. Os percentuais obtidos para motilidade total (MT) e motilidade progressiva (MP) a descongelação foram para CL1 de 47,0 e 42,0; CL2: 51,5 e 46,5; CR1: 41,5 e 36,5; CR2: 52,5 e 47,5. Após o teste de termoresistência as médias de MT e MP para os grupos CL1, CL2, CR1 e CR2 foram, respectivamente, 40,5 e 36,6; 49,5 e 44,5; 38,5 e 34,0; 47,0 e 41,0. Neste estudo não foi demonstrado efeito do período de equilíbrio e da intensidade da curva resfriamento pré-congelação, sobre a viabilidade do sêmen caprino após o processo de congelação-descongelação. PALAVRAS-CHAVES: Caprinos; sêmen; congelação; tempo de equilíbrio; curva de resfriamento. ABSTRACT Ten semen samples from two adult goats were collected by an artificial vagina and cryopreserved with the objective of verifying the effect of the cooling rate and equilibration time on the freezability of goat semen. The collected semen was evaluated, diluted in Tris-egg yolk extender and packed in 0.25ml straws at a dose of 100 million motile spermatozoa. Then the semen samples were cooled at the different cooling protocols. The CL1 and CL2 groups were cooled at a rate of C/min and the CR1 and CR2 ones were cooled at C/min to 5 C. After that, the samples remained at 5 C *Endereço para correspondência: Faculdade de Veterinária e Zootecnia/UNESP CEP Botucatu São Paulo rfbvet@yahoo.com.br Ciência Animal, 17(2):75-82,

2 for one hour of equilibration time (CL1 and CR1) or two hours of equilibration time (CL2 and CR2). Freezing was done in liquid nitrogen vapor and thawing was at 37 o C in a water bath for 30s. This study did not find any effect of the cooling rate or equilibration period on the viability of the frozen goat semen. KEY WORDS: Goats; semen; freezing; equilibration time; cooling rate. INTRODUÇÃO Após o processo de criopreservação há uma queda na capacidade fertilizante dos espermatozóides provocada por fatores que reduzem a proporção de células sobreviventes (choque-térmico, susceptibilidade à curva de resfriamento, composição do diluidor e estresse osmótico) ou afetam o estado funcional dos mesmos (estabilidade da membrana plasmática, lesões oxidativas, integridade dos receptores da membrana, estrutura nuclear) (WATSON, 2000). Os problemas da criopreservação não estão relacionados com a manutenção dos espermatozóides a -196 o C já que, nessa temperatura não há reações bioquímicas. Assim, as alterações espermáticas são causadas durante o processo de resfriamento, congelação e descongelação (PARKS & GRAHAM, 1992). Uma grande parte das crioinjúrias observadas nas organelas celulares são consideradas como sendo provocadas por um dos maiores estresses do processo de criopreservação celular: a mudança da temperatura e suas conseqüências. Antes do processo de criopreservação, que envolve a saída e o retorno das células à temperatura corporal, o choque térmico causado pelo frio, deve ser incluído como um estresse potencial a ser considerado, com igual importância aos estágios que envolvem a queda da temperatura até o ponto de congelação (WATSON, 1995). Sabe-se que a maior parte das lesões espermáticas de acrossoma ocorre durante a diluição, resfriamento ou como resultado do período de equilíbrio a que o sêmen é submetido. Este conhecimento é importante para que se otimize o processamento inicial do sêmen, fazendo com que a grande maioria dos espermatozóides chegue ao processo de congelação-descongelação sem alterações de acrossoma (OETTLÉ, 1986). Taxas rápidas de resfriamento do espermatozóide da temperatura ambiente até 5 o C induzem a ocorrência de danos parcialmente irreversíveis, caracterizados por padrão anormal de motilidade (circular ou retrógrado), rápida queda do porcentual de motilidade, danos acrossomais, lesão da membrana plasmática, metabolismo reduzido e perda de componentes intracelulares (SQUIRES et al., 