REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA COMERCIAL

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1 UNIVERSIDADE DE FRANCA UNIFRAN REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA COMERCIAL ORIENTADORA: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza PÓS-GRADUANDA: Samanta Maria Faleiros Corrêa Franca 2009

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3 SAMANTA MARIA FALEIROS CORRÊA REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA COMERCIAL Dissertação apresentada à Universidade de Franca, UNIFRAN, como exigência parcial, para a obtenção do título de Mestre em Cirurgia e Anestesiologia Veterinária Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza FRANCA 2009

4 Catalogação na fonte Biblioteca Central da Universidade de Franca F177r Faleiros, Samanta Maria Refrigeração de sêmen canino em caixa térmica comercial / Samanta Maria Faleiros ; orientador: Fabiana Ferreira de Souza f. : 30 cm. Dissertação de Mestrado Universidade de Franca Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestre em Cirurgia e Anestesiologia Veterinária 1. Inseminação artificial Sêmem canino. 2. Inseminação artificial Refrigeração. 3. Inseminação artificial Espermatozóide. 4. Inseminação artificial Botutainer (caixa-térmica). 5. Cirurgia veterinária Reprodução animal (biotecnologia). I. Universidade de Franca. II. Título. CDU :636.7

5 SAMANTA MARIA FALEIROS CORRÊA REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN CANINO EM CAIXA TÉRMICA COMERCIAL COMISSÃO JULGADORA DO PROGRAMA DE MESTRADO EM CIRURGIA E ANESTESIOLOGIA VETERINÁRIA Presidente: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Universidade de Franca UNIFRAN Titular 1: Profa. Dra. Aline Adriana Bolzan Universidade de Franca - UNIFRAN Titular 2: Profa. Dra. Maria Isabel Mello Martins Universidade Estadual de Londrina - UEL Franca, 10/06/2009

6 DEDICO este estudo aos meus pais, Hortêncio e Marialda pela educação que foi a base necessária para vencer esta e todas as etapas de minha vida. Ao Cássio e Maria Leonor, pelo apoio e amizade. Em especial ao meu esposo Luiz Gustavo e ao meu filho Luiz Arthur, pelo amor sem medida e incentivo para que pudesse chegar até aqui...

7 AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus; à minha orientadora e amiga Profa. Fabiana Ferreira Souza, que me apoiou e auxiliou com seu imenso conhecimento; aos alunos Murillo Mansano Moscardini, Tarcísio Torre Lourenço e Diego Souza Moura, pela contribuição na realização deste trabalho. ao Canil e Hotel Bandog de adestramento, por gentilmente fornecer os animais para realização da colheita do sêmen; e à Universidade de Franca pela estrutura física disponibilizada para o estudo.

8 Enquanto estivermos tentando, estaremos felizes, lutando pela definição do indefinido, pela conquista do impossível, pelo limite do ilimitado, pela ilusão de viver. Quando o impossível tornar-se um desafio, a satisfação estará no esforço e não apenas na realização final... Gandhi

9 RESUMO CORRÊA, Samanta Maria Faleiros. Refrigeração de sêmen canino em caixa térmica comercial f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia e Anestesiologia Veterinária) Universidade de Franca, Franca. Muitos criadores têm encontrado no transporte do sêmen refrigerado, uma alternativa para substituir o transporte dos animais. Porém, no Brasil, ainda não se comercializam caixas térmicas específicas para esta finalidade. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade espermática do sêmen refrigerado de cães, em caixa térmica disponível no mercado nacional, para a conservação do sêmen em outras espécies. Para tanto, foram colhidos 16 ejaculados de seis cães adultos saudáveis. Os ejaculados foram analisados quanto à motilidade, ao vigor, à concentração, à morfologia espermática, ao teste hiposmótico e à coloração supra-vital com eosina. Após a análise, o sêmen foi dividido em quatro alíquotas, centrifugado e o sobrenadante retirado. Duas amostras foram rediluídas com o plasma seminal (controle) e duas com meio Kenney. Após a diluição, as amostras foram mantidas na caixa térmica Botutainer (Biotech, Botucatu, SP, Brasil), a qual preserva a temperatura em torno de 5 C, por até 35 horas. De acordo com os resultados, a caixa térmica foi capaz de manter alta viabilidade espermática, nas amostras conservadas em meio diluente e no plasma seminal. Contudo, o meio diluente foi superior ao plasma seminal, especialmente na manutenção da motilidade espermática. Concluiu-se que a caixa Botutainer pode ser empregada para o envio do sêmen canino, por meios de transporte convencionais. Palavras-chave: canino; refrigeração; espermatozóide; Botutainer; caixa-térmica.

10 ABSTRACT CORRÊA, Samanta Maria Faleiros. Canine chilled semen in commercial container f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia e Anestesiologia Veterinária) Universidade de Franca, Franca. Many breeders have found in chilled semen transport, an alternative to replace the animal transport. However, specific box to carry canine semen is not selling in Brazil. Thus, the purpose of this study was to evaluate canine sperm viability after to cool in a thermal box available on market, used to other species. Sixteen ejaculated from six healthy adult dogs were collected. The ejaculated were analyzed for motility, vigor, concentration, sperm morphology, swelling test and eosin stain. After analysis, the semen was divided into 4 aliquots, centrifuged and the supernatant was removed. Two samples were rediluted with seminal plasma and two with Kenney. These samples were kept in Botutainer (Biotech, Botucatu, SP, Brazil) thermal box, which maintains temperature around 5 C for 35 hours. According to our results, the box was capable to maintain increased sperm viability in samples either stored in extender or seminal plasma. However, the extender was superior to seminal plasma, particularly to preserve the sperm motility. It was concluded that Botutainer thermal box can be used to carry canine semen by conventional means. Key-words: dog; chilled; sperm, Botutainer; thermal-box.

