Criopreservação de sêmen bovino utilizando diluente à base de PBS com três diferentes percentuais de gema de ovo

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1 Criopreservação de sêmen bovino utilizando diluente à base de PBS com três diferentes percentuais de gema de ovo Paulo Ricardo Loss Aguiar Juliana Brunelli Moraes Eduardo Malschitzky Anderson C. Silva RESUMO O objetivo deste experimento foi avaliar a eficácia de um diluidor à base de Phosphate Buffer Solution (PBS) na diluição e crioconservação de sêmen bovino com diferentes percentuais de gema de ovo (5, 10, 15 ou 20%). Nove ejaculados de três touros da Central Riograndense de Inseminação Artificial CRIA foram submetidos ao exame microscópio imediato (100x) da motilidade e vigor. Após a determinação da concentração os ejaculados foram fracionados em quatro alíquotas. Os diluidores foram preparados à base de solução de PBS-Nutricell; gema de ovo 5, 10, 15 ou 20% e glicerol 7%. O volume de diluente final foi calculado para que fosse obtida uma dose inseminante de 40 x 10 6 espermatozóides. Após a adição do diluidor os ejaculados foram envasados em palheta francesa de 0,5 ml e resfriados à temperatura de 5 o C por um período de quatro horas. Em seguida, as palhetas foram submetidas à pré-congelação em vapor de nitrogênio por 20 minutos antes de serem submersas no nitrogênio líquido. Após 24 horas as palhetas foram descongeladas em banho-maria a 37 o C/1 min. e o sêmen sofreu as seguintes análises: 1) Motilidade/vigor. 2)Teste de termo-resistência rápido-ttr (46 o C/30 min.). 3) integridade de acrossoma em contraste de fase. Os resultados obtidos para motilidade/vigor e integridade de acrossoma pósdescongelação não apresentaram diferenças significativas para p< Os resultados preliminares, in vitro, mostraram que o diluente testado, à base de PBS com diferentes percentuais de gema de ovo apresentou resultados semelhantes. O percentual de gema de ovo mais baixo (5%) apresentou uma melhor visualização da motilidade e vigor devido a pouca formação de sedimentos. Testes de campo estão sendo realizados e serão analisados em uma segunda etapa. Palavras-chave: Bovinos. Criopreservação seminal. PBS. Paulo Ricardo Loss Aguiar é Médico Veterinário, Msc. Professor Adjunto do Curso de Medicina Veterinária ULBRA/RS. Juliana Brunelli Moraes é Médica Veterinária. Aluna do Programa de Pós-Graduação QUALITTAS. Eduardo Malschitzky é Médico Veterinário. Dr., Professor Adjunto do Curso de Medicina Veterinária ULBRA/RS. Anderson C. Silva é Médico Veterinário. Central Rio-Grandense de Inseminação Artificial (CRIA). Endereço para correspondência: prlaguiar@terra.com.br 44Veterinária em Foco Veterinária Canoasem Foco, v.5 v.5, n.1, jul./dez. p jul./dez. 2007

