AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS QUALITATIVOS DE DOSES INSEMINANTES SUÍNAS SUBMETIDAS A SEPARAÇÃO ESPERMÁTICA EM COLUNA DE LÃ DE VIDRO

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1 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS QUALITATIVOS DE DOSES INSEMINANTES SUÍNAS SUBMETIDAS A SEPARAÇÃO ESPERMÁTICA EM COLUNA DE LÃ DE VIDRO Autores: João Luis dos SANTOS¹³, Lucio Pereira RAUBER², Lucas Dalle Laste DACAMPO³, Bruna Kubiak DUARTE³, Ariane Claudia Alves da SILVA³, Marcos Kramer³, Luana BASSEGGIO³, Carla Alexandra NICOLAO³. Identificação autores: ¹ Bolsista PIBITI/CNPq; ² Professor Orientador IFC-Campus Concórdia; ³ Acadêmico do curso de Medicina Veterinária Câmpus Concórdia. Introdução Dados divulgados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) no mês de setembro de 2015 apontaram um recorde no abate de suínos, o resultado desta pesquisa aliada a alta dos preços atuais da carne suína confirmam a boa fase do setor suinícola. A grande ascensão deste setor teve como grande responsável a adoção de manejos padronizados e de biotécnicas que auxiliam o desempenho zootécnico e a produtividade. A inseminação artificial (IA) já está consolidada como componente do manejo reprodutivo. A IA intra-uterina atualmente é a técnica mais difundida em granjas comerciais produtoras de leitões, e responsável pela maximização do uso de reprodutores geneticamente superiores devido a significativa redução do número de espermatozoides por dose inseminante (DI). O desempenho reprodutivo afeta diretamente o desempenho zootécnico das granjas e é influenciado pela qualidade das doses inseminantes utilizadas, sendo que a manutenção da viabilidade espermática é um ponto crítico dentro de um programa de inseminação artificial devido às características dos espermatozoides suínos, como sensibilidade a oscilações de temperatura e por se tratar de um produto perecível, o qual a sua temperatura ótima de armazenamento não diminui de forma eficiente o metabolismo espermático e propicia o crescimento bacteriano. Muitos trabalhos apontam a redução progressiva da qualidade das doses inseminantes proporcionalmente ao aumento do tempo de sua armazenagem, havendo diminuição da motilidade e aumento significativo da prevalência de espermatozoides aglutinados, defeitos de acrossoma e alteração no ph (Santos et al., 2015; Althouse et al., 2000; Bennemann et al., 2000). Devido a estes problemas, é comum que granjas que utilizam doses contaminadas

2 relatem aumento da taxa de retorno ao estro em intervalos regulares, e a extensão do problema dependerá do tempo de armazenamento das doses (Althouse et al., 2000). Como método para a melhoria da qualidade das doses inseminantes, existem métodos de separação espermática utilizados na produção in vitro, que objetivam selecionar subpopulações espermáticas superiores com maior movimento progressivo e células morfologicamente normais. Dentre estes métodos está a separação espermática em coluna de lã de vidro. O objetivo deste trabalho é adaptar esta biotécnica para o uso em sêmen suíno bem como avaliar seu efeito sobre os parâmetros qualitativos espermáticos. Material e Métodos Para este estudo foram utilizadas 20 DI oriundas de diferentes reprodutores suínos com fertilidade comprovada. As coletas foram realizadas com auxílio de um manequim pela técnica da mão enluvada, utilizando um copo coletor com isolante térmico recoberto por um filtro para separar a fração gelatinosa do sêmen. Após a colheita, o sêmen era conduzido ao laboratório onde ficava acondicionado em banho-maria à 37ºC durante as análises pré diluição. Avaliou-se os seguintes parâmetros macroscópicos do ejaculado: Volume, cor e odor. Os parâmetros microscópicos analisados foram: concentração espermática (quantificada por contagem direta em câmara de contagem celular tipo Neubauer Improved, vigor, aglutinação e motilidade espermática. As características qualitativas do sêmen exigidas para a confecção das DI foram: motilidade mínima de 70% e aglutinação máxima de 2 cruzes por campo microscópico (CBRA, 2013). Com a determinação da concentração espermática, o ejaculado era diluído em diluente comercial BTS. O diluente era dissolvido em água deionizada por osmose reversa e aquecido na mesma temperatura do ejaculado (37ºC). Na diluição, a dose era ajustada para atingir a concentração de 3x10 9 espermatozoides móveis em cada frascos de 90mL. As doses eram mantidas em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos com o objetivo de reduzir gradualmente a temperatura, e posteriormente acondicionadas à 17ºC. Após 24 horas de armazenamento, as DI foram avaliadas quanto aos parâmetros qualitativos espermáticos: motilidade, vigor, concentração e aglutinação antes de serem submetidas à técnica de separação em coluna de lã de vidro (grupo controle).