1999). Com isso, diversos experimentos vêm demonstrando a importância da curva de resfriamento para a prevenção da ocorrência de lesões espermáticas ocorridas no processo de criopreservação. WURGAU & LEIDL (1989), trabalhando com diversas espécies (bovinos, caprinos, ovinos, suínos e equinos), observaram a influência da velocidade de resfriamento do sêmen até a temperatura de 4 o C sobre a viabilidade espermática após a congelação. Esses autores concluíram que a curva mais lenta promoveu melhores índices de motilidade pósdescongelação, quando comparada com o resfriamento mais acelerado. Enquanto DEKA & RAO (1987), comparando três curvas de resfriamento para o sêmen caprino, verificaram que quanto mais lenta a curva de resfriamento, menor era a incidência de lesões acrossomais após a descongelação. O tempo de equilíbrio é considerado o tempo total em que os espermatozóides são mantidos em contato com o glicerol e todos os demais componentes do diluidor, previamente à congelação. Durante esse período ocorre o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular espermático e o extracelular formado por todos os componentes osmoticamente ativos presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL, 2000). Apesar de WESTHUYSEN (1978) ter 76 Ciência Animal, 17(2)75-82,2007

3 demonstrado a importância do período de equilíbrio ao qual o sêmen caprino deve ser submetido após o resfriamento, poucos trabalhos têm sido desenvolvidos com o objetivo de avaliar o período ideal para a prevenção de alterações morfológicas durante o processo de congelação do sêmen caprino. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino. MATERIAL E MÉTODOS Avaliação do sêmen a fresco Foram utilizadas dez amostras de sêmen colhidas de dois reprodutores caprinos adultos, selecionados após exame andrológico. Logo depois da colheita por vagina artificial, o sêmen foi encaminhado ao laboratório de processamento, mantido em banho-maria à temperatura de 35 o C e avaliado visualmente quanto a cor, volume, aspecto. As avaliações de motilidade total motilidade progressiva, vigor e turbilhonamento foram realizadas em microscópio com aumento de 100x e a concentração espermática obtida através da câmara de Neubauer. Também foram retiradas alíquotas do sêmen para avaliação do porcentual de defeitos espermáticos através de microscopia de contraste de fase com aumento de 1.000x. Diluição O diluidor Tris-gema de ovo (RFB2) foi preparado de acordo com ROBERTS (1986) e sofreu modificações na concentração do glicerol (6%) e na introdução do antibiótico sulfato de gentamicina (Schering-Plough S/A, São Paulo, SP) e acrescimo do dodecil-sulfato de sódio (0,5%) (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA). Todos os demais reagentes que compuseram o diluidor de congelação foram fabricadas pelo Laboratório VETEC Ltda (Duque de Caxias-RJ, Brasil). Após realizado o exame físico e microscópico do ejaculado, a amostra foi prédiluída em um tubo graduado, na proporção de uma parte de sêmen para duas de meio diluidor (1/2). Previamente a diluição inicial, o diluidor e o tubo foram aquecidos em banho-maria à 37 o C, a fim de proteger o sêmen durante a sua manipulação. Então, foram avaliadas a motilidade e vigor espermático por meio de microscopia óptica, com aumento de 200 a 400X, com o intuito de verificar possíveis alterações nas características seminais durante o processo de diluição. Após procedida a concentração espermática, por contagem em câmara de Neubauer, foi calculado o número de doses (100 milhões de espermatozóides/dose) e realizado o ajuste do volume final do diluidor a ser adicionado. A seguir, o sêmen foi envasado em palhetas de polietileno (0,25mL). Resfriamento do sêmen e tempo de equilíbrio O número total de palhetas foi dividido em quatro partes iguais, para então serem submetidas aos