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Caixa térmica para o transporte do sêmen, Botutainer (Biotech, Botucatu, SP, Brasil) para o transporte de sêmen a 5 C. A- Caixa Botutainer fechada; B- Caixa Botutainer aberta e preenchida por dois gelos eutéticos, no centro três amostras de sêmen e um frasco com água; C- Caixa Botutainer aberta com a tampa 22 Figura 2 - Média e erro padrão da motilidade espermática de 16 ejaculados de seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita (fresco), 24 e 48 horas após a refrigeração 25 Figura 3 - Resultados da coloração com eosina (A) e do teste hiposmótico (B). A. A seta preta indica espermatozóide sem coloração (membrana íntegra) e a vermelha corado com eosina (membrana lesada). B. A seta preta indica o espermatozóide com a cauda reta (membrana lesada) e a vermelha o espermatozóide com a cauda enrolada (membrana íntegra) 25

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Cães utilizados no experimento, de acordo com a raça e número de ejaculados 20 Tabela 2 - Média do volume, concentração de espermatozóides/ml, motilidade, vigor espermático, testes hiposmótico, coloração com eosina e porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais de 16 ejaculados de seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita (fresco), 24 e 48 horas após a refrigeração. 24

13 SUMÁRIO INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA OBJETIVO MATERIAIS E MÉTODOS ANIMAIS COLHEITA DO SÊMEN AVALIAÇÃO DO SÊMEN REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS DISCUSSÃO...26 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 32

14 INTRODUÇÃO Em muitos países as técnicas de inseminação artificial (IA) com sêmen refrigerado e congelado são rotineiras, bem como o conhecimento das doenças que afetam a função reprodutiva dos cães, mas no Brasil esta realidade ainda longe. Tendo em vista o transporte de sêmen para IA, dois métodos podem ser utilizados a refrigeração a 4 e 5ºC e a congelação à -196ºC porque as baixas temperaturas diminuem as taxas metabólicas dos espermatozóides e prolongam sua longevidade. Taxas de concepção semelhantes têm sido relatadas na IA com sêmen fresco e refrigerado e a qualidade do sêmen refrigerado é superior ao congelado. Desta forma, para o transporte de sêmen dentro do país, deve ser dada preferência à refrigeração. A existência de poucos estudos relacionados à refrigeração do sêmen de cão motivou esta pesquisa para avaliar a viabilidade do sêmen durante 48 horas, tempo suficiente para o envio por meios de transporte convencionais, utilizando-se a caixa térmica Botutainer (Biotech, Botucatu, SP, Brasil), a qual mantém a temperatura em torno de 5 C, durante 35 horas de acordo com as orientações do fabricante.

15 1 REVISÃO DA LITERATURA Atualmente, as técnicas que visam melhorar a eficiência reprodutiva em cães ainda são pouco difundidas no Brasil. Porém, a reprodução canina no país vem crescendo expressivamente (VALLE, 2009). Muitos pesquisadores estão utilizando as biotécnicas visando o melhoramento genético e com isso têm surgido reprodutores de alto valor (LINDE- FORSBERG; FORSBERG,1993). Biotécnicas, que há muito tempo eram utilizadas em animais de produção, como inseminação artificial (IA) com sêmen refrigerado e sêmen congelado, hoje são procuradas por criadores de cães brasileiros. Contudo, seu sucesso pode ser ameaçado pelo desconhecimento dos clínicos de pequenos animais e também pela utilização errônea por leigos (VALLE, 2009). Os primeiros estudos relacionados a IA e conservação do sêmen de cães foram feitos por Lázaro Spallanzani, no final do século XVIII (ENGLAND, 1993). Embora os árabes tenham usado a IA em equinos, no século XIV (1332), antes de Spallanzani, acredita-se que seus estudos foram os primeiros dos tempos modernos a obter uma gestação por IA, utilizando o cão como modelo. Em 1780, este pesquisador colheu o sêmen por sifonagem da vagina de uma cadela, acasalada naturalmente, para inseminar outra cadela no cio, da qual nasceram três filhotes. Foi também Spallanzani, em 1776, o primeiro a observar que a diminuição na temperatura reduzia reversivelmente, a atividade metabólica dos espermatozóides, permitindo dessa forma sua estocagem (JOHNSTON, 2000). Em 1949, a descoberta da ação crioprotetora do glicerol, por Polge et al. (1949), proporcionou um impacto significante na metodologia da criopreservação dos espermatozóides. Rowson, em 1954, descreveu a técnica de congelação na espécie canina. E, em 1956, Harrop descreveu uma gestação de cão obtida por inseminação com sêmen refrigerado (JOHNSTON, 2000). Em 1969, Seager obteve a primeira gestação canina com sêmen