2 Criopreservation of bull semen utilizing extender on the PBS basis with three different percentages of egg yolk ABSTRACT This experiment evaluated the effectiveness of an extender basically composed by Phosphate Buffer Solution (PBS) in the dilution and crioconservation of bovine semen with different percentages of egg yolk, 5, 10, 15 or 20%. Nine ejaculated of three bulls from the Central Riograndense de Inseminação Artificial CRIA had been submitted to the immediate microscopy (100x) analyses of motility and vigor. In sequence, the concentration was determined and the ejaculated was divided into four aliquots. The extenders based on PBS-Nutricell had been elaborated with 5, 10, 15 or 20% of egg yolk and 7% glycerol. The final volume of diluents was calculated to obtain an insemination dose of 40x10 6 spermatozoa. After the addition of the respective extender, the ejaculate had been barreled in 0,5ml straw French and cooled at of 5 o C for four hours. The straws had been submitted to pre-freeze in nitrogen vapor for 20 minutes, and then submerged in liquid nitrogen. After 24 hours the straw had been thawed at 37 o C/1 min. and the semen submitted to the following analyses: 1) Motility/vigor 2) TTR Test of termoresistence (46 o C/30 min.). 3) Acrosoma integrity in phase contrast microscopy. No significant difference (α < 0.05) was observed in the motility / vigor and acrosoma integrity, after-thawed and TTR. These preliminary in vitro results indicated similar efficiency of the diluents, PBS with 5, 10, 15 or 20% egg yolk, but the lower concentration of egg yolk (5%) permitted better visualization of spermatozoids motility and vigor due to lower sedimentation level. In a second stage field test will be carried. Key words: Bovine. Seminal criopreservation. PBS. INTRODUÇÃO O extensivo uso da inseminação artificial vem proporcionando um rápido incremento na seleção genética dos animais, refletido em um aumento da produtividade com maior retorno econômico ao produtor. O sucesso da inseminação artificial está diretamente ligado ao diluidor utilizado nos processos de criopreservação espermática, devido ao papel fundamental que exerce na manutenção da capacidade de fertilização dos espermatozóides. Em vista destes fatores, a criopreservação seminal tem sido alvo de constantes pesquisas relacionadas à descoberta de novos diluidores que proporcionem uma maior integridade aos espermatozóides durante o processo de congelação/descongelação. Autores descrevem que os diluidores devem conter, basicamente, substratos energéticos para o amarzenamento da célula espermática, soluções capazes de manter uma adequada pressão osmótica e ph e também, componentes que protejam o espermatozóide contra o choque térmico, permitindo a sua sobrevivência e sua integridade durante a diluição, resfriamento, congelação e descongelação (SALISBURY et al., 1978; MIES FILHO, 1986; BART; OKO, 1992; FOOTE et al., 2002). Nos últimos 50 anos o glicerol e a gema de ovo têm sido os crioprotetores mais amplamente utilizados. Estes componentes são necessários para manter a capacidade de fertilização do espermatozóide durante o processo de congelação/descongelação (THUN et al., 2002). Segundo o mesmo autor, o principal benefício da gema de ovo, principalmente 45

3 das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) existentes, é prevenir a perda da membrana fosfolipídica aumentando a tolerância do espermatozóide ao processo de congelação. De acordo com Amirat et al. (2004), o mecanismo preciso pelo qual o LDL interage com a membrana espermática ainda não é claramente conhecido. A solução denominada Phosphate Buffered Solution (PBS) descrita por Dulbecco e Vogt (1954) possui em sua composição sais à base de cloretos e fosfatos adicionados de componentes energéticos como glicose e piruvato de sódio. Esta solução foi desenvolvida, e ainda é largamente utilizada, para a manipulação e cultivo celular, caracterizando-se como uma solução tampão de osmolaridade 280mOsm e ph 7.2, portanto dentro dos padrões indicados para a diluição de ejaculados bovinos (LIU et al., 1998; GUTHRIE et al., 2002). Aguiar et al. (2005) observaram não haver diferença significativa na motilidade e no vigor do sêmen, no pós-congelamento quando utilizaram uma solução à base de PBS contendo 20% de gema de ovo comparado com solução de Citrato de Sódio a 2,94%. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia de uma solução à base de PBS com 5%, 10%, 15% e 20% de gema de ovo para a criopreservação seminal de touros. MATERIAL E MÉTODOS Animais e coleta do ejaculado Foram utilizados três touros adultos de raça européia pertencentes a Central Riograndense de Inseminação Artificial (CRIA), sediada no município de Esteio/RS. Os animais foram coletados em um mesmo período, sendo realizadas três coletas por touro com intervalo de uma semana entre coletas, totalizando nove ejaculados. As amostras de sêmen foram obtidas pela técnica de vagina artificial. Avaliação seminal Imediatamente após a colheita, o sêmen foi submetido aos exames macro e microscópico imediato. Macroscopicamente foram observados o volume e o aspecto seminal e, microscopicamente (aumento de 100x) foram avaliados motilidade, vigor e concentração. Esta última foi estimada através da utilização da câmara de Neubauer. Todas as amostras de sêmen submetidas ao processo de congelação de sêmen estavam dentro dos parâmetros mínimos considerados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal CBRA (1998). Diluidor Quatro soluções à base de PBS (Nutricell) foram preparados para um volume final de 50 ml contendo: PBS, 7% de glicerol e 5, 10, 15 ou 20% de gema de ovo, sendo 46