quatro protocolos de processamento antes da congelação. Metade das amostras (Grupos CL1 e CL2) foi resfriada através de uma curva de resfriamento lenta e submetida a dois tempos de equilíbrio (1 e 2h) e a outra metade (Grupos CR1 e CR2) foi resfriada por uma curva com a taxa de resfriamento rápida e submetida aos mesmos tempos de equilíbrio dos grupos anteriores (1 e 2h). O tempo de equilíbrio foi considerado o tempo total em que os espermatozóides foram mantidos em contato com o glicerol e com os demais componentes do diluidor, previamente à congelação (SALAMON & MAXWELL, 2000). Curva de resfriamento lento e tempo de equilíbrio Para a curva de resfriamento lento do sêmen, as amostras foram resfriadas a uma taxa média de 0,46 o C/min até atingirem a temperatura de 5 C (FURST et al., 2005). Depois desse período, as amostras foram mantidas à temperatura de 5 o C até completarem 1h (Grupo CL1) ou 2h de tempo de equilíbrio (Grupo CL2). Curva de resfriamento rápido e tempo de equilíbrio Esse protocolo de resfriamento foi realizado colocando-se as palhetas Ciência Animal, 17(2):75-82,

4 horizontalmente sobre plataformas de isopor, dentro de uma geladeira, com temperatura interna estabilizada em 5 o C. Dessa forma, as amostras foram submetidas a uma curva de resfriamento média de 1,07 C/min, até a temperatura de 5 o C. Depois desse período as amostras foram mantidas à essa temperatura até completarem 1h (Grupo CR1) ou 2h (Grupo CR2) de tempo de equilíbrio total (TE). Congelação do sêmen Após as respectivas curvas de resfriamento e tempos de equilíbrio e formados os quatro grupos experimentais (CL1, CL2, CR1, CR2), os mesmos foram submetidos ao seguinte protocolo de congelação: As palhetas foram colocadas horizontalmente em vapor de nitrogênio líquido a 5cm da lâmina líquida, por 20min, dentro de uma caixa de isopor. Essa caixa com 40cm de comprimento por 32cm de altura e 20cm de largura, continha 4cm de nitrogênio em seu interior. Após os 20min em vapor, as palhetas foram mergulhadas no nitrogênio líquido e colocadas em raques devidamente identificadas e armazenadas em botijão criogênico até o momento da descongelação (cinco dias após a congelação). Descongelação e avaliação espermática A descongelação foi realizada em banhomaria com temperatura estabilizada em 37 o C por 30s e depois de descongeladas as amostras foram submetidas à avaliação subjetiva de motilidade e vigor espermático. Todas as partidas de sêmen foram submetidas ao teste de termoresistência (TTR) para a espécie caprina, como preconizado por HENRY & NEVES (1998). Para a avaliação de danos na morfologia espermática (alterações de cabeça e cauda), foram retiradas alíquotas de 20ìL de cada um dos quatro tratamentos após a descongelação e colocadas em tubos com 2mL de formol-salina tamponado sendo estas posteriormente avaliadas por meio de microscopia de contraste de fase em aumento de 1.000x. Para tanto foram contadas 100 células espermáticas, computando e classificando individualmente as alterações encontradas em defeitos menores e defeitos maiores (BLOM, 1973). Delineamento e análise estatística O delineamento estatístico foi inteiramente casualizado, onde os ejaculados foram considerados repetições (n=10) e os protocolos de processamento do sêmen (CL1, CL2, CR1, CR2) foram considerados tratamentos (n=4). Os cálculos de média, desviopadrão e análise de variância foram realizados conforme SAMPAIO (1998) e para a análise estatística das características foi empregado o pacote estatístico Statistical Analysis System (SAS) versão 5.0 (1996), com a seguinte sequência de análises: 1. a consistência dos dados e a análise descritiva (médias e desvio-padrão) das características de interesse ao estudo foram realizadas mediante o emprego do procedimento MEANS; 2. as variáveis (defeitos maiores, defeitos menores, defeitos