CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN CANINO: REVISÃO. Alexandre Rodrigues SILVA, Rita de Cássia Soares CARDOSO & Lúcia Daniel Machado da SILVA RESUMO ABSTRACT

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1 Ciência Animal, 11(2): , 2001 CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN CANINO: REVISÃO (Canine semen cryopreservation: review) Alexandre Rodrigues SILVA, Rita de Cássia Soares CARDOSO & Lúcia Daniel Machado da SILVA Laboratório de Reprodução de Carnívoros / Universidade Estadual do Ceará RESUMO Nos últimos anos, tem-se observado um crescente interesse em técnicas que possibilitem um maior aproveitamento do material genético oriundo de reprodutores caninos e, dentre estas, destaca-se a criopreservação de sêmen. Nesse contexto, o presente trabalho apresenta uma revisão sobre diversos aspectos ligados a essa biotécnica, tais como um breve histórico, protetores de resfriamento, crioprotetores, diluidores, metodologias de congelação, processos de descongelação, conseqüências do processamento sobre o espermatozóide e avaliação do sucesso da criopreservação. Assim, essa revisão poderá servir como fonte de consulta para futuras pesquisas na reprodução canina. PALAVRAS-CHAVE: cão, sêmen, criopreservação, reprodução. ABSTRACT In the last years, a growing interest has been observing in techniques that facilitate a larger use of the genetic material originating from canine reproducers and, from that, semen cryopreservation can be highlight. So, this work presents a revision on several aspects tied up to that biotechnique, such as a brief historic, cooling protectors, cryoprotectors, extenders, freezing methodologies, thaw processes, procedure consequences on the sperm and evaluation of the cryopreservation success. Thus, that revision can be used as consultation source for future researches in canine reproduction. KEY WORDS: dog, semen, cryopreservation, reproduction. INTRODUÇÃO Nos últimos anos, tem-se observado um crescente interesse em técnicas que possibilitem um maior aproveitamento do material genético oriundo de reprodutores de diferentes espécies. Com o crescimento da cinofilia, o intercâmbio entre os criadores profissionais de cães (Canis familiaris) em todo o mundo tem favorecido uma maior cobrança quanto ao aperfeiçoamento de biotecnologias que otimizem o potencial reprodutivo nesta espécie. Dentre as diferentes biotécnicas reprodutivas, tem-se *Autor para correspondência legio2000@yahoo.com destacado a criopreservação de sêmen que possibilita um melhor aproveitamento de ejaculados oriundos de um mesmo reprodutor, bem como facilita a propagação deste material genético para diferentes regiões do planeta, mesmo após a morte do animal. A utilização do sêmen canino congelado tem a vantagem de possibilitar a manutenção da capacidade fecundante em animais de alto interesse zootécnico por um espaço indeterminado de tempo, além de resguardálos do estresse causado pelo transporte para fins de acasalamento. Particularmente para os criadores radicados em países com leis restritas de quarentena, a possibilidade de um acesso ao material genético criopreservado oriundo dos melhores cães do mundo abriu uma excelente perspectiva na história da criação 119

2 desta espécie (LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1989). Além disso, os testes de congelação de gametas e a posterior fertilização in vitro ou in vivo em cães servem como base para as pesquisas relacionadas à indústria de curtume européia, a qual é proprietária de fazendas onde se criam outros canídeos, como a Raposa Azul (Alopex lagopogus) e a Raposa Prateada (Vulpes vulpes), visando a preservação e multiplicação do material genético de animais portadores de genes mutantes de alto valor comercial (FARSTAD, 1996). Sob este ponto de vista, as pesquisas em tecnologia do sêmen canino abrem a perspectiva de serem adaptadas à preservação de espécies canídeas ameaçadas de extinção, como o Lobo Vermelho (Canis rufus), o Lobo da Etiópia (Canis simensis), o Cão de Caça Africano (Licaon pictus) e, principalmente, espécies brasileiras, como o Lobo Guará (Chrysocyon brachyurus), a Raposinha do Campo (Pseudalopex sp.) e o Cachorro Vinagre (Speothos venaticus),. Nesse contexto, o presente trabalho propõese a apresentar uma revisão bibliográfica sobre os principais aspectos ligados à congelação do sêmen de cães, visando fornecer um embasamento científico que sirva como consulta para futuras pesquisas nessa área. Histórico da criopreservação do sêmen canino Embora o espermatozóide do cão tenha sido descrito em 1679 por Leewenhoeck (OETTLLÉ, 1986), apenas em 1780 foram realizadas importantes investigações sobre o material fecundante nesta espécie através dos estudos de Spallanzani que conseguiu sêmen de um animal através de masturbação e injetouo no genital de uma fêmea em cio, obtendo o nascimento de três crias vivas e normais (SOUZA, 1985). Em 1803, esse mesmo pesquisador observou que uma redução na temperatura diminuía reversivelmente a atividade metabólica do espermatozóide, possibilitando assim a sua armazenagem (ENGLAND, 1993). Com a descoberta acidental da ação crioprotetora do glicerol por POLGE et al. (1949), iniciou-se uma era de extenso desenvolvimento de metodologias de criopreservação de células espermáticas em diversas espécies, com o primeiro sucesso na congelação do sêmen canino notificado por Rowson em No ano de 1969, SEAGER obteve a primeira gestação canina, utilizando o sêmen criopreservado diluído em lactose acrescida de 4% de glicerol e 20% de gema de ovo, o qual apresentou motilidade espermática entre 40 e 50% após a descongelação e possibilitou o nascimento de dois filhotes após inseminação intravaginal (ENGLAND, 1993). Os primeiros experimentos para a preservação do sêmen canino por diferentes períodos iniciaram-se com uma adaptação empírica de