4 os diluidores denominados, respectivamente de: PBS5, PBS10, PBS15 e PBS20. Cada solução sofreu uma agitação por um período de 20 minutos, após o acréscimo de todos os componentes que formam os diluidores. Os diluidores foram preparados na manhã do mesmo dia da coleta. Diluição dos ejaculados Cada ejaculado foi fracionado em quatro alíquotas iguais, e adicionado os diluidores em cada fração para que a concentração da dose inseminante fosse de 40x10 6 espermatozóides. A diluição foi realizada em temperatura ambiente com o diluidor previamente aquecido em banho-maria a 37 C. O sêmen foi envasado a temperatura ambiente, em palhetas de 0,5 ml, e lacradas com álcool polivinílico. As amostras permaneceram sob refrigeração, a uma temperatura de 5 C durante quatro horas, sendo em seguida submetidas à pré-congelação. Utilizou-se o método horizontal em vapor de nitrogênio por 20 minutos para a pré-congelação, antes das palhetas serem submersas em nitrogênio líquido. Estas permaneceram armazenadas em botijão criogênico, por pelo menos 24 horas, antes de sofrerem as análises. Análise pós-descongelação As amostras foram descongeladas em banho-maria a 37 C/1min, e analisadas quanto a motilidade, vigor e patologia espermática. A amostras foram também submetidas ao teste de termo resistência rápido TTR (46 C/30 min). Análise estatística Para análise dos resultados utilizou-se o teste do Qui-Quadrado, sendo elaboradas as seguintes hipóteses estatísticas: Ho: 0 = E sendo o valor esperado calculado supondo que a motilidade nos três grupos será a mesma H1: 0 = E RESULTADOS E DISCUSSÃO As amostras de sêmen criopreservadas utilizando a solução de PBS com diferentes concentrações de gema de ovo (5, 10, 15 e 20%) indicaram, como mostra a tabela 1, não haver diferença estatística para p<0,05, tanto para os parâmetros de motilidade, vigor e integridade de acrossoma. Aguiar et al.. (2005) observaram não haver diferença 47

5 estatística para estes mesmos parâmetros quando compararam a solução de PBS 20% de gema com a solução de citrato de Na 2,94%-glicerol-gema. TABELA 1 Motilidade e vigor pós-descongelação das amostras dos três touros nos diferentes dias de coleta e diferentes concentrações de gema de ovo. 1 a coleta 2 a coleta 3 a coleta Pós-desc. Pós-desc. Pós-desc. TOURO AMOSTRA MOT. VIGOR MOT. VIGOR MOT. VIGOR PBS PBS A PBS PBS PBS PBS B PBS PBS PBS C PBS PBS x 2 p < 0,05 PBS Conforme mostra a Tabela 1, não houve diferença significativa entre os tratamentos para motilidade e vigor, contendo 5, 10, 15 e 20% de gema de ovo para p < 0,05, na avaliação pós-descongelação. Na Tabela 2 estão apresentados os resultados da motilidade e vigor das amostras para o teste de termo resistência rápido. TABELA 2 Motilidade e vigor após o TTR das amostras dos três touros nos diferentes dias de coleta e diferentes concentrações de gema de ovo. 1 a coleta 2 a coleta 3 a coleta TTR TTR TTR TOURO AMOSTRA MOT. VIGOR MOT. VIGOR MOT. VIGOR PBS PBS A PBS PBS PBS PBS B PBS PBS PBS PBS C PBS PBS x 2 p< 0,05 48