3 Para a confecção da coluna de lã de vidro utilizou-se seringas descartáveis de 20mL, lã de vidro (Merck -Alemanha) fragmentada em partículas de 1,0cm e diluente comercial. Afim de evitar que partículas de lã de vidro contaminassem o sêmen no momento da filtragem, foi confeccionado uma barreira com o mesmo material utilizado para separar a fração gelatinosa do sêmen (poliéster poroso). Após colocar a barreira no fundo da seringa posicionava-se sobre esta 600mg de lã. A coluna era lavada com 20mL de diluente e após compactada, pressionando o êmbolo da seringa até a altura de 1cm. Após isso, removia-se o êmbolo e a coluna de filtragem estava pronta para ser utilizada. Para a filtragem das DI (grupo teste) a coluna era posicionada na vertical sobre um recipiente vazio com a mesma capacidade volumétrica da dose submetida a filtragem. A dose era despejada lentamente e o sêmen era filtrado por gravidade. Em seguida a DI era novamente avaliada em seus parâmetros qualitativos espermáticos (motilidade, vigor, concentração e aglutinação). Os dados foram analisados estatisticamente com auxílio do programa Statistical Analysis System (SAS 2000), com médias comparadas pelo teste de Tukey com nível significância de 5%. Resultados e discussão A sensibilidade a flutuações de temperatura e do armazenamento das DI do sêmen suíno são negativas por não reduzirem o metabolismo dos espermatozoides, e facilitarem a multiplicação de bactérias que diminuem a qualidade do sêmen e causam danos à estrutura celular, o que reduz o potencial fecundante dos espermatozoides. A seleção espermática para a espécie suína tem por função auxiliar na resolução destes e outros problemas reprodutivos comuns ligados a qualidade das doses utilizadas na IA, bem como otimizar a utilização de reprodutores de alto valor genético que possuam problemas na qualidade espermática. Com a análise dos parâmetros qualitativos espermáticos observamos que o armazenamento das DI por 24 horas à temperatura de 17 C já é suficiente para causar uma capacitação espermática devido à não-redução eficiente do metabolismo espermático o que resulta em uma elevação da prevalência de espermatozoides aglutinados (1,7 cruzes) e consequentemente redução da concentração de espermatozoides móveis por DI.

4 O percentual de espermatozoides móveis permaneceu inalterado quando as DI foram submetidas a separação espermática (75% para doses não filtradas e 76% para doses filtradas) demonstrando que esta técnica não altera este parâmetro espermático. As DI filtradas apresentaram um valor altamente significativo em relação as DI não filtradas para a variável vigor, que é definida como a capacidade de progressão linear dos espermatozoides (1,85 cruzes para DI padrão e 2,72 para DI filtradas). Este aumento do vigor provavelmente se dê pela capacitação espermática causada pelo processo mecânico de filtragem através da lã de vidro, porém com diminuição das aglutinações que são resultantes da capacitação espermática, contaminações ou condições de armazenamento. A concentração espermática sofreu um decréscimo significativo nas DI filtradas (2,27 bilhões) em relação as DI não filtradas (2,92 bilhões) da mesma forma que a concentração de espermatozoides móveis por dose (1,74 e 2,2 bilhões, respectivamente). Essa redução pode ser explicada pela alta retenção de espermatozoides aglutinados, mortos bem como de espermatozoides móveis porém provavelmente patológicos. A concentração espermática mínima para a IA intra-uterina citada pela literatura é de 0,5 bilhão sem prejuízos aos índices reprodutivos (Bennemann, 2005), portanto a redução da concentração causada pelo processo de seleção não prejudicou as DI. Os resultados deste estudo concordaram nossos resultados prévios, onde avaliou-se o efeito da coluna de lã de vidro em diferente concentrações sobre a qualidade das DI de sêmen suíno, mostrando a eficiência desta técnica em reter espermatozoides aglutinados (Santos et al., 2015). Tabela I - Parâmetros qualitativos espermáticos de DI submetidas ou não a separação espermática em coluna de lã de vidro. DI Controle DI filtradas Média CV P Aglutinação (1-3) 1,7 a 0,45 b 1,07 77,9 <.0001 Motilidade (%) 75 a 76 a 75,8 7, Vigor (1-3) 1,85 b 2,72 a 2,28 26,8 <.0001 Concentração total (Bi) 2,92 a 2,27 b 2,6 26, Móveis/dose (Bi) 2,2 a 1,74 b 1,97 26, Conclusões Este estudo permitiu a continuidade da adaptação desta biotécnica de separação espermática em coluna de lã de vidro afim de melhorar a qualidade das DI com baixa

5 viabilidade espermática. A lã de vidro mostrou-se eficiente em reter espermatozoides aglutinados, preservando a motilidade espermática e mantendo uma concentração de espermatozoides por DI suficientes para a inseminação intra-uterina. A adaptação desta técnica ainda está em andamento afim de obter melhores resultados para ser aplicada comercialmente. Referências ALTHOUSE, G.C; KUSTER, C.E.; CLARK, S.G.; WEISIGER, R.M. Field investigations of bacyerial contaminants and their effects on extended porcine semen. Theriogenology. v. 53, p BENNEMANN, P.E; BORTOLOZZO, F.P.; WENTZ, I; CARDOSO, M.R.I. Motilidade espermática e integridade acrossomal em doses de sêmen suíno refrigerados e inoculados com Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Ciência Rural, v.30, n.2, p , BENNEMAN, P. E.; KOLLER, F. L.; BERNARDI, M. L.; WENTZ, I.; BOTOLOZZO, F.P. Efeito da inseminação artificial intra -uterina com 500 milhões de espermatozoides na taxa de prenhez e tamanho da leitegada em fêmeas suínas. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 12, CBRA; Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal. Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Organizado por Marc Henry, Jairo Pereira Neves e Maria Inês Marasquenhas Jobim 3. Ed. Belo Horizonte, Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE); SANTOS, J.L.; RAUBER, L.P.; DUARTE, B.K.; DACAMPO, L.D.L.; BASSEGGIO, L. Efeito da coluna de lã de vidro sobre a qualidade das doses inseminantes do sêmen suíno. In: VIII MOSTRA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA. Instituto Federal Catarinense Concórdia- SC, 2015.

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