EFEITO DA ADIÇÃO DE COLESTEROL AO MEIO DILUIDOR SOBRE A VIABILIDADE DO SÊMEN CANINO REFRIGERADO

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1 1 EFEITO DA ADIÇÃO DE COLESTEROL AO MEIO DILUIDOR SOBRE A VIABILIDADE DO SÊMEN CANINO REFRIGERADO FLAVIANE CRISTINE LANDÕES DE SOUZA 1, DANIELE CAMPOS DO NASCIMENTO 1, NICOLE FLÁVIO 1, KLEBER CUNHA PEIXOTO JUNIOR 1, ANDRÉ CRESPILHO 1,2,3*, 1 Universidade de Santo Amaro, UNISA, São Paulo, SP; Universidade Severino Sombra, USS, Vassouras, RJ; 3 Vetsemen, Análise de Sêmen para Inseminação Artificial, Barueri, SP. * contato@vetsemen.com.br A incorporação de colesterol ligado a ciclodextrina (CLC) tem se mostrado uma estratégia eficiente para aumentar a resistência dos espermatozoides de diferentes espécies às baixas temperaturas, viabilizando os programas de reprodução animal. Embora diversos trabalhos recentes tenham comprovado a aplicabilidade da incorporação de CLC para a refrigeração espermática, até o momento existem poucos relatos do uso dessa substância para a manutenção de espermatozoides caninos sob refrigeração. Este trabalho tem por objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações de CLC sobre a motilidade e viabilidade do sêmen canino refrigerado por 48 horas, testando-se a hipótese de que o colesterol pode melhorar a preservação do sêmen de cães estocado à 5ºC. Para o estudo foram colhidos ejaculados de cinco cães da raça Cocker Spaniel Inglês (n=3 ejaculados por cão). As amostras foram avaliadas subjetivamente quanto à motilidade total no ato da colheita e foram diluídas em água destilada (1:20) para avaliação da concentração espermática em câmara de 0331

2 2 Neubauer. Após a triagem inicial de qualidade, cada amostra foi dividida em três alíquotas iguais. A primeira alíquota foi diluída em meio Trisgema de ovo (20%) glicose, ajustando-se a concentração para 50x10 6 de espermatozoides por mililitro de meio (Controle, GC). A segunda e terceira alíquota foram diluídas no mesmo diluidor contendo, respectivamente, 1,5 mg (GRUPO 1, G1) e 3,0 mg (GRUPO 2, G2) de CLC ajustados para cada 120 milhões de espermatozoides, de acordo com Hartwig et al., (2014). As amostras dos 3 grupos foram analisadas nos momentos 0 horas (após 3,5 hrs de estabilização à 5 C), 24 e 48 horas de refrigeração em sistema Botutainer (Botupharma, Botucatu, Brasil) através da análise computadorizada do movimento espermático (CASA; ISAS, Valência, Espanha) e integridade de membrana plasmática em microscopia de fluorescência, através da combinação de sondas Diacetato de Carboxifluoresceína e Iodeto de Propídeo. Os dados gerados foram avaliados através de modelo linear geral (GLIMMIX, SAS Institute Inc, Cary, USA). Houve a queda significativa da motilidade total (MOT, %), motilidade progressiva (MP, %), integridade de membrana (IMP, %) e índice de espermatozoides rápidos e progressivos (RP, %) ao longo das 48 horas de refrigeração, independente do grupo experimental (p<0,05). Dentre as diferentes variáveis estudadas a MOT foi a que sofreu queda mais expressiva entre o momento 0 e 24 horas de processamento (78,3±11,0 a vs 67,8±17,9 b ; 77,8±10,4 a vs 66,2±17,7 b ; 77,5±11,1 a vs 68,5±15,5 b ; respectivamente para os grupos GC, G1 e G2; p<0,05). Não foram observadas diferenças para MOT, MP, RP quando comparados os 3 grupos experimentais dentro dos momentos 0, 24 e 48 hrs (p>0,05). No entanto, maior IMP foi associada aos grupos que receberam a 0332

