EFEITO DO PROCESSO DE DESCONGELAÇÃO SOBRE A VIABILIDADE DO SÊMEN CANINO IN VITRO

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1 Ciência Animal 1998,8(2):75-80 EFEITO DO PROCESSO DE DESCONGELAÇÃO SOBRE A VIABILIDADE DO SÊMEN CANINO IN VITRO (Effect of the thawing on the viability of canine semen in vitro) Alexandre Rodrigues SILVA 1, Rita de Cássia Soares CARDOSO 1 & Lúcia Daniel Machado da SILVA* Universidade Estadual do Ceará/FAVET 1 Bolsista IC/FUNCAP RESUMO De maneira análoga ao processo de congelação, existem vários protocolos preconizando diferentes temperaturas e velocidades de descongelação para o sêmen. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito de duas temperaturas de descongelação sobre os parâmetros microscópicos do sêmen canino. Foram utilizados cinco cães pastores alemães, cujo sêmen foi coletado semanalmente pela manipulação digital, tendo a fração espermática sido avaliada quanto à sua motilidade, vigor e porcentagem de alterações morfológicas. Em seguida, foi feita a diluição em tris, acrescido de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol, seguindo-se a congelação em palhetas de 0,5 ml. O sêmen foi descongelado após duas semanas, testando-se dois protocolos de descongelação: 37 o C / 1 minuto (T1) ou 50 C / 30 segundos, seguido de estabilização a 37 C / 1 minuto (T2). Ambos os tratamentos de descongelação (T1 e T2) proporcionaram viabilidade in vitro ao sêmen canino. No entanto, foram observadas diferenças estatísticas quanto às alterações morfológicas totais e secundárias nos espermatozóides após o processo, qualificando o primeiro tratamento, a 37 C, como causador de menos danos espermáticos que a temperatura de 50 C. A partir dos resultados obtidos, sugere-se o método de descongelação a 37 o C (T1) para o protocolo de congelação adotado, visto que este preserva mais eficazmente a qualidade do sêmen canino. PALAVRAS-CHAVE: descongelação, sêmen, canino, tris. ABSTRACT In a manner analogous to that of cryopreservation, there also exist many methods for the thawing of canine semen. The aim of this study was to evaluate the effect of two different temperatures on the thawing process on microscopic parameters of canine semen. The semen from five German Shepherd dogs was collected weekly by digital manipulation, and the spermatic fraction evaluated for motility, strengh and percentage of morphological alterations. The semen was then diluted in Tris, plus 20% egg yolk and 6% glycerol; and frozen in 0.5 ml straws. After two weeks, the semen was thawed at two temperatures; 37 o C / 1 minute (T1) and 50 o C / 30 seconds, followed by 37 o C / 1 minute (T2). Both treatments preserved the viability of canine semen, the two protocols were observed. The 50 o C temperature (T2) caused more damage to the canine spermatozoa then the 37 o C temperature (T1). Thus the treatment of 37 o C/1 minute, on canine semen thawing, is indicated for this particular for cryopreservation protocol. KEY WORDS: thawing, canine, semen, tris *Autor para correspondência: Av. Paranjana, 1700, Fortaleza, Ceará 75

2 76 INTRODUÇÃO Buscando um melhoramento genético das raças caninas, o homem tem encontrado na tecnologia de sêmen e na inseminação artificial (IA) uma solução para preservar e difundir o patrimônio genético de grandes reprodutores. Aliado a isto, as pesquisas em conservação de sêmen têm servido como alternativa para a preservação do patrimônio genético de canídeos ameaçados de extinção, como o lobo guará brasileiro (Chrysocyon brachyurus) e a raposinha do campo (Pseudalopex sp.). Comparativamente a outras espécies, como a suína, bovina e ovina, o espermatozóide (sptz) canino é bem mais resistente ao choque térmico (WATSON & PLUMMER, 1985). No entanto, os processos de congelação e descongelação geralmente causam um grande dano ao sptz (ENGLAND & PONZIO, 1996), o qual reflete-se principalmente em uma baixa termorresistência, demonstrada a partir de um decréscimo na motilidade espermática pósdescongelação, o que, segundo JOSHUA apud SANTOS (1997) é um importante parâmetro na avaliação do sucesso da criopreservação do sêmen de cães. FARSTAD (1996) afirma que uma congelação rápida, exige uma forma de