EFEITO DA DILUIÇÃO ESPERMÁTICA NA CONGELAÇÃO DE SÊMEN CANINO UTILIZANDO-SE A ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP 106) COMO DILUIDOR

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1 Ciência Animal, 15(2):75-82, 2005 EFEITO DA DILUIÇÃO ESPERMÁTICA NA CONGELAÇÃO DE SÊMEN CANINO UTILIZANDO-SE A ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP 106) COMO DILUIDOR (Effect of sperm dilution on canine semen freezing using powder coconut water (ACP 106) Rita de Cássia Soares CARDOSO*, Alexandre Rodrigues SILVA & Lúcia Daniel Machado da SILVA * Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/UECE; ** Pesquisador do CNPq RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da diluição seminal sobre a qualidade espermática após a descongelação de sêmen canino usando a água de coco em pó (ACP 106). Foram coletados doze ejaculados e o sêmen foi dividido em duas alíquotas, uma para diluição 1:1 e outra para a concentração de 200x10 6 espermatozóides/ml. O sêmen foi inicialmente diluído em ACP 106 contendo 20% de gema de ovo. Após a diluição, o sêmen foi submetido ao resfriamento por 40 minutos em caixa térmica (15 C) e 30 minutos em refrigerador (4 C). Posteriormente o ACP 106 acrescido de gema de ovo e glicerol (concentração final de 6%) foi adicionado ao sêmen. Os ejaculados foram congelados em vapores de nitrogênio líquido e armazenados a -196 C. Após uma semana, o sêmen foi descongelado a 37 C por 1 minuto e os parâmetros microscópicos foram avaliados. Não houve efeito do método de diluição sobre a motilidade e vigor. Após a descongelação as médias destes parâmetros foram 45,39 ± 13,91% e 3,08 ± 0,67 para o grupo diluído 1:1 e 55,0 ± 18,34% e 3,58 ± 0,47 para o grupo diluído a uma concentração de 200x10 6 espermatozóides/ml, respectivamente. Também não foi observado efeito dos métodos de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05) enquanto os defeitos de cauda foram os mais observados (P<0,05). O percentual de alterações morfológicas após a descongelação para os dois grupos foram 36,06% para a diluição 1:1 e 29,28% para a concentração fixa. Conclui-se que o ACP 106 é eficiente para a criopreservação de sêmen canino utilizando-se uma concentração espermática de 200 x 10 6 espermatozóides/ml ou a uma diluição constante (1:1) com o método de congelação e descongelação descrito neste trabalho. PALAVRAS-CHAVE: ACP, água de coco, sêmen, cão, congelação ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of sperm dilution using powder coconut water (ACP 106) extender on the post-thaw sperm quality. Twelve ejaculates were collected from six dogs. Semen was divided into 2 aliquots, one for dilution 1:1 and another for concentration of 200x10 6 spermatozoa/ml. Semen was initially extended with ACP 106 containing 20% egg yolk. After dilution, semen was submitted to cooling for 70 minutes. After this step, extender added by egg yolk and glycerol at a final concentration of 6% was added to semen. Ejaculates were frozen in nitrogen vapors and stored at -196 C. After one week, straws were thawed at 37 C for 1 minute and the microscopic criteria were evaluated. The method of sperm dilution had not a significant effect on post-thaw motility and vigor. After thawing, motility and vigor values were 55.0 ± 18.34% and 3.58 ± 0.47 for semen diluted 1:1 and ± 13.91% and 3.08 ± 0.67 for semen diluted at 200 x * Autor para correspondência: Av. Paranjana, Fortaleza, Ceará ritascardoso@bol.com.br Ciência Animal, 15(2):75-82,

2 10 6 spermatozoa/ml. The method of sperm dilution did nott affect sperm morphology either (P>0.05) and tail defects were the most observed (P<0.05). The percentage of post-thaw sperm abnormalities was 29.2 ± 9.04 % for dilution 1: ± 10.82% for dilution at 200x10 6 spermatozoa/ml. The ACP 106 is efficient for canine semen cryopreservation at a constant dilution rate (1:1) or at 200x10 6 spermatozoa/ml using the freezing/thawing processes described here. KEYWORDS: PCW, coconut water, sperm, dog, freezing INTRODUÇÃO Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas objetivando aperfeiçoar os protocolos já existentes para a congelação de sêmen canino através do uso de diferentes crioprotetores, processos de congelação/descongelação e uma variedade de diluidores como lactose, Pipes, Tes e Tris, que é o mais utilizado para a conservação de sêmen canino (ENGLAND, 1993). Vários pesquisadores tentaram desenvolver um bom diluidor, ou seja, que apresente as seguintes características: atoxicidade, isotonicidade, boa capacidade tamponante, bem