de acrossoma e defeitos totais; motilidade espermática total, motilidade progressiva e vigor espermático) foram comparadas por meio do Procedimento GLM, utilizando-se o teste de Student Newman Keuls (SNK), com nível de probabilidade de 5%. RESULTADOS E DISCUSSÕES Na Tab. 1 encontram-se as médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o sêmen a fresco e para os quatro grupos (CL1, CL2, CR1, CR2), logo após a descongelação. Todos os grupos experimentais apresentaram valores médios de MP e vigor iguais ou acima dos valores mínimos recomendados para os sêmen caprino descongelado de 30% para MP e 2 para o vigor, como preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal - CBRA (HENRY e NEVES, 1998). Logo após a descongelação (Tab. 1) não foi encontrada diferença significativa para as características de MT, MP e vigor entre os grupos estudados. BITTENCOURT et al. (2004), utilizando 78 Ciência Animal, 17(2)75-82,2007

5 Tabela 1. Médias e desvios padrão (s) de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (CL1, CL2, CR1, CR2) logo após a descongelação TRATAMENTO MT MP VIGOR Sêmen a Fresco 72,00 ± 11,59 a 66,50 ± 12,25 a 4,10 ± 0,21 b CL1 47,00 ± 14,56 b 42,00 ± 14,56 b 3,35 ± 0,33 b CL2 51,50 ± 10,81 b 46,50 ± 10,81 b 3,55 ± 0,15 b CR1 41,50 ± 08,18 b 36,50 ± 08,18 b 3,34 ± 0,23 b CR2 52,50 ± 11,11 b 47,50 ± 11,11 b 3,55 ± 0,15 b Valores seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,0001). CL1: curva de resfriamento lenta com 1h de tempo de equilíbrio; CL2: curva de resfriamento lenta com 2h de tempo de equilíbrio; CR1: curva de resfriamento rápido com 1h de tempo de equilíbrio e CR2: curva de resfriamento rápida com 2h de tempo de equilíbrio. protocolo semelhante ao descrito para o grupo CL1 (60min de resfriamento e tempo de equilíbrio, em geladeira estabilizada a 5 o C), obtiveram um resultado um pouco superior ao encontrado nesse estudo, de 51,0% de células com motilidade após a descongelação. Enquanto SANTOS (2001), com o mesmo protocolo utilizado para o Grupo CR2 (curva de resfriamento de 1,07 o C/min mais 90min de equilíbrio à temperatura de 5 o C), observou 31,9% e 2,8, respectivamente, para motilidade e vigor espermático. Valores inferiores aos observados com o referido grupo do presente experimento. Autores como MORAN et al. (1992) ressaltaram que a curva de resfriamento lento é necessário no período em que os espermatozóides são mais sensíveis ao choque pelo frio, ou seja, na faixa compreendida entre 19 e 8 o C, quando podem ocorrer mudanças irreversíveis à membrana espermática, caso o resfriamento seja acelerado. Neste intervalo de temperatura, a curva lenta (grupos CL1 e CL2) possibilitou taxas de resfriamento que variaram de 0,5 a 0,3 o C/min. No entanto, pode-se observar que não houve influência da curva de resfriamento sobre os índices de motilidade e vigor espermático (P>0,05). E o grupo submetido ao resfriamento com a curva rápida e mantido por 2h em tempo de equilíbrio (CR2) obteve os maiores valores numéricos de motilidade e vigor espermático. Resultados parecidos, na espécie caprina, foram citados por DEKA e RAO (1987), que não encontraram diferença entre as médias de motilidade espermática para o sêmen congelado após taxas de resfriamento que variaram de 1,00 a 0,21 o C/min, indicando assim, que talvez, para essa espécie, não haja a influência da curva de resfriamento sobre a motilidade espermática pósdescongelação. Dados semelhantes foram Tabela 2. Médias e desvios padrão de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides dos quatro tratamentos (CL1, CL2, CR1, CR2), logo após o teste de termoresistência (TTR) TRATAMENTO MT MP VIGOR CL1 40,55 ± 14,56 36,66 ± 13,69 3,38 ± 0,33 CL2 49,50 ± 10,39 44,50 ± 10,39 3,50 ± 0,00 CR1 38,50 ± 08,18 34,00 ± 08,43 3,25 ± 0,26 CR2 47,00 ± 07,88 41,00 ± 07,37 3,45 ± 0,15 CL1: curva de resfriamento lenta com 1h de tempo de equilíbrio; CL2: curva de resfriamento lenta com 2h de tempo de equilíbrio; CR1: curva de resfriamento rápido com 1h de tempo de equilíbrio e CR2: curva de resfriamento rápida com 2h de tempo de equilíbrio. Ciência Animal, 17(2):75-82,