diluidores usados para o resfriamento e congelação do sêmen bovino utilizando-se tampões à base de leite desnatado (MARTIN, 1963), citrato (HARROP, 1962), cloreto de fosfato (WALES & WHITE, 1963), lactose (SEAGER, 1969), Tris (GILL et al., 1970) e Trisfrutose-citrato (FOOTE, 1964; ANDERSEN 1975). Entretanto, a gestação, na maioria das notificações científicas da atualidade (ROTA et al., 1999; LINDE- FORSBERG et al., 1999; TSUTSUI et al., 2000), tem sido alcançada utilizando-se modificações na metodologia de congelação, preconizando-se o uso do diluidor Tris-gema-glicerol (DAVIS et al., 1963). Protetores de resfriamento A adição de protetores de resfriamento é necessária para proteger os espermatozóides durante os processos de resfriamento, bem como durante a congelação e a descongelação (FARSTAD, 1996). A gema de ovo de galinha é o componente de origem biológica mais largamente utilizado na composição dos diluidores para o sêmen de cães (ENGLAND, 1993). Ela contém lecitina (fosfatidilcolina), a qual acredita-se proteger a membrana por restaurar os fosfolipídios perdidos durante o choque térmico (WATSON & PLUMMER, 1985; HAMMERSTEDT et al., 1990). Componentes específicos da gema de ovo foram identificados por serem responsáveis pela preservação do espermatozóide ovino e bovino durante sua estocagem em baixa temperatura. Durante o choque térmico, os fosfolipídios interagem com a estrutura lipídica da membrana plasmática das células espermáticas e proporcionam a proteção da mesma. As lipoproteínas ligam-se à membrana da célula espermática e ajudam a preservar a integridade celular durante o armazenamento (BOUCHARD et al., 1990). Para a preservação do sêmen canino, uma variedade de concentrações de gema de ovo tem sido utilizada. Visto que a mesma também tem uma 120

3 capacidade de tampão, sua quantidade no meio varia de acordo com a capacidade tamponante dos outros componentes do diluidor (FARSTAD, 1996). Nesse contexto, a maioria dos autores tem utilizado concentrações de gema em torno de 20% no diluidor (ANDERSEN, 1972; FARSTAD & ANDERSEN- BERG, 1989; LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1989; SILVA et al., 2000). MOURA (2000) comparou as gemas de ovo de galinha e codorna como protetores de resfriamento na congelação do sêmen de cães e observou não existirem diferenças entre as mesmas quanto à conservação da motilidade, vigor e morfologia espermática após a descongelação. Assim, é sugestivo que a gema de ovo de codorna, que é bastante rica em ácido ascórbico e outras vitaminas, possa também ser utilizada na congelação do sêmen canino Entretanto, sendo a gema de ovo de origem biológica, esta apresenta uma possibilidade de transmissão de doenças. Por isto, diversas pesquisas visando sua substituição por outros lipídios sintéticos e purificados vêm sendo conduzidas. Interessantes substitutos são os análogos do hidroxitolueno-butilado (BHT), os quais têm mostrado proteger a membrana plasmática da injúria do choque térmico (FARSTAD, 1996). SILVA et al. (2001) observaram que o sêmen de cães pode também ser congelado na ausência da gema de ovo, uma vez que esses autores utilizaram um diluidor composto por Tris e glicerol e verificaram uma motilidade espermática em torno de 35% após a descongelação. Agentes crioprotetores Para obter-se sucesso com a criopreservação de sêmen, faz-se necessária a adição de substâncias denominadas crioprotetores, cuja presença é capaz de melhorar a sobrevivência celular após os processos de congelação e descongelação. Os agentes crioprotetores pertencem a dois grupos: 1) aqueles que penetram nas células, como o glicerol, o dimetilsulfóxido (DMSO) e o metanol; 2) aqueles que permanecem no meio extracelular, como as proteínas, os açúcares e o polivinilpirrolidona (ENGLAND, 1993). O glicerol (CH 3 H 8 O 3 ), um álcool polihídrico altamente permeável, é o crioprotetor mais empregado na congelação de sêmen nas diferentes espécies (RODRIGUES, 1997). OLAR et al. (1989) compararam o glicerol com o dimetil sulfóxido (DMSO) na criopreservação do sêmen de cães, sendo este último menos eficiente na preservação da motilidade espermática. Da mesma forma, KIM & KIM (1995) observaram que a motilidade e a viabilidade espermáticas caninas após descongelação foram melhores preservadas utilizando-se o glicerol do que no uso do DMSO. McLAUGHIN et al. (1992), CURRY (2000) e HOLT (2000) reportaram que o glicerol exerce efeitos tóxicos sobre os espermatozóides, como alterações físico-químicas que podem levar à ruptura da membrana plasmática, à remoção de importantes proteínas membranárias, ou ainda originar danos acrossomais que irão se refletir em uma redução da fertilidade. Além disso, FARSTAD (1996) afirmou que o glicerol altera a osmolaridade do diluidor, sendo que a osmolaridade ótima para os espermatozóides caninos parece estar em torno dos 300mOsm/L. Segundo ENGLAND (1993), a concentração ideal de glicerol no diluidor representa um equilíbrio entre seus efeitos tóxicos e protetores, ressaltando-se que altas concentrações podem também afetar a capacidade fertilizante do espermatozóide. Para WATSON (1979), tal concentração ideal pode ser influenciada por outros componentes do diluidor, pelo padrão de resfriamento e pelos métodos de congelação e descongelação. No entanto, os principais fatores determinantes seriam ainda as características seminais de cada espécie. Tal qual em outras espécies, a ausência de glicerol durante a criopreservação do sêmen canino resulta em uma significativa redução na sobrevivência após a descongelação. OLAR et al. (1989) verificaram que a motilidade estimada do espermatozóide após a descongelação em diferentes diluidores, na ausência de glicerol, fica em torno de 11%. Enquanto na presença de 6% de glicerol, pode-se obter até 70% de espermatozóides móveis após a descongelação (STRÖM et al., 1997). Vários pesquisadores sugerem o uso de concentrações de glicerol entre 2 e 16% para a criopreservação do sêmen canino, dependendo da composição do diluidor utilizado. RAVASZOVA et al. (1996) testaram o efeito de 4, 6 e 8% de glicerol no diluidor à base de Tris e observaram que as concentrações de 4 e 6 % de glicerol são as mais 121