como praticidade, baixo custo e eficiência (MIES FILHO, 1987; FONTBONNE, 1993). Recentemente, foi desenvolvida a água de coco em pó (ACP ) que já foi testada com sucesso em diferentes espécies tais como eqüinos (SAMPAIO NETO et al., 2002), caprinos (SALGUEIRO et al., 2002) e caninos (CARDOSO et al., 2004). O ACP foi desenvolvido devido à impossibilidade de armazenamento da água de coco e ainda objetivando a padronização e comercialização do referido diluidor, mesmo naquelas regiões onde o fruto não existe. Embora a água de coco em pó já tenha sido testada com sucesso para a congelação de sêmen canino, onde se obteve aproximadamente 60% de espermatozóides móveis após a descongelação (CARDOSO et al., 2004), ainda faz-se necessário o aperfeiçoamento deste protocolo de congelação. Vale ressaltar que, para a espécie canina, o diluidor recebe a denominação de ACP 106. Utilizando-se a solução à base de água de coco (50% água de coco in natura + 25% água destilada + 25% citrato de sódio a 5%), o sêmen canino é comumente congelado na proporção de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (1:1), não se levando em conta a concentração espermática (CARDOSO et al., 2003b, CARDOSO et al., 2004). Utilizando outros diluidores, o sêmen canino já foi congelado em diferentes concentrações espermáticas como 40 (OLAR et al., 1989), 44 (DOBRINSKI et al., 1993), 50 (ROTA et al., 1997a), 66 (FONTBONNE & BADINAND, 1993), 100 (THOMAS et al., 1993, WILSON, 1993, STRÖM et al., 1997), 150 (FARSTAD & ANDERSEN-BERG, 1989) e 200 x 10 6 espermatozóides/ml (SILVA & VERSTEGEN, 1995, SILVA et al., 1996). Contudo ainda há pouca informação sobre o efeito da concentração espermática sobre a qualidade do sêmen canino pós-descongelação. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ACP 106, comparando-se um método de diluição fixa (uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ou 1:1) com um método de concentração fixa (200 x10 6 espermatozóides/ml) na congelação de sêmen canino. MATERIAL E MÉTODOS Animais experimentais Foram utilizados seis cães: 1 American Sttafordshire Terrier, 2 Boxers, 1 Brazilian Mastiff, 1 Dobermann e 1 Rottweiler, com idade variando de 1 a 5 anos. Os animais pertenciam a canis particulares e foram mantidos em boxes individuais. Os cães foram alimentados com ração comercial e tinham livre acesso à água. Coleta e avaliação de sêmen Foram coletados dois ejaculados de cada cão através da técnica de manipulação digital (CHRISTIANSEN, 1986), utilizando-se tubos de vidro graduados acoplados a um funil e sendo 76 Ciência Animal, 15(2):75-82, 2005

3 coletado o sêmen na sua forma fracionada. Os parâmetros macroscópicos (cor e volume) foram avaliados no sêmen á fresco (fração espermática). A motilidade e o vigor (em escala de 0 a 5) foram avaliados no sêmen a fresco e após a diluição inicial, o resfriamento, a adição de glicerol e a descongelação, utilizando-se um microscópio óptico (x100). A morfologia espermática foi avaliada através da contagem de 200 células após coloração de um esfregaço com eosina-nigrosina. As células foram classificadas como normal ou apresentando alterações primárias ou secundárias. As alterações foram apresentadas de acordo com a sua localização (cabeça, peça intermediária e cauda). Esta avaliação também foi realizada através da microscopia óptica, em aumento de 1200x, no sêmen a fresco e congelado/descongelado. A concentração espermática foi mensurada através de contagem em câmara de Neubauer (CARDOSO et al., 2003a). Diluição do sêmen Para a congelação do sêmen, foi utilizada a água de coco em pó (ACP 106, ACP Produtos biotecnológicos, Fortaleza-Ceará, Brasil), a qual era composta por 1,2g de ACP em 5 ml de água ultra-pura autoclavada e 5 ml de solução de citrato de sódio a 1%. O diluidor continha 20% de gema de ovo e 6% de glicerol (concentração final no diluidor). Foram testadas duas taxas de diluição: uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (diluição) e outra a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (concentração). Após a mensuração da concentração espermática, o sêmen foi dividido em duas alíquotas. No primeiro grupo, foi utilizada a diluição de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor. Para o segundo grupo, foi calculado o volume total de diluidor necessário para uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml. O volume total de diluidor para cada protocolo foi dividido em duas partes (A e B). A parte A continha apenas o ACP acrescido de gema de ovo e a Parte B, similar a anterior, mas