descongelação igualmente rápida, visando a manutenção da osmolaridade, ph e equilíbrio iônico das amostras de sêmen, possibilitando a rehidratação e prevenindo o dano celular originário do crioprocessamento. De maneira análoga ao processo de congelação espermática, existem vários protocolos preconizando diferentes temperaturas e velocidades de descongelação para o sêmen canino (RODRIGUES, 1997). Usualmente, este processo é realizado sob imersão em banho-maria a temperaturas que variam de 37 o C (LINDE-FORSBERG, 1991) a 75 o C (OLAR et al., 1988). OLAR et al. (1988) descongelaram sêmen canino de forma lenta, a 1 o C por 120 segundos (s); de forma moderada, a 35 o C por 30s; e de forma rápida, a 75 o C por 12s, obtendo-se bons resultados com os três processos, mas observando uma tendência à melhor eficácia do processo rápido. DOBRINSKY et al. (1993) sugerem a descongelação moderada a 37 o C por 120s, mas SILVA & VERSTEGEN (1995) recomendam o uso do processo rápido a 50 o C por 30s. BADINAND et al. (1993) descongelaram amostras de sêmen a 37 o C por 45 segundos e consideraram este método moderado mais seguro, pois o tempo de permanência em temperaturas altas é sempre crítico e de influência letal sobre a viabilidade dos sptz. Porém, IVANOVA-KICHEVA et al. (1995) compararam os processos de descongelação a 37 o C por 8s e 55 o C por 5s e observaram que a motilidade espermática era melhor preservada a 55 o C e sugeriram que a elevação da temperatura de descongelação reduz o dano osmótico das células, além de prevenir a formação de cristais. Devido às controvérsias existentes na literatura, faz-se necessário um estudo constante das técnicas de descongelação, visando aumentar os índices de concepção em cadelas inseminadas artificialmente com sêmen criopreservado. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de dois processos de descongelação, sobre a viabilidade in vitro do sêmen canino. MATERIAL E MÉTODO Local e Período de Execução A pesquisa realizou-se no Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução, localizado nas dependências do Curso de Mestrado em Produção e Reprodução de Pequenos Ruminantes da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, no período de Maio de 1997 a Fevereiro de Animais Foram utilizados cinco cães machos da raça pastor alemão com idade média de 4,5 anos, pertencentes ao canil da Polícia Militar do Ceará. Os animais eram alimentados uma vez ao dia com ração peletizada comercial e recebiam água à vontade. Coleta e Avaliação do Sêmen Semanalmente, o sêmen de dois ou três cães foi coletado pela técnica de manipulação

3 digital (CHRISTIANSEN, 1984), separando-se o sêmen em suas três frações, e retendo-se a fração espermática para fins de análise e posterior congelação. Em seguida, avaliou-se o ejaculado segundo seus parâmetros macroscópicos de aspecto geral, volume, cor e viscosidade. Quanto aos parâmetros microscópicos, foram analisados a porcentagem de sptz móveis (motilidade) e o vigor espermático, dado em escala de 0 a 5 (HERMAN & SWANSON, 1941), através de um microscópio óptico com aumento de 100x. A porcentagem de alterações morfológicas era detectada pela análise microscópica (400x) de esfregaço de sêmen corado em hematoxilinaeosina, e classificadas em primárias, quando relacionadas a problemas de origem testicular na produção espermática; ou secundárias, quando relacionadas a problemas causados durante o processamento do sêmen, ou durante a maturação espermática no epidídimo (PLATZ & SEAGER, 1977). A concentração espermática, ou seja, o número de sptz em milhões por ml de sêmen, foi determinada com o auxílio de um espectrofotômetro (CARDOSO et al., 1997). Diluição Foi utilizado o diluidor mais amplamente difundido entre os pesquisadores que trabalham com preservação de sêmen canino. Tal diluidor consiste em um meio à base de tris-frutose-ácido cítrico, acrescido de 20% de gema de ovo e 6% de glicerol (RODRIGUES, 1997; SILVA et al., 1997). A diluição foi feita na proporção de uma porção de sêmen para uma porção de diluente. Congelação As frações espermáticas dos ejaculados coletados em um mesmo dia foram misturadas para a formação de um pool de esperma, o qual foi submetido ao método