16 criopreservado (SILVA, 2007). Durante as últimas décadas, o interesse pela inseminação artificial (IA), em cães, cresceu substancialmente. No Brasil, os primeiros relatos de IA com sêmen refrigerado, em cães, foi o de Silva et al., em 2004, seguido por Apparício et al. (2007) e Uchoa et al. (2007). O principal objetivo da IA, em cães, é viabilizar a gestação quando a monta natural não é possível, seja por incompatibilidade do casal, assim como por distância geográfica. A técnica também reduz o risco de transmissão de doenças entre machos e fêmeas, além de minimizar os riscos com o transporte do animal. Nestes casos, o sêmen pode ser refrigerado ou congelado. Embora o sêmen refrigerado sofra menores danos pela temperatura, as taxas de concepção, de cadelas inseminadas com sêmen refrigerado, são menores do que aquelas inseminadas com sêmen fresco ou monta natural (ENGLAND; PONZIO, 1996; JOHNSTON et al., 2001; RIJSSELAERE et al., 2002; SILVA et al., 2004). Quando o sêmen necessita ser transportado para proposta de IA, dois métodos podem ser utilizados: o sêmen congelado (-196 C) e o refrigerado (5 C) (ENGLAND; PONZIO, 1996). As baixas temperatur as diminuem as taxas metabólicas do espermatozóide e prolongam sua longevidade (WATSON, 1995). A despeito do curto período de armazenamento da técnica de refrigeração, a vantagem é que a qualidade do sêmen refrigerado é superior à do congelado (ENGLAND; PONZIO, 1996), sendo uma técnica viável para curtos períodos de armazenamento. Ademais, a técnica de refrigeração apresenta menor custo, outra vantagem do sêmen refrigerado, em relação ao congelado, é o menor dano às células espermáticas, com taxas de gestação superiores (STORNELLI et al., 2001). Contudo, com longos períodos de estocagem, o sêmen refrigerado se deteriora (ENGLAND; PONZIO, 1996). Quanto ao sêmen congelado, embora possa ser armazenado por longos períodos (anos), a viabilidade e longevidade espermática são prejudicadas e, conseqüentemente, a fertilidade (OETTLÉ, 1986; ENGLAND, 1993; ENGLAND; PONZIO, 1996). Pinto et al. (1999) estudaram a fertilidade de cadelas inseminadas com sêmen refrigerado. Estes pesquisadores não encontraram diferença significativa na taxa de gestação e tamanho da ninhada, entre os grupos de

17 cadelas inseminadas com sêmen fresco (94%, média tamanho da ninhada = 7,2) e as inseminadas com sêmen refrigerado por 24 horas (90%, média tamanho da ninhada = 7,2) ou 48 horas (100%, média tamanho da ninhada = 7,0). Neste estudo de Pinto et al. (1999) o sêmen foi mantido sob refrigeração durante 48 horas e as cadelas foram inseminadas três vezes durante 1 semana, durante o estro citológico. Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986), a fertilidade do sêmen refrigerado é de, no máximo 72 horas. Contudo, Feldman e Nelson (1996), afirmaram que, se o sêmen for adequadamente diluído e refrigerado, os espermatozóides podem manter-se vivos e viáveis por até cinco dias. Experimentos recentes comprovam a permanência de viabilidade espermática por tempo mais prolongado. A despeito da existência de diversos estudos sobre a congelação do sêmen do cão, a literatura é escassa quanto à refrigeração. Raros relatos sobre refrigeração dos espermatozóides caninos em temperaturas superiores a 5 C têm sido encontrados. England e Ponzio (1996) verificaram uma alta qualidade do sêmen após 48 horas de refrigeração a 5 C. Contudo, a tax a de declínio da qualidade espermática foi diferente para cada parâmetro motilidade, vigor, teste hiposmótico e coloração com eosina, de acordo com o tempo, sendo a morfologia espermática o que se deteriorou mais rapidamente. Aproximadamente, com cinco dias de refrigeração, a qualidade do sêmen refrigerado foi equivalente à qualidade de um sêmen descongelado. A refrigeração do sêmen, durante 24 a 48 horas, pode ser um passo inicial para a congelação, quando há impossibilidade do congelamento logo após a colheita. Para esta proposta, Hermansson e Linde-Forsberg (2006) congelaram o sêmen de cão, após um ou dois dias de refrigeração a 4 C. Nenhuma diferença foi verificada na motilidade e integridade da membrana espermática e acrossomal, quando comparado àquele congelado logo após a colheita. As características de um bom sêmen, para a espécie canina, de acordo com o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA) são: volume