6 A Tabela 2 indica que não houve diferenças estatísticas entre a motilidade e o vigor para as diferentes concentrações de gema de ovo. Para o índice de alterações de acrossoma também não houve diferença estatística para p< 0,05, sendo observada uma taxa de 9, 8, 11 e 7%, respectivamente para 5, 10, 15 e 20% de gema ovo presente nos diluentes. England (1993) cita que a gema de ovo é o componente de origem biológica mais largamente utilizado na composição dos diluidores para o sêmen. Ela contém lecitina (fosfatidilcolina), a qual é sugerida para a proteção de membrana por restaurar os fosfolípidios perdidos durante o choque térmico (Hammerstedt et al., 1990). Durante o choque térmico, os fosfolipídios interagem com a estrutura lipídica da membrana plasmática das células espermáticas e proporcionam a proteção. As lipoproteínas ligamse à membrana da célula espermática e ajudam a preservar a integridade celular durante o armazenamento (AMIRAT et al., 2004). Foote et al. (1960) utilizaram concentrações de 0, 1, 5 e 20% de gema de ovo para o resfriamento de sêmen bovino à temperatura de 5 0 C. Observaram que somente na ausência da gema de ovo houve uma diminuição significativa na motilidade espermática. Os autores concluíram que a maior parte dos casos onde a osmolaridade, ph e outras características do tampão são ótimos para a sobrevivência espermática o nível de gema de ovo pode reduzir-se de 20 a 1%. Aguiar et al. (2005) observaram no seu experimento, onde utilizaram como diluidor do ejaculado bovino PBS + 20% de gema de ovo, uma dificuldade de visualização dos espermatozóides, dificultando a avaliação da motilidade e vigor. Os autores citam que provavelmente haja uma precipitação dos fosfolipidios na presença de grupos fosfatos componentes na solução de PBS. No presente trabalho foram diminuídas as concentrações de gema de ovo, com o intuito de obter-se uma melhor visualização do movimento dos espermatozóides, sem que houvesse uma queda na qualidade espermática. Nas concentrações de 15 e 10% ocorreu uma melhora considerável na visualização, diminuindo a formação de precipitações. No entanto, para a concentração de 5%, não houve nenhuma precipitação, permitindo uma perfeita visualização dos espermatozóides e por conseqüência o seu movimento, sem que houvesse uma modificação na sua motilidade, vigor e integridade de acrossoma, quando comparado com as outras concentrações. O presente resultado vai de encontro às observações de Moussa et al. (2002) e Amirat et al. (2004) onde concluíram que a concentração ótima de LDL, a qual fica entre 5-10% para que ocorra uma boa proteção de membrana, é encontrada em soluções com concentrações de 20% de gema de ovo. CONCLUSÃO Conclui-se que a solução de PBS adicionada a 5% de gema de ovo foi eficaz nas análises in vitro de motilidade, vigor e integridade de membrana acrossomal na pósdescongelação e no teste de termoresistência para o processo de criopreservação de 49

7 sêmen bovino. Também pode ser recomendado por permitir uma avaliação das características microscópicas sem interferências de sedimentos. REFERÊNCIAS AGUIAR, P. R. L.; MALSCHITZKY, E.; SILVA, A. C.; TEIXEIRA, C. D. Eficiência in vitro do PBS modificado para a criopreservação seminal de touros. Veterinária em Foco, v.2, n.2, p , AMIRAT, L.; TAINTURIER, D.; JEANNEAU, L.; THORIN, C.; GERARD, O. COURTENS, L. J.; ANTON, M. Bull semen In vitro fertility after cryopreservation using egg yolk LDL: a comparison with Optidyl., a commercial egg yolk extender. Theriogenology., v.61, p , BARTH, A. D.; OKO, R. J. Abnormal Morphology of Bovine Spermatozoa, Iowa State University Press, 1.ed., DULBECCO, R; VOGT, M., J. Exp. Med., v.99, p , ENGLAND, J.; SCARLETT, J.; MEYERS-VALEN et al. Computer-assisted sperm analysis of canine spermatozoa motility mesasurements. Theriogenology, v. 40, p , FOOTE, R. H.; L. C. GRAY; YOUNG, D. C.; DUNN, H. O. Fertility of bull semen stored up to four days at 5ºC in 20% egg yolk extenders. FOOTE, R. H.; BROCKETT, C. C.; KAPROTH, M. T. Motility and fertility of bull sperm in whole milk extender containing antioxidants. Anim. Reprod. Sci., v.71, p.13-23, GUTHRIE, H. D.; LIU, J.; CRITSER, J. K. Osmotic tolerance limits and effects of cryoprotectants on motility of bovine spermatozoa. Biol. Reprod., v.67, p , HAMMERSTEDT, R. H.; GRAHAM, J. K.; NOLAM, J. P. Cryospreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. Journal of Andrology, v.11, p.73-88, J. Dairy Sci. v.43, p , LIU, Z.; FOOTE, H. R.; BROCKETT, C. C. Survival of bull sperm frozen at different rates in media varying in osmolatity. Crybiology, v.37, p , MANUAL para exame andrológico e avaliação de sêmen animal, CRBA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, 2.ed., BH, MIES FILHO, A. Reprodução dos Animais e Inseminação Artificial. 6.ed. Porto Alegre, Sulina, v. Tecnologia do Sêmen. MOUSSA, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. Apr. 1 v.57(6), p , SALISBURY, G. W. Fisiologia de la reproduccion e inseminacion artificial de los bovinos. Zaragoza: Acribia, p.831, THUN, R.; HURTADO, M; JANETT, F. Comparison of Biociphos-Plus and TRIS-egg yolk extender for cryopreservation of bull semen.theriogenology. Feb., v.57(3), p , Recebido em: ago Aceito em: nov