3 3 suplementação com colesterol ao meio diluidor (p<0,05). A IMP foi de 59,55±17,71 a %, 69,36±7,74 b % 66,09±6,56 b % (p=0.0336) no momento 0 hrs; 56,09±13,92ª%, 63,09±8,18ª% e 64,09±8,24ª (p=0.0764) no momento 24 hrs; e 45,36±19,13ª%, 56,18±11,18ª b % e 58,59±8,26 b % (p=0.0299) no momento 48 hrs, respectivamente para o GC, G1 e G2. Conclui-se que a suplementação de CLC não melhorou a preservação dos parâmetros cinéticos de espermatozoides caninos ao longo das 48 hrs de refrigeração, resultados divergentes dos observados para outras espécies (CRESPILHO et al., 2013). No entanto, a incorporação do colesterol proporcionou melhor proteção à ultraestrutura da célula espermática durante o processo de refrigeração, resultando em maior integridade de membrana plasmática logo nas primeiras horas do processamento, e de forma independente à quantidade de CLC adicionado. Aparentemente quantidades maiores de colesterol (3,0mg de CLC para cada 120x10 6 espermatozoides) se fazem necessárias para a proteção eficiente da membrana celular quando o período de refrigeração do sêmen canino for igual ou superior a 48 hrs. Palavras-chave: Sêmen, cão, refrigeração, colesterol, viabilidade espermática. THE EFFECT OF CHOLESTEROL ADDITION ON DILUTER ON THE VIABILITY OF COOLED CANINE SEMEN The incorporation of cholesterol linked to cyclodextrin (CLC) has proven an effective strategy to increase the resistance of the sperm of different species to low temperatures, enabling the animal breeding programs. Although several recent studies have demonstrated the applicability of the merger of CLC to sperm cooling, so far there are few reports of the 0333

4 4 use of this substance for maintaining sperm canines under refrigeration. This study aims to evaluate the effect of different concentrations of CLC on the motility and viability of canine semen cooled for 48 hours, testing the hypothesis that cholesterol can improve the preservation of semen stored at 5 C dogs. For the study were collected ejaculates of five dogs Cocker Spaniel (n = 3 ejaculates per dog). The samples were subjectively evaluated for total motility at time of harvest and were diluted in distilled water (1:20) for evaluation of sperm concentration in chamber Neubauer. After initial screening quality, each sample was divided into three equal aliquots. The first aliquot was diluted in half Tris-egg yolk (20%) glucose, adjusting the concentration to 50x106 sperm per milliliter of medium (Control, GC). The second and third rate were diluted in the same diluent with, respectively, 1.5 mg (group 1, G1) and 3.0 mg (Group 2, G2) for each set CLC 120 million sperm, according Hartwig et al., (2014). Samples of the 3 groups were analyzed following moments: 0 hours (3.5 hrs after stabilization at 5 C), 24 and 48 hours Botutainer refrigeration system (Botupharma Botucatu, Brazil) using computerized analysis of sperm movement (CASA; ISAS, Valencia, Spain) and plasma membrane integrity by fluorescence microscopy, by combining carboxyfluorescein diacetate and propidium iodide probes. The data generated were analyzed by a general linear model (GLIMMIX, SAS Institute Inc, Cary, USA). There was a significant drop in total motility (MOT,%), progressive motility (MP%), membrane integrity (IMP%) and index of rapid and progressive sperm (RP%) over 48 hours of cooling, independent the experimental group (p <0.05). Among several factors studied the MOT was the one that suffered the most significant drop between the time 0 and 24 hours of processing (± 78.3 vs 67.8 ± 11,0a 17,9b; 77.8 ± 66 vs 10,4a, 2 ± 17,7b; vs 77.5 ± 11,1a 68,5 ± 15,5b; GC 0334

5 5 respectively for the groups G1 and G2, p <0.05). No differences were observed for MOT, MP, RP when comparing the 3 groups within moments 0, 24, 48 hrs (p> 0.05). However, higher it was combined with the groups that received supplementation with the middle thinner cholesterol (p <0.05). The IMP was 17,71a ± 59.55% 69.36% ± ± 7,74b 6,56b% (p = ) at time 0 hrs; ± 13,92ª%, 63.09% and ± 8,18ª ± 8,24ª (p = ) when 24 hrs; and ± 19,13ª%, 56.18% and ± 11,18ªb ± 8,26b% (p = ) at the 48 hrs, respectively, for the GC, G1 and G2. It was concluded that supplementation CLC not improved preservation of the kinetic parameters of canine spermatozoa over 48 hrs cooling, results differ from those observed for other species (Crespilho et al., 2013). However, cholesterol incorporation provided better protection to the ultrastructure of sperm cells during the cooling process, resulting in increased plasma membrane integrity in the first hour of processing, and independently of the amount of CLC added. Apparently major amounts of cholesterol (3.0mg CLC for each sperm 120x106) are necessary for efficient protection of the cell membrane when the cooling period canine semen is equal to or greater than 48 hrs. Keywords: Semen, dog, refrigeration, cholesterol, sperm viability. Referências: CRESPILHO A.M., et al. The Effect of Cholesterol Addition, Buffer, and ph on Equine Sperm Stored at 5 o C. Jounal of Equine Veterinary Science, v.33, p , HARTWIG F.P., et al. Use of cholesterol-loaded cyclodextrin: an alternative for bad cooler stallions. Theriogenology, v.81, p ,