18 variável, motilidade maior que 70%, vigor maior que três e concentração espermática total acima de 200x10 6 de espermatozóides. É difícil, também, determinar a fertilidade dos machos caninos devido às variações inerentes aos ejaculados, variações no ciclo estral da cadela, sua duração a falta de protocolos efetivos para sincronização do cio, tudo isso utilizando testes in vitro esporádicos dificultam a análise dos resultados sobre a capacidade fecundante das amostras (EILTS, 2005; MINTER; DELIBERTO, 2005) Ademais, os bons resultados obtidos com refrigeração se devem á boa qualidade do sêmen, a qual deve ser avaliada no momento da sua preparação e antes de sua utilização, bem como o controle da ovulação da fêmea (VALLE, 2009). A refrigeração e a congelação do sêmen só são possíveis com o uso de meios diluentes capazes de conservar uma boa motilidade e integridade da membrana espermática (BOUCHARD et al., 1990). O diluente é capaz de proteger a membrana espermática dos danos causados pela modificação de temperatura. Além disso, o diluente é fonte de energia e mantém estáveis o ph e a osmolaridade (LARDY; PHILIPS, 1939, MARSHALL; HUGH, 1990) e contêm antibióticos que evitam a contaminação bacteriana (ROTA et al., 1995). O meio diluente mantém a pressão osmótica e a concentração de eletrólitos dentro dos padrões fisiológicos e possue crioprotetores que protegem as células de lesões provocadas pelo choque térmico, oriundo do processo de resfriamento (CONCANNON; BATTISTA, 1989). A melhor maneira de avaliar o diluente é através da taxa de concepção apresentada pela cadela após a IA, porém esta avaliação muitas vezes torna-se inviável na experimentação (LOPES et al., 2005) Vários diluentes para conservação de sêmen já foram estudados. Na maioria dos trabalhos realizados utilizou-se o meio TRIS/gema de ovo, contendo frutose ou glicose, meio citrato/gema de ovo e meios comerciais (FOOTE, 1964; FOOTE; LEONARD, 1964; GILL et al., 1970; SEAGER; FLETCHER, 1972; FARSTAD, 1984; PROVINCE et al., 1984; MORTON; BRUCE, 1989; BOUCHARD et al., 1990; LINDE-FORSBERG, 1995, FELDMAN; NELSON, 1996; SCHAFER et al., 1997; PINTO et al., 1999; IGUER-OUADA; VERSTEGEN, 2001a; 2001b; TSUTSUI et al., 2003). A frutose, numa concentração de 1 a 10 mm, indica maior

19 linearidade e menor oscilação nos parâmetros de motilidade quando comparada à glicose (RIGAU et al., 2001). Contudo, o meio mais popular e simples é o Kenney, composto de leite desnatado (0,5% de gordura) (KENNEY et al., 1975). Verstegen et al. (2005) avaliaram a troca de meio, nos parâmetros de motilidade do sêmen refrigerado em diluente TRIS-glicose-gema de ovo, por um período de 27 dias. Nas amostras sem a troca de meio, foi observada ausência de motilidade, aos 16 dias. Com a troca de meios, a motilidade foi ausente somente com 27 dias. A fertilidade foi avaliada e cinco entre dez cadelas apresentaram-se gestantes quando a IA foi realizada apenas uma vez, por via vaginal, com sêmen refrigerado, por nove dias. Ademais, sete entre dez cadelas foram gestantes, quando a inseminação foi realizada duas vezes. Concluíram que é possível a conservação do sêmen a 4 C, por no mínimo, três sem anas com boa fertilidade por até 10 dias. Bouchard et al. (1990) estudaram as características do sêmen de cães mantido a 4 C, utilizando dois meios: leite de snatado/glicose ou citrato gema de ovo. O sêmen diluído foi submetido a três diferentes temperaturas de estocagem (35 C, 22 C e 4 C); e três taxas de refri geração (4 C) foram investigadas (-1,0, -0,3 e -0,1 C/min). O sêmen foi avaliado a cada seis horas, até 120 horas. O meio contendo leite desnatado foi superior ao citrato/gema, na maioria das observações, na manutenção da motilidade espermática. Além disso, a motilidade espermática foi significantemente maior quando o sêmen foi conservado a 4 C. A motilidade foi maior quando for am utilizadas taxas médias ou rápidas de refrigeração. Segundo Messias (2000), o sêmen canino refrigerado (4 C) diluído em TRIS-gema mostrou-se superior ao diluente leite desnatado. Os diluentes TRIS-gema e leite desnatado, quando acrescidos de secreção prostática, mostraram-se inferiores nos parâmetros motilidade progressiva e integridade do acrossomo (p < 0,05). O tempo de viabilidade do sêmen, que apresentou mínimo de 50% de motilidade progressiva, com os referidos diluentes foi: TRIS-gema: 82,5 horas; leite desnatado: 60,7 horas; TRIS gema acrescida de secreção prostática: 60,3 horas; leite desnatado acrescido de secreção prostática: 38,4 horas. Os

20 diluentes acrescidos de secreção prostática não apresentaram resultados satisfatórios na conservação do sêmen canino a 5 C. Iguer-Ouada e Verstegen (2001a) encontraram uma média de 86,3% de motilidade, para o meio Byladil acrescido de gema de ovo, sete dias após a refrigeração do sêmen a 4 C. A motilidade foi manti da até em média, 9,7 e 13 dias para os diluentes TRIS-frutose e TRIS-glicose, respectivamente. Os meios contendo gema de ovo preservaram a qualidade espermática e preveniram a precoce reação do acrossomo, podendo preservar uma boa viabilidade até 10 dias de refrigeração, desde que a temperatura seja mantida. O uso de caixas isotérmicas para o envio de amostra de sêmen, entre regiões distantes, permite uma melhor programação para o destino das amostras e evita a perda do material (MOTA-FILHO et al., 2007). Para o transporte, existem sistemas de resfriamento passivos e ativos. Os passivos apresentam menor custo, porém sua eficiência depende de alguns fatores, tais como: temperatura ambiente; da amostra; do produto refrigerado e da massa da amostra. Já os sistemas ativos, apesar de mais caros, permitem melhores taxas de resfriamento, pois a temperatura é pré-estabelecida (VALLE, 1999). Exemplo de um sistema passivo são as caixas térmicas de isopor e de um sistema ativo, o refrigerador doméstico. A conservação do sêmen do cão já foi descrita em salas climatizadas (IGUER-OUADA; VERSTEGEN, 2001a; 2001b; VERTEGEN et al., 2005), refrigeradores convencionais (ROTA et al., 1995; STROM-HOLST et al., 2000; PONGLOWHAPAN et al., 2004), garrafas térmicas, recipientes térmicos comerciais tais como Lane STS System (PINTO et al., 1999), Botutainer (NAGAO et al., 2007) e caixas isotérmicas de poliestireno expandido (SILVA et al., 2004, MOTA-FILHO et al., 2007). Sistemas utilizando caixas de poliestireno expandido (isopor), como o Max Semen Express são os mais simples, disponíveis comercialmente, porém não possuem controle algum de temperatura. Nenhuma das caixas produzidas no Brasil é própria para o transporte do sêmen canino (comunicação pessoal, SOUZA, 2009). Quando se compara os containeres para o sêmen congelado (botijão