6 Tabela 3. Médias e desvios padrão de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (CL1, CL2, CR1, CR2) TRATAMENTO DME DM AC DT Sêmen a Fresco 5,35 ± 03,54 4,85 ± 05,13 0,00 ± 00,00 10,20 ± 07,39 CL1 4,15 ± 03,23 4,15 ± 02,51 0,15 ± 00,33 08,45 ± 05,46 CL2 6,65 ± 04,50 4,75 ± 02,72 0,40 ± 00,56 11,80 ± 06,56 CR1 6,15 ± 04,73 5,25 ± 02,38 0,35 ± 00,47 11,70 ± 05,97 CR2 3,70 ± 04,24 4,30 ± 03,04 0,10 ± 00,31 08,10 ± 05,72 CL1: curva de resfriamento lenta com 1h de tempo de equilíbrio; CL2: curva de resfriamento lenta com 2h de tempo de equilíbrio; CR1: curva de resfriamento rápido com 1h de tempo de equilíbrio e CR2: curva de resfriamento rápida com 2h de tempo de equilíbrio. reportados por AZEVEDO et al. (2005) que compararam a utilização de dois protocolos de resfriamento do sêmen de dez carneiros. Após a descongelação os autores não verificaram a influência da velocidade da curva de resfriamento (0,25 o C/min versus 0,5 o C/min) até a temperatura de 5 o C, sobre a viabilidade do sêmen ovino descongelado. Pode-se verificar que, numericamente (P>0,05), houve uma discreta interferência do período de equilíbrio sobre as médias de motilidade espermática, principalmente entre os grupos submetidos à curva rápida, no qual o sêmen mantido por 2h em equilíbrio (CR2) obteve 11% a mais de MT e MP, que o submetido a 1h (CR1). Esta diferença demonstrou-se altamente significativa (P<0,0001) quando esses dois grupos (CR1 e CR2) foram comparados retirando-se da análise estatística os protocolos submetidos a curva de resfriamento lenta. Resultados semelhantes foram descritos por BITTENCOURT et al. (2006) e CHOE et al. (2006), cujo sêmen congelado após e 2h de tempo de equilíbrio obteve melhores (p<0,005) índices de MT e taxa de sobrevivência em relação a 1h de equilíbrio. Estes dados confirmam as citações feitas por WESTHUYSEN (1978) ao verificar que a medida que aumentou o tempo de equilíbrio ao qual era submetido o sêmen, melhorou significativamente a motilidade espermática pósdescongelação. Segundo SALAMON e RITAR (1982), a estabilização do sêmen por mais de uma hora a temperatura de 5 o C, previamente à congelação, é o melhor protocolo para criopreservação do sêmen caprino não centrifugado. As amostras dos grupos submetidos a curva lenta de resfriamento (CL1 e CL2) também foram analisadas separadamente dos demais grupos, para verificar a interferência do período de equilíbrio. No entanto, não foi verificada diferença significativa entre os mesmos (p>0,05). Na Tab. 2 encontram-se as médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os quatro grupos experimentais (CL1, CL2, CR1, CR2), logo após o teste de termoresistência (TTR). A semelhança das características de MT, MP e vigor espermático entre os grupos experimentais, mantiveram-se após o TTR (p>0,05). Entretanto, quando os grupos submetidos à curva rápida foram analisados separadamente, a superioridade no porcentual de MT verificada para o grupo CL2, logo após a descongelação, também foi observada após o TTR. Embora a taxa de MP e o vigor encontrados para o referido grupo (CL2), apresentarem uma leve tendência à superioridade (P=0,063 e P=0,054), não foram estatisticamente superiores Características morfológicas do sêmen descongelado Na Tab. 3 encontram-se as médias de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) 80 Ciência Animal, 17(2)75-82,2007