4 apropriadas para tal processamento, havendo uma melhor eficiência da concentração de 6% de glicerol em preservar a motilidade e o vigor espermático. O efeito da temperatura e a forma de adição de glicerol têm sido também investigados em estudos de criopreservação do sêmen canino. Os agentes crioprotetores penetrantes, particularmente o glicerol, protegem a célula da crioinjúria durante a fase de cristalização que ocorre entre -6 o e -10 o C. Dessa forma, não parece ser lógico adicionar o glicerol à temperatura de +30 o C (COLAS, 1975). ANDERSEN (1975) notificou a adição de um diluidor glicerolizado ao sêmen a 37 o C. Já PEÑA et al. (1998) não encontraram diferenças entre a adição de glicerol ao sêmen a 37 ou a 4 C. Além disso, FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen canino após a descongelação entre a adição do glicerol de uma única vez em relação à adição fracionada, tanto à temperatura ambiente (25 o C) quanto a 5 C. Quando o sêmen é congelado muito rapidamente, a formação de cristais de gelo intracelulares constitui um fator letal, enquanto que a congelação muito lenta resulta no efeito solução com conseqüente queda na viabilidade espermática (WATSON, 1995). A curva de congelação que representa a variação da sobrevivência celular após a descongelação em função do padrão de congelação é, usualmente, sigmóide, e seu platô varia em duração dependendo do método de congelação (ENGLAND, 1993). Além do mais, pode ser que o espermatozóide canino possa sobreviver a uma variação de concentrações de glicerol e padrões de congelação, os quais poderiam estar inseridos no platô da curva, fazendo com que seja difícil identificar os níveis ideais de glicerol e padrão de congelação dentro da variação tolerada. Isso poderia explicar a grande divergência de opiniões quando concentrações de glicerol muito baixas (1,6 2%) ou muito altas (8 12%) são utilizadas (PEÑA et al., 1998). STRÖM et al. (1997) sugerem que o glicerol tem a capacidade de penetrar rapidamente no espermatozóide canino; com base em seu experimento, onde a sobrevivência espermática durante o teste de termorresistência foi similar quando esse crioprotetor foi adicionado ao sêmen uma hora ou imediatamente antes do envase e subseqüente congelação. Já MARTIN (1963) reportou que o glicerol deveria ser removido após a descongelação, visto que este poderia prejudicar a motilidade espermática. No entanto, devido a uma carência de estudos, esta hipótese não foi ainda confirmada. Segundo SANTOS et al. (2001), o etilenoglicol tem peso molecular menor que o glicerol e, conseqüentemente, pode atravessar a membrana plasmática com uma maior facilidade, penetrando e deixando a célula mais rapidamente. Esses autores compararam os efeitos do glicerol e do etileno-glicol na congelação do sêmen de cães e não constataram diferenças entre os mesmos, sugerindo que ambos os crioprotetores poderiam ser utilizados para esse propósito. Diluidores O sêmen apropriadamente diluído pode ser congelado por tempo indeterminado, permanecendo potencialmente fecundante quando reaquecido e utilizado em uma inseminação artificial. Desse modo, faz-se necessário o uso de um bom diluidor, o qual deve conter nutrientes como uma reserva de energia, servir como tampão ajustando as alterações do ph; promover uma pressão osmótica e concentração de eletrólitos dentro dos padrões fisiológicos; prevenir o crescimento de bactérias; proteger as células contra o choque térmico durante o processo de resfriamento e possuir crioprotetores que reduzam os danos às células espermáticas durante a congelação e posterior descongelação (CONCANNON & BATISTA, 1989). A maioria dos grupos de pesquisa da atualidade tem utilizado o tampão Tris-frutose original sem modificações, ou tem continuado a desenvolver esse tampão, por exemplo, pela substituição do monossacarídeo frutose pela glicose, a qual tem atividade nutricional e osmótica, ou ainda pelos dissacarídeos não penetrantes sacarose e lactose, os quais agem como crioprotetores extracelulares, além de proporcionarem um efeito osmótico favorável (FARSTAD, 1996). O Tris é um agente emulsificante usado em medicina para combater a acidose. É solúvel em água e comporta-se como uma base fraca. São ainda notórias sua capacidade na redução do índice de frutólise e sua contribuição na preservação da energia 122

5 espermática. Sua composição, em geral, corresponde a uma solução constituída por Tris-hidroximetilaminometano, ácido cítrico mono-hidratado e D- frutose, dissolvidos em água destilada (RODRIGUES, 1997; SILVA et al., 2000). Em 1972, ANDERSEN comparou o diluidor lactose-gema-glicerol com o Tris-gema-glicerol, porém não observou diferenças nos resultados de congelação de sêmen canino obtidos com os mesmos. Em recentes publicações, o tampão Tris tem-se mostrado superior a outros tampões, tanto para a estocagem a curto período do sêmen resfriado, como para a congelação do sêmen em palhetas (FARSTAD, 1996; SILVA et al., 2000). Uma variedade de companhias comerciais tem também desenvolvido seus próprios diluidores. Encontra-se disponível comercialmente o Triladyl (Minitub, Tiefenbach, Alemanha), composto por Tris como principal agente tamponante, ácido cítrico, frutose, glicerol, tylosina, gentamicina, espectinomicina e lincomicina (NOTHLING et al., 1995). SILVA & VERSTEGEN (1995) realizaram inseminações artificiais com sêmen congelado tanto em uma mistura dos tampões Tes/Tris, quanto com os diluidores comerciais Laiciphos 478 e Biociphos W482 (IMV, France), tendo sido este último