21 de nitrogênio líquido) e refrigerado (caixa térmica), pode-se afirmar que as caixas térmicas são mais leves e por este motivo, o transporte de custo menor, o que pode ser outra vantagem. Segundo o fabricante a caixa Botutainer é um container desenvolvido para a refrigeração de sêmen, demonstrando alta eficiência na manutenção da temperatura interna, mesmo sobre estresse calórico ambiental. Sua taxa de refrigeração é de 0,05ºC/min, mantendo a temperatura de 5ºC, por até 35 horas. Mota-Filho et al. (2007) comentam a necessidade de mais estudos para determinar o período máximo de conservação do sêmen, em caixas isotérmicas. Tais estudos podem contribuir para determinação de uma caixa e meio diluente ideal para refrigeração do sêmen canino, com fins de aplicação comercial, além de servir como modelo para o transporte de sêmen de espécies ameaçadas de extinção (LOPES et al., 2005).

22 2 OBJETIVO O objetivo do presente estudo foi determinar a viabilidade das células espermáticas de cães mantidas a 5 C, durante 24 e 48 horas, de acordo com suas características morfológicas e funcionais, utilizando: volume, cor, motilidade e vigor, concentração espermática, morfologia espermática, teste hiposmótico e coloração supra-vital, em caixa térmica Botutainer para sua aplicação comercial.

23 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 ANIMAIS Utilizaram-se 16 ejaculados de seis (n = 6) cães adultos, de diferentes raças ou sem raça definida (tabela 1) com idades entre dois e cinco anos, saudáveis, avaliados pelo exame clínico e histórico de saúde, provenientes de criatórios particulares e treinados para colheita. Os machos foram alimentados com ração comercial e água à vontade. Tabela 1 Cães utilizados no experimento, de acordo com a raça e número de ejaculados. Cão Raça Número de ejaculados Peso 1 Border Collie 4 19,3 Kg 2 Rottweiler 4 35,1 Kg 3 Labrador 2 25 Kg 4 Labrador 3 21 Kg 5 SRD 2 15 Kg 6 SRD 1 18 Kg 3.2 COLHEITA DO SÊMEN Após o período de adaptação e condicionamento (três semanas), os

24 cães foram submetidos a duas colheitas de sêmen, com intervalo médio de sete dias entre cada uma. O ejaculado foi colhido por manipulação digital, em tubo plástico graduado e funil acoplado, sem auxílio de fêmea no cio (SEAGER; PLATZ, 1977). 3.3 AVALIAÇÃO DO SÊMEN O sêmen foi avaliado, imediatamente após a colheita, e com 24 horas e 48 horas de refrigeração. Após a colheita, o sêmen foi avaliado, no prazo máximo de 15 minutos, segundo as suas características morfológicas e funcionais. Foram avaliados os seguintes parâmetros: Volume: determinado pela graduação do tubo plástico utilizado na colheita em ml. Cor: determinada pela visualização direta, considerando a cor branca opalescente como normal. Motilidade e vigor: determinados com uma gota de sêmen colocada sobre lâmina aquecida (38 40ºC) e recoberta por lamínula, sendo os parâmetros de 0 a 100% para motilidade e um escore de 0 a cinco para o vigor, de acordo com a qualidade do movimento dos espermatozóides. Concentração espermática: foi realizada em câmara hematimétrica de Neubauer após a diluição do sêmen total na proporção de 1: 20 em água destilada. Os espermatozóides foram contados sob microscópio de contraste de fase, em aumento de 20X e o número de células foi expresso em ml. Morfologia espermática: foi avaliada em uma única oportunidade, após a colheita de todas as amostras e após 24 e 48 horas pelo método de Karras modificado (PAPA et al; 1986). Teste hiposmótico: realizado segundo a técnica descrita por JEYENDRAN et al. (1984), considerando que espermatozóides com cauda