descrito por NUNES (1988), para a congelação de sêmen. A diluição 1:1 foi realizada a 37 o C, seguida de resfriamento durante 1 hora, até que a amostra de sêmen atingisse 4 o C, quando era feita a glicerolização e o envase em palhetas de 0,5 ml, as quais eram lacradas com álcool polivinílico. Finalmente, procedeu-se a congelação propriamente dita, em vapor de nitrogênio a -60 o C por cinco minutos. As palhetas foram conservadas em botijão criobiológico a -196 o C por pelo menos uma semana, quando foram descongeladas. Foram feitas cinco repetições por tratamento de descongelação, onde em cada tratamento congelaram-se pelo menos duas palhetas. Descongelação Foram testados dois diferentes processos de descongelação: o tratamento 1 consistiu em um processo moderado. Uma palheta do botijão foi levada ao banho-maria a 37 o C durante um minuto, a uma velocidade média de descongelamento (Vmd) de 3,9 o C/s;o tratamento 2, consistiu em um processo rápido. Levou-se outra palheta do mesmo lote a um banho-maria a 50 o C durante 30 segundos, a uma Vmd de 8,2 o C/ s, sendo em seguida mantida a 37 o C por um minuto a fim de que o sêmen se estabilizasse a esta temperatura. Em ambos os tratamentos, o sêmen descongelado dentro da palheta era posteriormente colocado em um tubo graduado e fazia-se nova avaliação microscópica. Análise estatística As características macroscópicas do sêmen foram avaliadas subjetivamente, com exceção do volume da fração espermática (2 a ) que, juntamente com as caractecrísticas microscópicas, foram avaliadas pela estatística descritiva, para a determinação de média e desvio padrão (dp). A análise de variância (ANOVA) comparou os dois tratamentos de descongelação testados, seguindo-se do teste de Student, a 5% de probabilidade (P < 0,05). RESULTADOS Os parâmetros fisiológicos macroscópicos do sêmen utilizado no experimento estão relacionados na Tab

4 Tabela 1: Parâmetros macroscópicos do sêmen dos cães utilizados Parâmetros macroscópicos Aspecto Coloração da Fração Espermática Esbranquiçada Coloração das Frações Pré-espermática e Transparente Prostática Viscosidade da Fração Espermática Leitoso Viscosidade das Frações Pré-espermática e Aquoso Prostática Tabela 2: Espermograma dos cães utilizados no experimento Parâmetros avaliados Média ± DP Volume da Fração espermática (ml) 2,80 ± 0,99 Concentração Espermática (nº sptz x 10 6 /ml) 447,0 0 ± 252,7 2 Motilidade (%) 95,56 ± 5,39 Vigor (0-5) 4,78 ± 0,40 Alterações Morfológicas Totais (%) 14,11 ± 0,57 Alterações Morfol. Primárias 0,77 ± 0,83 Alterações Morfol. Secundárias (%) 14,62 ± 7,57 A Tab. 2 mostra os parâmetros microscópicos do sêmen dos cães utilizados no experimento. Os resultados da avaliação microscópica do sêmen após os tratamentos de descongelação são demonstrados a seguir, na Tab. 3. As alterações secundárias presentes no sêmen canino descongelado, consistiam de cabeças soltas (sptz sem cauda); caudas quebradas, fortemente ou levemente enroladas; e, em menor número, peças intermediárias flexionadas, bem como a presença de gotas protoplasmáticas proximais e distais. DISCUSSÃO Todos os parâmetros fisiológicos do sêmen fresco avaliado estavam dentro da normalidade para a espécie canina, conforme descrito por CHRISTHIANSEN (1984). Dessa forma, o sêmen fresco estava apto a ser utilizado no experimento. A motilidade espermática de 43% alcançada com a descongelação a 37 o C no primeiro tratamento (T1), foi numericamente superior à motilidade de 35,46% obtida por RODRIGUES (1997), utilizando a mesma temperatura e o mesmo protocolo de diluição. SILVA & VERSTEGEN (1995) obtiveram uma motilidade espermática superior Tabela 3: Avaliação do sêmen canino pós descongelação (média ± DP) Parâmetros (%) Tratamento 1 Tratamento 2 Motilidade 43,00 ± 17,88 38,00 ± 19,23 Vigor 2,40 ± 0,89 1,60 ± 0,54 Alterações Morfológicas 13,00 ± 3,50 a 29,00 ± 9,90 b Alterações Primárias 0,50 ± 1,00 1,60 ± 2,00 Alterações secundárias 12,50 ± 1,00 a 27,40 ± 9,47 b Letras diferentes na mesma linha implicam diferença significativa (p? 0,05) 78