7 para o sêmen fresco e para os quatro grupos experimentais (CL1, CL2, CR1, CR2), logo após a descongelação. As médias encontradas de DME, DM e DT, para todos os grupos, ficaram abaixo dos valores máximos recomendados por HENRY e NEVES (1998), para o sêmen descongelado da espécie caprina, de 20% para defeitos totais e 10% para os defeitos maiores. Não foi verificada diferença significativa para os porcentuais de defeitos espermáticos entre os grupos experimentais, assim como entre estes e o sêmen fresco (Tab.3). Isto revela a eficácia dos protocolos utilizados para a manutenção das características morfológicas dos espermatozóides após o processo de congelaçãodescongelação. Estes resultados corroboram com os observados por BITTENCOURT et al. (2006), ao relatarem que o sêmen caprino submetido a 1 ou 2h de tempo de equilíbrio pré-congelação, apresentaram índices semelhantes (P>0,05) de defeitos menores, defeitos maiores e alterações acrossomais pós-descongelação. No entando, quando foram utilizados tempos de equilíbrio superiores (3 e 4h) o número de lesões acrossomais foram superiores (P<0,05) ao sêmen equilibrado por 1 ou 2h. Este achado induz a conclusão de que o sêmen caprino, possivelmente, demanda de um tempo de equilíbrio que varia de 1 a 2h, e tempos superiores a estes são desnecessários e podem influenciar negativamente a viabilidade espermática pós-descongelação. Pode-se observar que para os grupos congelados após a curva de resfriamento lenta (CL1 e CL2), o aumento do tempo de equilíbrio (de 1h para 2h) promoveu um acréscimo numérico sobre os índices de patologias espermáticas. Para o sêmen submetido à curva de resfriamento mais rápida (CR1 e CR2) ocorreu o contrário. O aumento do período de equilíbrio tendeu a minimizar o surgimento de alterações na morfologia celular, principalmente em relação ao surgimento de lesões acrossomais (P=0,06). Quando os grupos submetidos a duas horas de equilíbrio (CL2 e CR2) foram confrontados estatísticamente, constatou-se tendência (P=0,06) a uma menor taxa de defeitos acrossomais para o sêmen resfriado rapidamente (CR2). Estes resultados contradizem a literatura clássica sobre congelação do sêmen caprino, que afirma que quanto menor a taxa de resfriamento do sêmen caprino maior será a manutenção da viabilidade espermática pós-descongelação. DEKA e RAO (1987) identificaram menor incidência de lesões acrossomais, especialmente edema de acrossoma, no sêmen resfriado a taxas mais lentas, quando comparado ao ejaculado resfriado rapidamente. Posteriormente WURGAU e LEIDL (1989) confirmaram este fato ao verificarem que a curva de resfriamento mais lenta promoveu os melhores (P<0,05) índices de motilidade pós-descongelação, quando comparada com o resfriamento mais acelerado. A velocidade da curva de resfriamento e o tempo de equilíbrio não influenciaram a viabilidade do sêmen congelado da espécie caprina. No entanto, é necessária a realização de novos estudos, com a utilização de testes mais acurados da viabilidade espermática, para verificar se as tendências encontradas poderiam demonstrar a influência da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio, sobre a viabilidade do sêmen caprino após o processo de congelaçãodescongelação. AGRADECIMENTOS Esse trabalho foi desenvolvido com o apóio da CAPES e da FAPESB e com patrocínio do Laboratório Tecnopec. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AZEVEDO, H.C.; MAIA, M.S.; BICUDO, S.D.; SOUSA, D.B.; RODELLO, L.; SICHERLE, C.C. Cinética e integridade dos espermatozóides no sêmen ovino submetido a diferentes ritmos de refrigeração e congelação em sistema automatizado. IN: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 16, Goiânia GO. Anais... Belo Horizonte - MG: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, BITTENCOURT, R.F.; RIBEIRO FILHO, A. DE L.; SANTOS, A.D.F.; FURST, R.; TEIXEIRA, R.B.S.; CHALHOUB, M.; PORTELA, A.P.; ALVES, S.G.G.; Ciência Animal, 17(2):75-82,

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