25 enrolada mantinham a membrana íntegra e os espermatozóides com cauda lisa tinham a membrana lesada. Coloração supra-vital: avaliada pelo método da eosina (eosina amarela 3% em solução fisiológica - HAFEZ, 1995, PEÑA, 2000), considerando que espermatozóides sem coloração tinham a membrana íntegra e espermatozóides que coravam-se em vermelho tinham a membrana lesada. 3.4 REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN Após a análise, o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e colocado em tubos plásticos de 5 ml. As amostras foram centrifugadas a 700xg, durante 10 minutos. O sobrenadante plasma seminal, foi eliminado dos tubos, sendo duas amostras diluídas em 1,0 ml de meio Kenney 1:1 (KENNEY et al., 1975) e os dois tubos restantes rediluídos no plasma seminal provenientes da centrifugação. Os tubos contendo o sêmen diluído (Kenney ou plasma seminal) foram fechados com tampa e acondicionados na caixa térmica Botutainer. No momento da avaliação, uma alíquota de cada tubo (sêmen diluído em plasma seminal ou em Kenney) foi retirada. A alíquota retirada da caixa térmica foi colocada, em estante para tubos sobre placa aquecedora a 38ºC, durante 10 minutos, e após este período foi avaliada quanto à motilidade, ao vigor, à morfologia, à coloração supra-vital com eosina e ao teste hiposmótico.

26 B A C Figura 1 - Caixa térmica, Botutainer (Biotech, Botucatu, SP, Brasil) para o transporte de sêmen a 5 C. A - Caixa Botutainer fechada; B - Caixa Botutainer aberta e preenchida por dois gelos eutéticos; no centro três amostras de sêmen e um frasco com água ( seguindo a orientação do fabricante); C- Caixa Botutainer aberta com a tampa. 3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados foram expressos na forma de média e erro padrão. As análises dos resultados, referentes às características seminais, foram realizadas pelo Mann-Whitney Rank Sum Test, utilizando o programa SigmaStat for Windows, v (2003). A diferença mínima significativa considerada foi p<0,05.

27 4 RESULTADOS A análise do sêmen fresco encontrou-se dentro dos parâmetros normais para a espécie (Tabela 1). Os resultados da análise do sêmen fresco, e após 24 e 48 horas de refrigeração a 5 C, diluído em plasma seminal (cont role) ou meio Kenney estão apresentados na Tabela 1. Todos os parâmetros avaliados no sêmen fresco foram superiores (p<0,05) aos do sêmen refrigerado, seja em plasma seminal ou meio Kenney. Na Figura 2, é possível observar que o sêmen mantido em meio Kenney apresentou maior motilidade (p<0,05) do que o mantido em plasma seminal, utilizado como controle, quando comparados em qualquer situação. A qualidade do movimento (vigor espermático) foi mantida tanto no sêmen diluído no plasma seminal (p>0,05), assim como no meio Kenney. Estatisticamente, maior lesão da membrana espermática foi observada no sêmen refrigerado em plasma seminal e meio Kenney, durante 48 horas, avaliado pelo teste hiposmótico, e do sêmen refrigerado em meio Kenney, durante 48 horas, avaliado pela coloração com eosina (Figura 3).

28 Tabela 2 - Médias e erros padrão do volume (VOL), concentração de espermatozóides/ml (CONC/ml), motilidade espermática (MOT), vigor espermático (VIG), teste hiposmótico (HIPOSM), coloração com eosina (EOS) e porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais (NORM) de 16 ejaculados de seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita (fresco), e 24 e 48 horas após a refrigeração. TRAT VOL CONC/ml MOT VIG HIPOSM EOS NORM (ml) (x10 6 ) (%) (0 a 5) (%) (%) (%) FRESCO 2,3 150,4 96,8 a 4,1 a 89,9 a 88,0 a,b,c 73 Plasma 24 h ,0 b 2,8 b 84,7 a,b 85,3 a -- seminal 48 h ,5 c 2,8 b 81,3 b 80,7 a,b,c -- Kenney 24 h ,7 d 3,3 b 84,5 a,b 80,0 a,b,c h ,8 b 2,8 b 79,2 b 77,9 c -- Letras diferentes nas colunas indicam diferença estatística significativa (p<0,05) Plasma seminal Kenney 90 Motilidade (%) Fresco 24 horas 48 horas Figura 2 - Média e erro padrão da motilidade espermática de 16 ejaculados de seis cães, diluídos em plasma seminal ou meio Kenney, imediatamente após a colheita (fresco), 24 e 48 horas após a refrigeração.

29 A B Figura 3 Resultados da coloração com eosina (A) e do teste hiposmótico (B). A. A seta preta indica espermatozóide sem coloração (membrana íntegra) e a vermelha corado com eosina (membrana lesada). B. A seta preta indica o espermatozóide com a cauda reta (membrana lesada) e a vermelha o espermatozóide com a cauda enrolada (membrana íntegra).

