Criopreservação do sêmen de búfalos (Bubalus bubalis) em diluidores contendo lipoproteínas de baixa densidade, em substituição a gema de ovo

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1 MAYARA FERREIRA BRITO Criopreservação do sêmen de búfalos (Bubalus bubalis) em diluidores contendo lipoproteínas de baixa densidade, em substituição a gema de ovo Dissertação apresentada à Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal. Área: Reprodução Animal Orientador: Prof. Marc Henry Co-Orientadora: Profa. Maria Isabel Vaz de Melo Belo Horizonte UFMG Escola de Veterinária 2014

2 Àqueles que estiveram sempre presentes, cada um a sua maneira, Elba, Brito, Ludmila e Wellerson (minha família!) dedico mais esta conquista!

3 AGRADECIMENTOS À minha família que me forneceu as bases e a estabilidade necessárias para que eu pudesse me dedicar exclusivamente ao ofício da pesquisa; Ao meu bem, Cairo, que se tornou peça fundamental da minha história; Aos órgãos de pesquisa CNPq, INCT pecuária e CAPES pelo oferecimento de bolsa auxílio e financiamentos de projetos; Aos professores do setor de Reprodução Animal, por todos os conhecimentos ofertados e pelos exemplos profissionais; Ao meu orientador e, além de tudo apoiador, Marc Henry, pelos aprendizados proporcionados e pelo exemplo de dedicação à conquista de seus ideiais; À minha co-orientadora e amiga Profa. Maria Isabel, por toda a paciência, pelo compartilhamento dos conhecimentos e por toda a ajuda oferecida; À nossa equipe de trabalho (!!!!) sem os quais eu não teria chegado a lugar algum: Beatriz (pé e mão direita e esquerda!), Guilherme, Rafael, Isabela, Jaci e Ana Maria; Ao Marcelino, que mais que ninguém nos ensina todos os dias como é mais leve e produtivo se trabalhar com um sorriso no rosto e com disposição; A todos os demais funcionários da fazenda Modelo de Pedro Leopoldo, que de uma forma ou outra foram imprescindíveis para a realização desse projeto; Aos integrantes do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e LANAGRO, pela concessão do espaço físico e equipamentos para realização da extração de lipoproteínas; Ao consultor estatístico Danilo; E a todos os amigos, antigos ou novas conquistas, que torceram, rezaram e me ajudaram a estar inteira para conseguir chegar ao fim de mais essa etapa. Meu sincero e enorme MUITO OBRIGADA!

4 SUMÁRIO: 1- INTRODUÇÃO Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO DE LITERATURA Bases da criopreservação de gametas masculinos As lipoproteínas de baixa densidade e sua aplicação para a criopreservação Caracterização das lipoproteínas de baixa densidade Novos protocolos para extração das lipoproteínas da gema de ovo Mecanismos de ação das LDL para criopreservação de espermatozoides Emprego das LDL no congelamento de espermatozoides de mamíferos Características bioquímicas do sêmen bubalino Utilização do sêmen bubalino criopreservado Preparo dos animais para a coleta Características físicas do sêmen Fatores que afetam o congelamento do sêmen de búfalos Avaliação laboratorial do sêmen Avaliação computadorizada da motilidade espermática Teste de termorresistência Avaliação de integridade das estruturas do espermatozoide MATERIAL E MÉTODOS Extração e obtenção das lipoproteínas de baixa densidade da gema do ovo Animais e local do experimento Delineamento experimental Pré-experimento Experimento Experimento Análises pré-resfriamento Processamento do sêmen para congelamento 35

5 3.6- Avaliações espermáticas pós-descongelamento Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Pré-experimento Teste para diluidor base Experimento 1 Teste Diluidor comercial Experimento 2 Teste Tes-Tris Considerações gerais sobre os experimentos CONCLUSÕES 52 REFERÊNCIAS 53 ANEXOS 61