especialmente desenvolvido para a congelação do sêmen na espécie canina. Esses autores obtiveram uma taxa de concepção de 60% com o Laiciphos e a mistura de Tes/Tris, enquanto que com o uso do Biociphos obtiveram 100% de concepção. Além disso, os autores verificaram que os espermatozóides diluídos e congelados em Biociphos exibiam motilidade e vigor espermático mais baixos que nos demais diluidores, provavelmente devido à alta viscosidade deste diluidor, o que não veio a interferir nas taxas de concepção. Um outro meio comercial bastante utilizado e que vem proporcionando excelentes resultados in vitro e in vivo é o diluidor CLONE produzido pelo Cryogenic Laboratories of New England, Inc. (GOVETTE et al., 1996; STRÖM et al., 1997). Entretanto, a grande desvantagem dos diluidores comerciais é que sua exata composição não é divulgada. Recentemente, no Brasil, foi descrito o uso de um diluidor para a congelação do sêmen de cães à base de água de coco, a qual é uma solução estéril, ligeiramente ácida, rica em proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento e pobre em fosfolipídios. Para uma perfeita compatibilidade dessa substância com o sêmen canino, faz-se necessário o preparo de uma solução base contendo em média 50% de água de coco, 25% de água destilada e 25% de citrato de sódio a 5%, com a osmolaridade corrigida para mosm/l e o ph para 6,2 6,6. Após a descongelação do sêmen de cães, o diluidor à base de água de coco proporcionou motilidade e vigor espermático em torno de 50% e 3,0, respectivamente (CARDOSO et al., 2000). Metodologias de congelação Diversas metodologias têm sido descritas para a congelação do sêmen de cães e variam de acordo com o diluidor, protetores de resfriamento e agentes crioprotetores empregados, preconizando o uso de diferentes velocidades de congelação. Dentre os diversos métodos existentes, o mais usual é o descrito por ANDERSEN (1975). Neste método, foi realizada a diluição do sêmen na proporção de 1:4 com Tris-frutose-ácido cítrico, contendo 8% de glicerol e 20% de gema de ovo. Em seguida, procedeu-se o período de equilíbrio a 5 o C por três horas, o envase em palhetas de 0,5 ml e a congelação através da exposição aos vapores de nitrogênio, seguindo-se o acondicionamento em botijão criobiológico. Atualmente, essa metodologia tem servido como base para inúmeros trabalhos, os quais têm realizado pequenas modificações na mesma e alcançado excelentes resultados in vitro, tendo sido verificada motilidade espermática após a descongelação em torno de 70% (STRÖM et al., 1997), bem como excelentes taxas de concepção após inseminações artificiais (ANDERSEN, 1975, FERGUSON et al., 1989). O método CLONE é um método comercial desenvolvido pelo Cryogenic Laboratories of New England, Inc. (CLONE) e tem sido utilizado desde Ele consiste na diluição do sêmen à temperatura ambiente em um diluidor denominado CLONE A, submetendo-se, em seguida, o sêmen diluído a um período de equilíbrio por uma hora a 4 o C. Faz-se uma segunda diluição com o diluidor CLONE B e o envase em palhetas de 0,5 ml, as quais são congeladas através 123

6 da exposição vagarosa aos vapores de nitrogênio. Esse método tem também proporcionado motilidade pósdescongelação em torno de 70% (STRÖM et al., 1997) e taxas de concepção em torno de 86,4% após inseminação (GOVETTE et al., 1996). SILVA et al. (2000) congelaram o sêmen de cães com diluidores a base de Tris e água de coco, ambos submetidos a uma modificação da metodologia descrita por NUNES et al. (1997) para a congelação do sêmen de caprinos com o diluidor a base de água de coco. Esse método consistiu em uma primeira diluição do sêmen a 37 o C, seguida de um período de equilíbrio por 40 minutos a 15 C em caixa térmica e mais 30 min no banho-maria em um refrigerador a 4 o C. Adicionou-se então o diluidor glicerolizado, fez-se o envase e a exposição das palhetas aos vapores de nitrogênio e procedeu-se o acondicionamento do sêmen em botijão criobiológico a 196 o C. Esses autores verificaram que o diluidor a base de Tris possibilitou uma melhor conservação do vigor e da morfologia espermática do que a água de coco após a descongelação do sêmen canino. Dentre os diversos métodos existentes, um ponto básico de suma importância é o período de equilíbrio. Entretanto, OLAR (1984) verificou não existirem diferenças entre amostras de sêmen resfriadas e equilibradas por uma, duas ou até três horas. Uma diversidade de pesquisadores tem investigado diferentes meios para a congelação do sêmen na forma de pastilhas (BATTISTA et al., 1988) ou em palhetas com diferentes volumes de sêmen (BATTISTA et al., 1988; OLAR et al., 1989). Segundo BATTISTA et al.(1988), diluidores contendo Tris usados para a congelação de sêmen em palhetas de 0,5 ml conferem uma melhor taxa de motilidade espermática que o diluidor lactose não tamponado na forma de pastilha. IVANOVA-KICHEVA et al. (1997) demonstraram que espermatozóides caninos criopreservados em tubos de alumínio de 5 ml com os diluidores Tris-frutose, Tris-glicose e lactose apresentam melhor qualidade do que aqueles criopreservados em pastilhas. As curvas de congelação podem ser essencialmente diferentes para a congelação em pastilhas e palhetas, e o uso do mesmo padrão de descongelação, quando comparando os dois métodos de envase, poderia complicar a interpretação dos resultados. A congelação em palhetas tem a vantagem sobre as pastilhas em facilitar a identificação do doador de sêmen e reduzir a possibilidade de contaminação, a qual torna-se importante com o movimento de sêmen congelado entre os países (FARSTAD, 1996). Processos de descongelação De maneira análoga ao processo de congelação espermática, existem vários protocolos preconizando diferentes temperaturas e velocidades de descongelação para o sêmen canino. Usualmente, este processo é realizado sob imersão em banho-maria a