30 DISCUSSÃO O armazenamento de germoplasma abre fronteiras para o estudo da preservação de espécies de canídeos silvestres, sendo uma das principais formas de aumentar a variabilidade genética (JOHNSTON ;LACY, 1995). Neste contexto, novos métodos têm sido desenvolvidos no intuito de viabilizar a criopreservação e técnicas de avaliação da função espermática, no cão. Em vista da dificuldade de se realizar testes in vivo, para avaliação da fertilidade no cão, e sabendo que os ensaios in vitro são capazes de mostrar quais os aspectos da função espermática estão alterados (AMANN, 1989; ZHANG et al., 1999) nesse estudo foram utilizadas técnicas convencionais (motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática) e complementares para avaliar (teste hiposmótico e coloração com eosina). Desta forma, acreditou-se que a união desses testes seria capaz de predizer a fertilidade in vivo. A principal forma de se avaliar a célula espermática in vitro é determinar suas características morfofuncionais (EILTS, 2005). A avaliação da motilidade espermática é a mais comum e informa sobre uma das características necessárias ao espermatozóide para a fertilização. Apesar disto, a correlação entre a motilidade e a capacidade fertilizante da célula espermática ainda não é totalmente esclarecida e os achados são conflitantes (ENGLAND & ALLEN, 1989, SÖDERQUIST et al., 1991, KJAESTAD et al., 1993, IVANOVA-KICHEVA et al., 1997, SANCHEZ-PARTIDA et al., 1999, TARDIF et al., 1999). No estudo aqui apresentado, a motilidade do sêmen mantido a 5 C, durante 48 horas, manteve-se próxima (65,8%) daquela recomendada como mínima (70%), para o sêmen fresco, pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA). Já que a motilidade tem sido correlacionada positivamente à fertilidade in vitro, determinada pelo teste de penetração em zona pelúcida (HOLT et al., 1985, FETTEROLF & ROGERS, 1990), acredita-se que esse sêmen poderia ser capaz de promover a fertilização.

31 Comparando-se os resultados deste estudo, com os descritos na literatura, os aqui apresentados foram inferiores aos encontrados por Verstegen et al. (2005), que refrigeram a 4 C, o sêmen canino por longos períodos (até 27 dias) com meio TRIS- gema- glicose. Nos dias 11, 21 e 27 o meio foi trocado e a motilidade espermática recuperada, parcialmente. A motilidade total média, avaliada por análise computadorizada (CASA), manteve-se em 68% até o 11 dia. Contudo, o meio descrito nos estudos de Verstegen et al. (2005) foi diferente do utilizado neste estudo (Kenney). Além disso, as condições dos estudos não são semelhantes. Nesse estudo, utilizou-se uma caixa térmica, na qual a temperatura não é constante e é mantida por tempo limitado, sendo possível a refrigeração por poucos dias. Já no estudo de Verstegen et al. (2005), utilizaram-se refrigeradores. De acordo com Iguer-Ouada e Verstegen (2001), meios contendo gema de ovo preservam a qualidade espermática e previnem a precoce reação do acrossomo, podendo preservar uma boa viabilidade até 10 dias de refrigeração, desde que a temperatura seja mantida. Em eqüinos, Melo et al. (2005) também descrevem a melhor qualidade do sêmen refrigerado em meio contendo gema de ovo. Tais observações não foram confirmadas aqui anteriormente em um estudo piloto, pois a proposta inicial foi utilizar o meio TRIS-gema-glicose, mas a qualidade do sêmen foi inferior e optou-se por utilizar o meio Kenney, o qual mostrou resultados superiores. Contrariamente, o estudo de Bouchard et al. (1990) descreveu superioridade do meio contendo leite desnatado quando comparado ao citrato/gema, na maioria das observações, para manter a motilidade espermática. Messias (2000) relatou que o sêmen canino refrigerado (4 C) diluído em TRISgema mostrou-se superior ao diluente leite desnatado, sendo que a motilidade mínima de 50% foi observada até 60,7 horas, quando se usou o meio à base de leite desnatado. De acordo com os resultados desse estudo, a motilidade espermática foi superior a 60%, até 48 horas de manutenção na caixa térmica. A avaliação da funcionalidade da membrana pode ser usada como um indicador da capacidade de fertilizar do espermatozóide (JEYENDRAN et al., 1984). Neste estudo a integridade da membrana avaliada pelo teste hiposmótico

32 foi menor no sêmen refrigerado, contudo manteve-se nas 48 horas de refrigeração, próximo aos 80%. A integridade da membrana é um método complementar para avaliação morfofuncional da célula espermática, sendo importante para o metabolismo espermático e, consequentemente, para o sucesso da fertilização (JEYENDRAN et al., 1984). O uso do teste hiposmótico têm sido descrito em diversas espécies, principalmente em humanos. É baseado no comportamento do espermatozóide frente a um meio hiposmótico. Na tentativa de equilibrar os meios extra e intracelular, ocorre um influxo de água através da membrana, provocando um edema. Com o edema, a cauda enrola-se e esta alteração é facilmente vista em microscópio de contraste de fase. A capacidade da cauda espermática em enrolar-se, devido ao edema provocado pela solução hiposmótica, é um sinal que o transporte de água através da membrana está ocorrendo normalmente, e que a mesma está íntegra e funcional. Acredita-se que a membrana da cabeça tenha o mesmo comportamento que a da cauda, porém estas alterações não são observadas (JEYENDRAN et al., 1984). A capacitação e a fusão entre os gametas estão positivamente correlacionadas aos resultados do teste hiposmótico; assim, estes processos não ocorreriam se a membrana da cabeça não estivesse íntegra. A avaliação da funcionalidade da membrana pode ser usada como um indicador da capacidade de fertilizar do espermatozóide (JEYENDRAN et al., 1984), o que no estudo apresentado indicaria sêmen com capacidade fertilizante. A sensibilidade do teste hiposmótico tem gerado grande discussão em virtude da sua correlação ou não com a motilidade espermática; isto porque a motilidade dos espermatozóides não é dependente somente do transporte de elementos pela membrana, mas de inúmeros fatores bioquímicos (MOHANACHANDRAN NAIR et al., 1998). Contudo, estudos têm demonstrado a correlação do teste hiposmótico com a reação do acrossomo (JEYENDRAN et al., 1984), fertilidade in vitro (JEYENDRAN et al., 1984) e in vivo (REVELL & MRODE, 1994), podendo aumentar, de forma significativa, a previsão da capacidade de fertilização do sêmen (FRASER, 1984).