contendo 12% de glicerol. Após diluição inicial e a adição de glicerol, a concentração final de glicerol no diluidor foi de 6%. Processamento do sêmen Após a divisão do sêmen em duas alíquotas, uma para cada protocolo a ser testado, a diluição fixa (1:1) foi processada inicialmente na diluição de uma parte de sêmen para meia parte de diluidor. Para o grupo com concentração espermática, o sêmen foi diluído inicialmente com metade do volume de diluidor necessário para a concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml. Nesta etapa, foi utilizada somente a parte A do diluidor. Após esta diluição inicial com a parte A em temperatura ambiente (aproximadamente 27 C), as amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes colocados em um recipiente com água e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável (15 C) por 40 minutos. Após este período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até atingir 4 C (30 minutos) e a parte B foi dividida em três partes iguais e adicionada ao sêmen em três etapas, com intervalos de cinco minutos (CARDOSO et al., 2003b). O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25mL, e estas depois foram dispostas horizontalmente em rampa de congelação a uma altura de 5 cm do nível de nitrogênio líquido por cinco minutos e, finalmente, armazenadas em nitrogênio líquido (-196 C). Após uma semana, as amostras foram descongeladas em banhomaria (37 C) por um minuto e avaliadas microscopicamente (CARDOSO et al., 2003b). Foram obtidas vinte e quatro palhetas para cada método de diluição, correspondendo a duas palhetas por réplica (n=12). Análise estatística Com exceção da cor, os demais parâmetros foram expressos na forma de média e desvio padrão. Os dados de motilidade e alterações morfológicas foram transformados em arco seno. Para avaliar o efeito da diluição espermática sobre estes parâmetros, utilizou-se o teste T de Student e para o vigor utilizou-se o teste de Mann-Whitnney. Estes mesmos testes foram utilizados para avaliar o efeito das etapas Ciência Animal, 15(2):75-82,

4 do processo de congelação sobre os parâmetros avaliados (P<0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO O sêmen a fresco (n=12) apresentou coloração branca opalescente. As características físicas estão detalhadas na Tab. 1. Observa-se que as características físicas dos ejaculados frescos estão de acordo com os valores considerados normais para a espécie canina (JONHSTON et al., 2001). Foi observado um declínio significativo da motilidade e do vigor a partir do resfriamento (Tab. 2) até a descongelação para os dois grupos, com exceção do vigor para o grupo que utilizou a diluição 1:1, onde não se observou diferença entre as etapas de adição de glicerol e descongelação. CARDOSO et al. (2002) e SILVA et al. (2001) também observaram este declínio em ambos os parâmetros a partir do resfriamento e até a descongelação, utilizando diluidores à base de água de coco e Tris, respectivamente. Além disso, não houve efeito do método de diluição sobre a motilidade e vigor. Este resultado difere do encontrado por PEÑA & LINDE- FORSBERG (2000) que, testando a diluição em concentrações espermáticas de 50, 100, 200 e 400 x 10 6 espermatozóides/ml, observou efeito da concentração espermática, encontrando melhores resultados de motilidade progressiva imediatamente após a descongelação com 200 x 10 6 espermatozóides/ml. Neste trabalho somente foi testado uma diluição para uma concentração fixa de 200 x 10 6 espermatozóides/ml e uma outra diluição a uma relação constante de 1:1 (sêmen:diluidor), sem levar em conta a concentração espermática. Uma vez que a concentração espermática média dos ejaculados foi de 1,6 x 10 9 espermatozóides/ ml, para a diluição a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml foi necessário utilizar um grande volume de diluidor. De acordo com MANN (1964), o espermatozóide dos mamíferos responde à diluição excessiva exibindo perda de motilidade e aumento no número de espermatozóides mortos. Por outro lado, a diluição a uma taxa constante, não leva em consideração a concentração espermática, consequentemente havendo variação na quantidade de glicerol/célula. Como a concentração espermática média foi de 1,6 x 10 9 espermatozóides/ml, após a diluição (1:1), esta concentração foi de 800 x 10 6 espermatozóides/ ml. Entretanto, é importante lembrar que a concentração espermática variou de 530 a x 10 6 espermatozóides/ml. Então, após a diluição este parâmetro variou de 265 a x 10 6 Tabela 1. Média e desvio padrão das características físicas e morfológicas da fração espermática dos ejaculados caninos (n=12) 78 Ciência Animal, 15(2):75-82, 2005