temperaturas que variam de 37 o C (LINDE- FORSBERG, 1991) a 75 o C (OLAR et al., 1988). OLAR et al. (1988) descongelaram sêmen canino de forma lenta, a 1 o C por 120s; de forma moderada, a 35 o C por 30s; e de forma rápida, a 75 o C por 12s, obtendo bons resultados com os três processos, mas observando uma tendência à melhor eficácia do processo rápido. KIM & KIM (1995) sugerem não existir diferenças quanto a motilidade e viabilidade no sêmen canino descongelado a 5 o C por 30 minutos, 37 o C por 30s ou 75 o C por 10s. DOBRINSKY et al. (1993) sugerem a descongelação moderada a 37 o C por 120s, mas SILVA & VERSTEGEN (1995) recomendam o uso do processo rápido a 50 o C por 30s. SILVA et al. (1998) compararam o processo de descongelação a 37 o C por 1 min com o processo a 50 o C por 30s e observaram que o primeiro procedimento permite uma melhor conservação da morfologia espermática. BADINAND et al. (1993) descongelaram amostras de sêmen a 37 o C por 45 segundos e consideraram esse método mais seguro, pois o tempo de permanência em temperaturas altas é sempre crítico e de influência letal sobre a viabilidade dos espermatozóides. Porém, IVANOVA-KICHEVA et al. (1995), comparando os processos de descongelação a 37 o C por 8s e 55 o C por 5s, observaram que a motilidade espermática foi melhor preservada a 55 o C e sugeriram que a elevação da temperatura de descongelação reduz o dano osmótico das células, além de prevenir a formação de cristais. Conseqüências do processamento sobre o espermatozóide O dano espermático causado pelo 124

7 resfriamento da temperatura fisiológica abaixo do ponto de congelação é denominado choque térmico (FARSTAD, 1996). A habilidade espermática em resistir à queda de temperatura difere entre as espécies. Os espermatozóides do eqüino, felino, canino e humano são pouco sensíveis ao choque térmico, enquanto que os do caprino, bovino e ovino têm média sensibilidade e os do suíno são extremamente sensíveis (WATSON & PLUMMER, 1985; BWANGA, 1991). A estabilidade da membrana e a resistência ao choque térmico parecem estar relacionadas ao componente fosfolipídico da membrana (BOUCHARD et al., 1990). Alterações irreversíveis na membrana espermática, oriundas dos processos de resfriamento, congelação e descongelação, são caracterizadas por distúrbios na estrutura de bi-camada proteíno-lipídica, como um decréscimo na fluidez e aumento na permeabilidade da membrana, danos acrossômicos, desidratação, liberação de enzimas e fosfolipídios, redução da atividade metabólica e diminuição no consumo de ATP. Tais alterações podem comprometer parcial ou totalmente a fertilidade do espermatozóide (FARSTAD, 1996). A diluição, resfriamento, congelação e descongelação da célula espermática canina são processos que provocam mudanças na estrutura da bicamada e na função da membrana plasmática. Além disso, o glicerol tem um efeito direto sobre cada zona da membrana, bem como sobre a suspensão celular nos compartimentos aquosos. Quando uma membrana biológica é resfriada, ocorre possivelmente uma reorganização dos componentes membranários e alguns lipídios que normalmente encontram-se adjacentes às proteínas da membrana poderiam agregar-se, deixando as proteínas livres para ligarem-se a novas substâncias (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 1993). O resultado mais evidente dessas mudanças é a redução na motilidade espermática, que é a característica mais freqüentemente avaliada para determinar-se o sucesso do processo de criopreservação (ENGLAND, 1993). ENGLAND & PONZIO (1996) relataram que nas amostras de sêmen descongeladas existe uma marcada deterioração na qualidade espermática, a qual é indicada por uma redução da motilidade espermática, da porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais e do tempo de sobrevivência espermática, bem como por um aumento na osmolaridade, se comparados com o ejaculado original. Quanto ao aumento na osmolaridade, RODRIGUES-GIL & RIGAU (1996) observaram que as células espermáticas caninas e suínas não se alteram ou se alteram fracamente em meios hiperosmóticos inferiores a 900 mosm/l, enquanto que meios hipoosmóticos podem reduzir sensivelmente a viabilidade espermática. Na célula espermática canina, o choque hiposmótico induz um progressivo desprendimento de acrossomas, cuja membrana é uma estrutura muito lábil que pode ser alterada por processos tais como o resfriamento, a congelação, a descongelação, e a expansão para inseminação. Por esta razão, para obterse sucesso com a criopreservação de soluções celulares, deve-se permitir a manutenção da osmolaridade, bem como do ph e do potencial iônico, além de proporcionar uma fonte energética e prevenir a crioinjúria (ENGLAND, 1993). Segundo FARSTAD (1996), uma preservação bem sucedida de espermatozóides pelo resfriamento, congelação e descongelação é dependente de uma série de fatores, como a qualidade da amostra de sêmen, adição de diluidores, padrão de diluição, tipo de tampão, protetores de resfriamento empregados, tempo de equilíbrio, padrão de congelação e descongelação. A interação desses fatores objetiva a redução do dano celular, assegurando uma sobrevivência espermática adequada in vitro e in vivo. Avaliação do sucesso da criopreservação Embora a relação entre a motilidade e a capacidade fecundante do espermatozóide canino não está totalmente elucidada, atualmente, a maioria dos pesquisadores ainda a utilizam como o principal parâmetro para a avaliação de diluidores, crioprotetores e técnicas de criopreservação de sêmen canino (IVANOVA-KICHEVA et al., 1997). Segundo CONCANNON & BATTISTA (1989), a faixa ideal de motilidade espermática após descongelação do sêmen canino, para a realização de inseminação artificial, é quando esta se apresenta superior a 50%. No entanto, é ainda aceitável sua realização quando a amostra de sêmen exibe entre 30 e 50% de espermatozóides móveis. 125