5 a 65% com o uso do mesmo diluidor e metodologia de descongelação a 50 o C por 30s, no entanto os autores utilizaram uma outra técnica de congelação, o que poderia explicar a diferença entre seus resultados e os obtidos com o segundo tratamento (T2), ou seja, apenas 38%. Comparando a motilidade espermática encontrada após ambos os tratamentos de descongelação testados, não foram observadas diferenças estatísticas, estando tal parâmetro dentro da faixa aceitável para a realização de inseminações artificiais, levando-se em consideração os dados de CONCANNON & BATTISTA (1989), que sugerem, para a espécie canina, a motilidade pós-descongelação acima de 50% como ideal e, acima de 30% como aceitável, devido à possibilidade de capacitação espermática no trato genital da cadela. Foram observadas diferenças estatísticas quanto aos parâmetros de alterações morfológicas totais e secundárias, tais diferenças evidenciaram uma melhor eficácia da descongelação a 37ºC na preservação da qualidade espermática, visto que na temperatura de 50ºC havia uma prevalência das referidas alterações. A maioria das alterações morfológicas secundárias observadas referiam-se a problemas causados durante o processamento do sêmen. Dessa forma, como a única diferença em todo o experimento foram os tratamentos de descongelação, é sugestivo afirmar que o aumento de tais alterações foi induzido pela elevação da temperatura no descongelamento a 50ºC (T2). A partir dos resultados obtidos sugerese, para o protocolo de congelação de sêmen utilizado, o método de descongelação à temperatura de 37ºC durante 1 minuto, visto que este preservou mais eficazmente a qualidade do sêmen canino. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BADINAND, F., FONTBONNE, A. & PETIT, C L insemination artificielle dans l espece canine. In: Reproduction Canine, (ANAIS) Paris: Association pour l etude chez la reproduction animale, 2-6. CARDOSO, R. C. S., SILVA, A. R. & SILVA, L. D. M Relação entre o espectrofotômetro e a câmara de Neubauer na determinação da concentração espermática. VI Encontro de Iniciação Científica / II Semana Universitária da UECE (ANAIS), 1: 284. CHRISTIANSEN, I. J Reproduction in the dog and the cat. Bailliere Tindall, London, CONCANNON, P. W. & BATISTA, M Canine Semen freezing and artificial insemination. Current Vet. Therap. X, DOBRINSKY, I., LULA, I., BARTH, A. D. & POST, K Effects of four different extenders and three different freezing rates on post-thaw viability of dog semen. J. Reprod. Fertil., 47: ENGLAND, G. C. W. & PONZIO, P Comparison of the quality of frozen-thawed and cooled-rewarmed dog semen. Theriogenology, 46: FARSTAD, W Semen cryopreservation in dogs and foxes. Anim. Reprod. Sci., 42: HERMAN, H. A. & SWANSON, E. W Variations in dairy bull semen with respect to its use in artificial insemination. Univ. Mo. Agr. Exp. Sta. Bull., p.326. IVANOVA-KICHEVA, M. G., SUBEV, M. S., BABADOV, N. D., DACHEVA, D. P. & ROUSEVA, I. A Effect of thawing regimens on the morphofunctional stare of canine spermatozoa. Theriogenology, 44: LINDE-FORSBERG, C Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen. Vet. Clin. N. Am.: Small Anim. Pract., Philadelphia, 21: NUNES, J. F Água de coco na inseminação artificial. Cabras e Bodes, 19: OLAR, T. T., BOWEN, R. A & PICKET, B. W Influence of extender, cryopreservative and seminal processing procedure on post-thaw motility of canine spermatozoa frozen in straws. Theriogenology, 31: PLATZ, C. C. & SEAGER, S. W. J Successful pregnancies with concentrated frozen canine semen. Lab. Anim. Sci., 27: RODRIGUES, B. R Efeito do diluidor à base de albumina sérica bovina (BSA) sobre a viabilidade in vitro do sêmen canino criopreservado.porto Alegre. Faculdade de Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 177 p.(dissertação de Mestrado). 79

6 SILVA, A. R., CARDOSO, R. C. S., SOUZA, D. M. B. & SILVA, L. D. M Comparação entre os diluentes à base de água de coco e à base de Tris na criopreservação do sêmen canino. Ciênc. Anim., 7:121. SILVA, L. D. M. & VERSTEGEN, J. P Comparisons between three different extenders for canine intrauterine insemination with frozenthawed spermatozoa. Theriogenology, 44: WATSON, P. F. & PLUMMER, J. M The response of boar sperm membranes to cold chock and cooling. In: International Conference on deep freezing boar semen, Proceedings, 1 :