5 Tabela 2. Média e desvio padrão da motilidade e vigor do sêmen canino congelado com um diluidor á base de água de coco em pó (ACP 106 ) em dois métodos diferentes de diluição. ACP CONCENT = ACP CONCENTRAÇÃO (concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml); ACP DILUIÇÃO (diluição constante de uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ). Letras minúsculas diferentes na mesma coluna implicam em diferença significativa. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha implicam em diferença significativa entre os tratamentos (P<0,05). espermatozóides/ml. Dessa forma, a diluição a uma taxa constante pode levar a uma grande variação de resultados, mas esta diluição foi escolhida, porque é comumente utilizada para a diluição não somente com a solução à base de água de coco (CARDOSO et al., 2003) como em outros diluidores (SILVA et al., 1998; 2003) para a congelação de sêmen canino. COLAS (1975) relata que obteve melhores resultados de fertilidade com sêmen ovino, quando este foi diluído a uma concentração constante de 900 x 10 6 espermatozóides/ml do que a uma taxa constante de 1:4. Isto sugere que o nível ótimo de glicerol no sêmen diluído pode estar relacionado a sua concentração final em relação ao espermatozóide (COLAS, 1975). Da mesma forma que para a motilidade e o vigor, não foi observado efeito do método de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05), sendo os grupos similares quanto às alterações de cabeça, peça intermediária e cauda e, ainda, quanto às alterações secundárias (Fig. 1 e 2) e totais. Para os dois métodos de diluição, os defeitos de cauda (Fig. 1) foram os mais observados (P<0,05). O percentual de alterações morfológicas após a descongelação para os dois grupos (36,06% vs 29,28%) é similar aos encontrados por CARDOSO et al. (2003) e SILVA et al. (2003) utilizando uma solução a base de água de coco e Tris, respectivamente. Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizada a coloração de eosina-nigrosina, que não se Figura 1. Percentual de alterações morfológicas do sêmen canino congelado em ACP 106 a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição. Ciência Animal, 15(2):75-82,

6 Figura 2. Percentual de alterações morfológicas primárias e secundárias do sêmen canino congelado em ACP 106 a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição. mostrou tão eficiente. Embora ela seja classificada como uma coloração vital, é difícil a avaliação do percentual de células vivas após a descongelação, visto que se observa uma população espermática que não se cora adequadamente, dificultando a interpretação, por isso este parâmetro não foi mensurado. Este fato já foi observado por PEÑA (2004), relatando que essa população de espermatozóides que não se cora adequadamente, poderia apresentar lesão de membrana, mas talvez ainda fosse viável. Além disso, como não há fixação no processo de coloração, observou-se que a vida útil da lâmina torna-se mais curta, podendo ocasionar defeitos aos espermatozóides (principalmente de cauda) que não existiam no momento da coloração. É importante ressaltar que só foi realizada a avaliação clássica da morfologia espermática, sendo importante a realização de outras avaliações como, por exemplo, a do status acrossomal. Há ainda pouca informação a respeito do efeito da concentração espermática sobre a congelação de sêmen canino. Estudos em outras espécies, especialmente a eqüina, sugerem que este fator pode influenciar sobre a sobrevivência espermática pós-descongelação (PEÑA & LINDE-FORSBERG, 2000). PALÁCIOS et al. (1992) relataram melhores resultados de motilidade pós-descongelação quando o espermatozóide eqüino foi congelado a uma concentração de 800 x 10 6 espermatozóides/ml do que a 100 x10 6 espermatozóides/ml. Usando o diluidor Tris para a congelação de sêmen canino a uma concentração de 50 x10 6 espermatozóides/ml, ROTA et al. (1997b) obtiveram resultados similares de motilidade após a descongelação (56,4%). Além disso, 56,5% dos espermatozóides mostraram uma membrana intacta. STRÖM et al. (1997) obtiveram uma melhor motilidade após a descongelação utilizando o diluidor Tris e o clone. Nesse experimento, o sêmen foi congelado a uma concentração de 100 x 10 6 espermatozóides/ml e foi observado aproximadamente 70% de espermatozóides móveis e 50% apresentando acrossoma normal. SILVA et al. (1996) utilizaram sêmen congelado a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml e obtiveram 60% de cadelas prenhes após inseminação intravaginal e intrauterina. É relatado que, para altas concentrações espermáticas (1000 x 10 6 espermatozoides/ml), a motilidade pós-descongelação foi melhor quando uma rápida taxa de resfriamento foi utilizada durante a congelação, ao passo que para baixas concentrações (200 x Ciência Animal, 15(2):75-82, 2005