33 A coloração com eosina é utilizada para determinar os espermatozóides vivos e mortos e pode estar associada ou não à nigrosina. Quando associada à nigrosina, o fundo da lâmina cora-se em preto, aumentando o contraste e facilitando a visibilização (BJOÈRNDAHL et al., 2003). Esta coloração é bem conhecida e amplamente usada em diferentes espécies (BLOM, 1950; ELIASSON; TREICHL, 1971; DOTT; FOSTER, 1972; MORTIMER et al., 1990). Quando as duas técnicas são comparadas, a eosina (ELIASSON; TREICHL, 1971) apresenta resultados da somatória entre a motilidade espermática e a porcentagem de espermatozóides mortos, abaixo de 100%, o que não é o esperado. Segundo a literatura, tal fato não foi elucidado (BJOÈRNDAHL et al., 2003), e, provavelmente, ocorra devido a uma superestimação da motilidade ou da porcentagem de espermatozóides vivos. Claramente pode ser observado tal fato neste estudo, no qual a motilidade espermática diminuiu de acordo com o tempo de refrigeração, contudo a porcentagem de espermatozóides corados pela eosina (mortos) se manteve-se, praticamente, inalterada. Segundo Walles e White (1963) e England (1993), as altas taxas de diluição causam um decréscimo significativo na motilidade do sêmen de cães. Neste estudo, o sêmen foi diluído, em média a 150x10 6 /ml, ou seja, a diluição não foi excessiva e permitiu a manutenção da motilidade, pois segundo Mann (1964), a diluição excessiva leva à perda da motilidade, da atividade metabólica e capacidade fertilizante da célula espermática. De acordo com Pinto et al. (1999) não há diferença significativa na taxa de gestação e tamanho da ninhada entre cadelas inseminadas com sêmen fresco (94%, média tamanho da ninhada = 7,2) e as inseminadas com sêmen refrigerado por 24 horas (90%, média tamanho da ninhada = 7,2) ou 48 horas (100%, média tamanho da ninhada = 7,0). A motilidade espermática média no estudo de Pinto et al. (1999) foi de 49,6 a 51,6% com 48 horas de refrigeração. Estes autores também utilizaram o meio Kenney e nossos resultados foram semelhantes, com os quais poderíamos concluir que o sêmen manteve a viabilidade por até 48 horas de refrigeração e poderia ser utilizado para a inseminação artificial.

34 De acordo com Tsutsui et al. (2003), o sêmen pode ser estocado a 4ºC e utilizado para IA por até dois dias, sem a utilização de meio diluente, o que está de acordo com os resultados deste estudos, sendo que o sêmen, diluído em plasma seminal, manteve a motilidade próxima a 50% com 48 horas de refrigeração. Nos estudos de Tsutsui et al. (2003), o sêmen foi mantido em refrigerador com temperatura controlada, por até 6 dias, com alta motilidade (60,7%). Porém, cinco cadelas foram inseminadas e nenhuma tornou-se gestante. Contrariamente, o sêmen refrigerado por dois dias manteve uma alta motilidade e fertilidade, sendo a taxa de concepção de 70%. Este estudo de Tsuitsui comprova que, embora o sêmen possa ser refrigerado por longos períodos, para a manutenção da motilidade, é necessário um refrigerador com temperatura controlada e constante, podendo haver contudo, o comprometimento da fertilidade. Mota-Filho et al. (2007) estudaram a refrigeração do sêmen em caixas térmicas de poliestireno, utilizando leite desnatado, gema de ovo e antibióticos. O sêmen foi avaliado durante 30 horas e a motilidade, neste período, variou entre 55% e 63,8%, para as respectivas caixas de 3l e 5l. A temperatura interna foi mais estável na caixa de 5l, sendo próxima a 5ºC, durante as 30 horas de refrigeração. Embora, neste estudo os parâmetros não tenham sido avaliados com 30 horas de refrigeração, os resultados são semelhantes aos de Mota-Filho et al.(2007). Apesar de serem caixas térmicas diferentes, a manutenção da temperatura foi semelhante a da Botutainer, que mantém a temperatura estável por um tempo superior a 30 horas (35 horas). No estudo, o sêmen foi avaliado até as 48 horas de refrigeração e a motilidade média foi superior (65,8%) aos resultados de Mota-Filho et al. (2007). Estudos de Nagao et al, 2007 com ejaculados três cães rerodutores e epidídimos de três cães submetidos a orquiectomia utilizando o diluente Botu-Sêmen, mantidos em containers Botu- Box e Botutainer de transporte de sêmen por 10 e 18 horas respectivamente e posteriormente por 72 horas em geladeira a 4ºC, não encontraram diferença significativa nos valores espermáticos resultantes nos dois containers, em relação aos espermatozóides obtidos do epidídimo, houve uma queda significativa da

35 qualidade logo após a refrigeração, ou seja, o meio utilizado no estudo não promoveu proteção suficiente ao estresse térmico da refrigeração.

36 CONCLUSÃO A caixa Botutainer pode ser utilizada comercialmente para o envio do sêmen canino refrigerado, por meios de transporte convencionais, pois mantém a viabilidade espermática por até 48 horas.

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