8 OETTLÉ (1986) observou a ocorrência de alterações na morfologia acrossômica durante o processo de congelação e verificou que tais mudanças não pareciam estar correlacionadas com a motilidade espermática em cães. Ademais, MORTON & BRUCE (1989) sugeriram que anormalidades morfológicas na peça intermediária e na cauda do espermatozóide poderiam reduzir sua motilidade após descongelação. STRÖM et al. (1997) relataram que apesar da avaliação da motilidade espermática ser o teste in vitro mais comumente realizado, outros testes como a avaliação da integridade da membrana plasmática, integridade e morfologia acrossômica e a habilidade do espermatozóide em ligar-se à zona pelúcida de oócitos podem também ser utilizados. Além disso, reportam que o teste de termorresistência (TTR) tem sido mostrado como um teste clínico seguro para predizer o potencial fertilizante do sêmen humano e que, tal qual na espécie suína, poderia dar uma melhor indicação da capacidade fertilizante do espermatozóide canino do que a simples estimação da motilidade espermática imediatamente após a descongelação. O TTR consiste na observação da longevidade espermática in vitro, através de repetidos exames da motilidade em diversos tempos após a descongelação e durante incubação em temperatura uterina, mimetizando parcialmente uma situação in vivo (PEÑA et al., 1998). Utilizando a microscopia eletrônica, RODRIGUES-MARTINEZ et al. (1993) observaram que o espermatozóide descongelado apresentava um alto grau de danos acrossômicos, incluindo perda do conteúdo. Porém, eles verificaram que o plasmalema aparentemente permanecia intacto na maioria dos casos. Esses autores sugeriram que tal fato poderia ser a razão para a baixa porcentagem de anormalidades acrossômicas normalmente notificadas quando se utilizava a microscopia de contraste de fase. Segundo LARSSON & RODRIGUES- MARTINEZ (2000), testes de penetração e ligação à zona pelúcida, bem como testes de incubação do sêmen em hemi-zona (HZT), podem ser utilizados para avaliar o efeito dos diferentes métodos de tratamento espermático, tais como o resfriamento e a congelação, sobre a habilidade fertilizante do espermatozóide canino. HAY et al. (1997) sugerem que as amostras de sêmen que retêm a motilidade após a descongelação também retêm o movimento progressivo, indicando que se elas sobreviverem a congelação serão capazes de progredir. Além disso, esses autores verificaram que baixa motilidade e aumento nos danos acrossômicos nas células espermáticas caninas após a descongelação estão correlacionadas com penetração reduzida em oócitos homólogos. Apesar de inúmeros testes in vitro, a forma mais segura de avaliar-se o sucesso da criopreservação de sêmen é através dos resultados obtidos após inseminação artificial (IA) com o sêmen descongelado. Segundo os dados da literatura, as taxas de concepção observadas após IA com sêmen congelado são sensivelmente inferiores às obtidas após IA com sêmen fresco (LINDE- FORSBERG & FORSBERG, 1989). Esse fato devese, provavelmente, à viabilidade e fecundidade reduzida dos espermatozóides descongelados. Isso pode ser decorrente do processo de congelação e descongelação, da qualidade do sêmen após congelação, dos tipos de meios utilizados, dentre outros fatores. De fato, segundo CONCANNON & BATTISTA (1989) e FONTBONNE & BADINAND (1993b), a viabilidade do espermatozóide após descongelação pode variar de 12 a 24 h. É geralmente aceito que a IA intravaginal com sêmen congelado resultaria em baixas taxas de concepção na espécie canina (ANDERSEN, 1972; LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1989), enquanto que a IA intrauterina com sêmen congelado culminaria com melhores resultados (FARSTAD, 1984). No entanto, essa afirmação está baseada unicamente na análise de alguns dados clínicos não controlados, observando-se que a problemática está ligada não somente ao sêmen canino e às suas características após descongelação mas, também, às dificuldades ainda encontradas concernentes à determinação do momento ideal para IA nessa espécie de fisiologia particular. FONTBONNE & BADINAND (1993a) inseminaram 57 cadelas de raças variadas com sêmen congelado diluído em Tris-gema com 6,4% de glicerol e obtiveram taxas de concepção de 52,7% utilizando a IA intravaginal e 73,6% com a IA intrauterina. Enquanto FARSTAD & ANDERSEN-BERG (1989), ao inseminarem 36 cadelas por via intrauterina, obtiveram 67% de gestação. KIM et al. (1994) inseminaram sete cadelas com sêmen descongelado submetido ao metanol como crioprotetor e obtiveram três cadelas gestantes, com uma taxa de concepção de (42,8%). TSUTSUI et al. (2000) realizaram inseminação via intrauterina com sêmen congelado suplementado com pasta Orvus ES em dez cadelas e obtiveram uma taxa de concepção de 71%. NOTHLING & VOLKMANN (1993) verificaram que a adição do líquido prostático autólogo, 126

9 previamente congelado a -18 o C, ao sêmen canino descongelado, promove taxas de concepção (100%) maiores do que quando da não utilização desse fluido (60%). Entretanto, maiores estudos são necessários para determinar se a melhoria na fertilidade foi causada por constituintes químicos do líquido prostático ou por um efeito físico, como um aumento no volume ou um decréscimo na viscosidade do sêmen. Considerações finais Atualmente, presencia-se em todo o mundo um imenso desenvolvimento de biotecnologias aplicadas à reprodução dos carnívoros domésticos. O interesse recente de companhias comerciais, aliado aos recursos humanos aperfeiçoados nas universidades, possibilita hoje a implantação de bancos de sêmen canino congelado em diversos países. Esses bancos de sêmen mantêm, constantemente, um material genético de alto valor, o qual pode ser utilizado por populações isoladas geograficamente a fim de evitar um excessivo cruzamento consangüíneo, além da eliminação de doenças sexualmente transmissíveis. Desse modo, entende-se que a criopreservação de sêmen de cães é apenas o começo de uma nova era para a reprodução e otimização do material genético de canídeos domésticos e selvagens. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Dr. Arlindo Alencar Araripe Moura (Dept. de Zootecnia/UFC e ao Dr. Ricardo Toniolli (Dept. de Medicina Veterinária/ UECE) pelos valorosos comentários nessa revisão de literatura. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDERSEN, K. Insemination with frozen dog semen based on a new insemination technique. Zuchtygiene, v. 10, p.1-4, ANDERSEN, K. Fertility of frozen dog semen. Acta Veterinaria Scandinavae, v. 13, p , BADINAND, F.; FONTBONNE, A.; PETIT, C. L insemination artificielle dans l espece canine. In: REPRODUCTION CANINE, 1993, Paris, Proceedings Paris: Association pour l etude chez la reproduction animale, 1993, p BATTISTA, M.; PARKS, J.; CONCANNON, P. Canine sperm post-thaw survival following freezing in straws or pellets using pipes, lactose, tris or test extenders. In: XI INTERNATIONAL CONGRESS ANIMAL REPRODUCTION ARTIFICAL INSEMINATION 1988, Proceedings 1988, v. 3, p.229, BOUCHARD, G. F.; MORRIS, J. K.; SIKES, J. D.; YOUNGQUIST, R. S. Effect of storage temperature, cooling rates and two different semen extenders on canine spermatozoa motility, Theriogenology, v.34, p , BWANGA, C. O. Cryopreservation of boar semen. Acta VeterinAry Scandinaviae, v. 32, p , CARDOSO, R. C. S.; SILVA, A. R.; UCHOA, D. C.; SILVA, L. D. M. Congelação do sêmen canino com um diluidor base de água de coco acrescido de gema de ovo e glicerol. Ciência Animal,Fortaleza, v. 10, p , COLAS, G. Effect of initial freezing temperature, addition of glycerol and dilution on the survival and fertilizing ability of deep frozen ram semen. Journal of Reproduction and Fertility, v. 42, p , CONCANNON, P.W.; BATTISTA, M. Canine semen freezing and artificial insemination. In: KIRK R.W. (ed), Current Veterinary Therapy X: Small Animal Practice. Philadelphia: WB Saunders Company, p CURRY, M. R. Cryopreservation of semen from domestic livestock. Rev. Reprod. v. 5, p , DAVIS, I. S.; BRATTON, R.W., FOOTE, R. H. Livability of bovine spermatozoa at 50, -25 and -85ºC in Tris-buffered and citrate buffered yolk-glycerol extenders. Journal of Dairy Science, v. 46, p , DOBRINSKY, I.; LULA, I.; BARTH, A. D.; POST, K. Effects of four different extenders and three different freezing rates on post-thaw viability of dog semen. Journal of Reproduction and Fertility, v.47, p , ENGLAND, G. C. W.; PONZIO, P. Comparision of the quality of frozen-thawed and cooled-rewarmed dog semen. Theriogenology, v. 46, p , ENGLAND, G. C. W. Cryopreservation of dog semen: a review. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47, p , FARSTAD, W. Bitch fertility after natural mating and after artificial insemination with fresh or frozen semen. Journal of Small Animal Practice, v. 25, p , FARSTAD, W. Semen cryopreservation in dogs and foxes. Animal Reproduction Science, v. 42, p , FARSTAD, W.; ANDERSEN-BERG, K. Factors influencing the success rate of artificial insemination with frozen semen in the dog. Journal of 127

10 Reproduction and Fertility, v. 39, p , FERGUSON, J. M.; RENTON, J. P.; FARSTAD, W.; DOUGLAS, T. A. Insemination of beagle bitches with frozen semen. Journal of Reproduction and Fertility, v. 39, p , FONTBONNE, A.; BADINAND, F. Canine artificial insemination with frozen semen: comparison of intravaginal and intrauterine deposition of semen. Journal of Reproduction and Fertility., v. 47, p , 1993a. FONTBONNE, A.; BADINAND, F. Studies on freezing dog spermatozoa: effect of glycerol on motility after thawing. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47, p , 1993b. FOOTE, R. H. Extenders for freezing dog semen. American Journal of Veterinary Research, v. 25, p.37-40, GILL, H. P.; KANFRAN, C. F.; FOOTE, R. F.; KIRK, R. W. Artificial insemination of beagle bitches with freshly collected, liquid stored and frozen-stored semen. American Journal of Veterinary Research., v. 31, p , GOVETTE, G.; LINDE-FORSBERG, C.; STRÖM, B. A successful concept for freezing of dog semen. In: 13 TH INTERNATIONAL CONGRESS FOR ANIMAL REPRODUCTION Proceedings v. 2, p.5-8. HAMMERSTEDT, R. H.; GRAHAM, J. K.; NOLAN, J. P. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. Journal of Andrology, v. 11, p.73-88, HARROP, A. E. Artificial insemination in the dog. In: MAULE, P.T. (ed) The Semen of Animals and Artificial Insemination. Farnham Royal, UK: Commonwealth Agricultural Bureau. 1962, p HAY, M. A.; KING, W. A.; GARTLEY, C. J.; LEIBO, S. P.; GOODROWE, K. L. Canine spermatozoa Cryopreservation and evaluation of gamete interaction. Theriogenology, v. 48, p , HOLT, W. V. Fundamental aspects of sperm cryobiology: the importance of species and individual differences. Theriogenology, v. 53, p , IVANOVA-KICHEVA, M. G.; SUBEV, M. S.; BOBADOV, N. D.; DACHEVA, D. P.; ROUSEVA, I. A. Effect of thawing regimens on the morphofunctional stare of canine spermatozoa, Theriogenology, v. 44, p , IVANOVA-KICHEVA, M. G.; BOBADOV, N. D.; SOMLEV, B. Cryopreservation of canine semen in pellets and in 5-mL aluminum tubes using three extenders. Theriogenology, v. 48, p , KIM, B.; KIM, Y. Studies on artificial insemination with canine semen frozen using methanol and preserved in liquid nitrogen. Korean Journal of Veterinary Clinical Medicine, v. 12, p , KIM, Y.; PARK, Y.; KIM, B.;YU, I. Artificial insemination with frozen semen in the dog: simple freezing method using methanol. Korean Journal of Veterinary Research, v. 34, p , LARSSON, B.; RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H. Can we use in vitro fertilization to predict semen fertility? Animal Reproduction Science, v , p , LINDE-FORSBERG, C. Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen. Veterinary Clinical North American: Small Animal Practice, v. 21, p , LINDE FORSBERG, C., FORSBERG, M. Fertility in dogs in relation to semen quality and the time and site of insemination with fresh and frozen semen. Journal of Reproduction and Fertility, v. 39, p , LINDE-FORSBERG, C.; STRÖM, H. B.; GOVETTE, G. Comparison of fertility data from vaginal vs intrauterine insemination of frozen-thawed dog semen: a retrospective study. Theriogenology, v.52, n.1, p.11-23, MARTIN, I. C. A. The deep freezing of dog spermatozoa in diluents containing skim milk. Research in Veterinary Science v. 4, p , McLAUGHIN, E. A.; FORD, W. C. L.; HULL, M. G. R. The contribution of the toxicity of a glycerol-egg-yolkcitrate cryopreservative to the decline in human sperm motility during cryopreservation. Journal of Reproduction and Fertility, v. 95, p , MORTON, D. B.; BRUCE, S. G. Semen evaluation, cryopreservation and factors relevant to the use of frozen semen in dogs. Journal of Reproduction and Fertility, v. 39, p , MOURA, C. S. Utilização de diferentes diluentes na criopreservação do sêmen de cão p. Monografia (Graduação em Medicina Veterinária) - Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco. NOTHLING, J. O.; VOLKMANN, D. H. Effect of addition of autologous prostatic fluid on the fertility of frozen-thawed dog semen after intravaginal insemination. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47, p , NOTHLING, J. O.; GERSTENBERG, C.; VOLKMANN, D. H. Success with intravaginal insemination of frozen-thawed dog semen a retrospective study. Journal of South African Veterinary Association, v. 66, p.49-55, NUNES, J. F.; CIRÍACO, A. L. T.; SUASSUNA, U. Produção e reprodução de caprinos e ovinos. 2nd. ed. Fortaleza: 1997, 199 p. 128

11 OETTLÉ, E. E. Changes in acrosome morphology during cooling and freezing of dog semen. Animal Reproduction Science, v. 12, p , OLAR, T.T. Cryopreservation of dog spermatozoa p. Dissertação (Mestrado em Veterinária) - Colorado University, Fort Collins. OLAR, T. T.; BOWEN, R. A.; PICKET, B. W. Influence of extender, cryopreservative and seminal processing procedure on post-thaw motility of canine spermatozoa frozen in straws, Theriogenology, v. 31, p , OLAR, T. T.; BOWEN, R. A.; PICKETT, B. W. Influence of extender, cryopreservative and seminal processing procedures on post-thaw motility of canine spermatozoa frozen in straws. Theriogenology, v. 31, p , PEÑA, A. I.; BARRIO, F.; QUINTELA, L. A., HERRADÓN, P. G. Effect of different glycerol treatments on frozen-thawed dog sperm longevity and acrosomal integrity. Theriogenology, v. 50, p , POLGE, C., SMITH, A. U., PARKERS, A. S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydratation at low temperature. Nature, v. 164, p RAVASZOVA, O.; MESAROS, P.; CINGAKOVA, V.; LUKACINOVA, M. A study of the properties of dog ejaculate during long-term storage. Folia Veterinaria, v. 40, p , RODRIGUES, B. A. Efeito do diluidor a base de albumina sérica bovina (BSA) sobre a viabilidade in vitro do sêmen canino criopreservado p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. RODRIGUES-GIL, J. E.; RIGAU, T. Effect of ouabain on the response to osmotic changes in dog and boar spermatozoa. Theriogenology, v. 45, p , RODRIGUES-MARTINEZ, H.; EKWALL, H.; LINDE- FORSBERG, C. Fine estructure and elemental composition of fresh and frozen dog spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47, p , ROTA, A.; IGUER-OUADA, M.; VERSTEGEN, J.; LINDE-FORSBERG, C. Fertility after vaginal or uterine deposition of dog semen frozen in a Tris extender with or without Equex STM paste. Theriogenology, v. 51, p , SANTOS, S. E. C., VANNUCHI, C. I., SATZINGER, S., VISINTIN, J. A. Comparação de dois crioprotetores na congelação do sêmen de cães. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 25, p , SILVA, A. R.; CARDOSO, R. C. S., SILVA, L. D. M. Efeito do processo de descongelação sobre a viabilidade do sêmen canino in vitro. Ciência Animal, Fortaleza, v. 8, p.75-80, SILVA, A. R.; CARDOSO, R. C. S.; SILVA, L. D. M. Congelação de sêmen canino com diferentes concentrações de gema de ovo e glicerol em diluidores a base de Tris e água de coco. Ciência Rural, v. 6, p , SILVA, A. R. Otimização de uma metodologia para a congelação do sêmen canino diluído em tampão Tris p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias)Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza. SILVA, L. D. M.; VERSTEGEN, J. P. Comparisons between three different extenders for canine intrauterine insemination with frozen-thawed spermatozoa. Theriogenology, v. 44, p , SOUZA, J. A. T. Estudo de algumas características do sêmen de cães da raça Pastor Alemão p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. STRÖM, B.; ROTA, A.; LINDE-FORSBERG, C. In vitro characteristics of canine spermatozoa subjected to two methods of cryopreservation. Theriogenology, v. 48, p , TSUTSUI, T.; HASE, M.; TANAKA, A.; FUJIMURA, N.; HORI, T.; KAWAKAMI, E. Intrauterine and intravaginal insemination with frozen canine semen using a extender consisting of Orvus ES paste-supplemented egg yolk Tris-frutose citrate. Journal of Veterinary Medicine Science, v. 62, p , WALES, R. G., WHITE, I. G. Viability of diluted dog spermatozoa in vitro. Jounal of Reproduction and Fertility, v. 5, p , WATSON, P. F. The preservation of semen in mammals. Oxford Review Reproduction and Biology v. 1, p , WATSON, P. F. Recent developments and concepts in the cryopreservation and the assessment of their post-thawing function. Reproduction and Fertility Development, v. 7, p , WATSON, P. F., PLUMMER, J. M. The response of boar sperm membranes to cold chock and cooling, In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON DEEP FREEZING OF BOAR SEMEN, 1, 1985, Uppsala. Proceedings Uppsala: Swedish Universty of Agriculture and Science, p Recebido para publicação em Aceito em