7 espermatozóides/ml), a motilidade foi melhor quando se utilizou uma lenta taxa de resfriamento (PARLEVILET et al., 1992). Em nosso trabalho, foi utilizada uma taxa de resfriamento moderada, explicando-se talvez o fato dela ter sido eficiente para as duas diluições. Outros pesquisadores também utilizaram uma taxa similar a deste trabalho, mas em concentrações espermáticas diferentes como 100 x 10 6 (BUENO et al., 2001), 200 x 10 6 (EILTS, 2003) e para uma diluição de 1:2 (OLIVEIRA, 2003). Com base nos resultados, conclui-se que o ACP 106 foi capaz de preservar a motilidade, vigor e morfologia espermática pósdescongelação em índices aceitáveis para a realização de inseminação artificial, sendo efeiciente para a criopreservação de sêmen canino diluído a uma concentração espermática final de 200 x 10 6 espermatozóides/ml ou a uma diluição constante (1:1). Embora o método de diluição a uma taxa constante seja mais prático, a utilização de uma concentração fixa tem como vantagens a simplificação do cálculo do número de espermatozóides por palheta e o melhor aproveitamento do ejaculado. É importante ressaltar que o resultado deste trabalho é o primeiro passo para a padronização de um protocolo de congelação de sêmen canino com o diluidor ACP 106, facilitando a futura comercialização deste diluidor para a referida espécie. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Laboratório de Tecnologia de Sêmen caprino, em nome dos Doutores José Ferreira Nunes e Cristiane Clemente de Mello Salgueiro pela concessão da água de coco em pó (ACP 106), à Intervet pela água ultra-pura utilizada no preparo do diluidor. e ao Médico Veterinário M.Sc. Daniel Couto Uchoa (Canil Grande Canafístula) pela utilização dos animais para a coleta de sêmen. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BUENO, R.; COSTA, E. P.; GUIMARÃES, J. D.; VALENTIM, F. M. Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães. I. Efeito do meio diluidor. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 53, p , CARDOSO, R. C. S.; SILVA, A. R.; UCHOA, D. C.; SILVA, L. D. M. Efeito dos estágios do processo de congelação sobre a qualidade do sêmen canino diluído em solução à base de água de coco. Revista Brasileira de Reprodução, v. 26, p.26-31, CARDOSO, R. C. S.; SILVA, A. R.; SILVA, L. D. M. Determinação da concentração espermática no sêmen de cães Pastores Alemães através da espectrofotometria. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 27, p , 2003a. CARDOSO, R. C. S.; SILVA, A. R.; UCHOA, D. C.; SILVA, L. D. M. Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology, v. 59, p , 2003b. CARDOSO, R. C. S.; SILVA, A. R.; SILVA, L. D. M. Use of the alternative extender powder coconut water (PCW 106 ) for canine semen freezing. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CANINE AND FELINE REPRODUCTION, 5, 2004, São Paulo. Abstracts Book...São Paulo, 2004, p.96-97, Resumo. COLAS, G. Effect of initial freezing temperature, addtion of glycerol and dilution rate on the survival and fertilizing ability of deep-frozen ram semen, Journal of Reproduction and Fertility, v. 42, p , CHRISTIANSEN, I. J. Reprodução no cão e no gato. São Paulo:Manole,1988, 363p. DOBRINSKI, I.; LULAI, C.; BARTH, A.D.; POST, K. Effects of four different extenders and three different freezing rates on post-thaw viability of dog semen. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47 (suppl), p , EILTS, B. E. Theorical aspects of canine semen cryopreservation. Theriogenology, v. 64, p , ENGLAND, G. C. W. Cryopreservation of dog semen: a review. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47(suppl), p , FONTBONNE, A.; BADINAND, F. Canine artificial insemination with frozen dog semen: comparison of intravaginal and intrauterine deposition of semen. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47 (suppl), p , FONTBONNE, A. L insemination artificielle dans l espece canine. In: Reproduction canine, 1993, Paris. Anais...Paris, 1993, Association pour l étude de la reproduction animale, p. J6. JOHNSTON, S. D.; KUSTRITZ, M. V. R.; OLSON, Ciência Animal, 15(2):75-82,

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