6 LISTA DE TABELAS: Tabela 1- Características pós-descongelamento do sêmen de búfalos congelados em diferentes diluidores, em trabalhos publicados de Tabela 2- Composição química do diluidor Tris-ácido cítrico 33 Tabela 3- Composição química do diluidor Tes-Tris 33 Tabela 4- Preparo de diluidores experimentais a partir do diluidor comercial 34 Tabela 5- Preparo de diluidores experimentais a partir do Tes-Tris 34 Tabela 6- Características do sêmen fresco dos búfalos utilizados no Pré-experimento 38 Tabela 7- Valores de VCL, VSL, VAP, LIN e BCF dos espermatozoides de búfalos congelados em diluidores comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico, durante incubação a 37 C de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos Tabela 8- Médias (± DP) dos espermatozoides com membranas íntegras ou não íntegras, pelo Teste Hiposmótico e por Sondas Fluorescentes (CFDA/Pi) após o descongelamento. Tabela 9- Características do sêmen fresco dos búfalos utilizados no experimento Tabela 10- Médias (± DP) dos parâmetros analisados pelo CASA, para espermatozoides bubalinos pré-resfriamento, diluídos em diferentes concentrações de lipoproteínas de baixa densidade com diluidor comercial base. Tabela 11- VCL, VSL, VAP, LIN e BCF dos espermatozoides de búfalos congelados em diluidores Tes-Tris, e Tes-Tris base contendo 2, 4, 8 ou 14% de LDL, durante incubação a 37 C de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos. Tabela 12- Médias (± DP) dos espermatozoides reativos, com membrana plasmática funcionalmente íntegra, e espermatozoides não reativos, com membrana plasmática não funcional, após o descongelamento, empregando diluidores contendo gema de ovo ou diferentes concentrações de LDL, em diluidor comercial base. Tabela 13- Médias (± DP) dos espermatozoides com membranas íntegras (Íntegro), com membrana acrossomal íntegra e pós-acrossomal lesionada (Semi) e com membranas lesionadas (Lesado), após o descongelamento, empregando diluidores contendo gema de ovo ou diferentes concentrações de LDL, em diluidor comercial base. Tabela 14- Características do sêmen fresco dos búfalos utilizados no Experimento Tabela 15- Características do sêmen pré-resfriamento dos búfalos utilizados no Experimento 2, para testar o diluidor Tes-Tris base em associação com as lipoproteínas da gema de ovo. Tabela 16- Valores de VCL, VSL, VAP, LIN e BCF dos espermatozoides de búfalos congelados em diluidors Tes-Tris, e Tes-Tris base contendo 2, 4, 8 ou 14% de LDL, durante incubação a 37 C de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos. Tabela 17- Médias (± DP) dos espermatozoides com membranas íntegras ou não íntegras, pelo Teste Hiposmótico e por Sondas Fluorescentes (CFDA/Pi) após o descongelamento, empregando diluidores contendo gema de ovo ou diferentes

7 concentrações de LDL, em diluidor Tes-Tris base. LISTA DE FIGURAS Figura 1- Representação esquemática das duas frações da gema de ovo obtida após centrifugação. (Fonte: Anton et al., 2009) Figura 2- Representação esquemática da molécula de lipoproteínas de baixa densidade. (Fonte: Figura 3. Demonstração dos parâmetros de motilidade fornecidos pelo CASA, em relação a um espermatozóide em um dado tempo. (Fonte: Corral-Baqués et al., 2009). Figura 4- Gráfico da motilidade total dos espermatozoides de búfalos congelados em diluidors Diluidor comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico, durante incubação a 37 C de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos (P<0,05). Figura 5- Motilidade total dos espermatozoides de búfalos congelados em diluidors Diluidor comercial base, durante incubação a 37 C de 0 a 120 min, avaliados a cada 30 minutos. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos (P<0,05). Figura 6- Gráfico da motilidade total dos espermatozoides de búfalos congelados em diluidors Tes-Tris base, durante incubação a 37 C de 0 a 120 min, avaliados a cada 30 minutos. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos (P<0,05)

8 RESUMO O objetivo geral deste trabalho foi comparar o efeito de diferentes diluidores, constituídos por gema de ovo de galinha ou lipoproteínas de baixa densidade extraídos da gema de ovo, durante o processo de criopreservação do sêmen de touros búfalos da raça Murrah, a fim de definir qual fornece maior efeito protetor às características espermáticas. Esse trabalho foi dividido em três fases: pré-experimento, Experimento 1 e Experimento 2. O objetivo do Pré-experimento foi comparar três diluidores, sendo um comercial, que possuem a gema de ovo como componente comum. Nos Experimentos 1 e 2 comparou-se diferentes concentrações de LDL na criopreservaçào do sêmen bubalino quando adicionada aos diluidores escolhidos no préexperimento. Ejaculados de seis búfalos Murrah foram divididos e diluídos de acordo com a fase do trabalho: Pré-experimento Diluidor comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico; Experimento 1 Diluidor comercial completo, Diluidor comercial + 2%LDL, Diluidor comercial + 4%LDL, Diluidor comercial + 8%LDL, Diluidor comercial + 14%LDL; Experimento 2- Tes-Tris, Tes-Tris + 2%LDL, Tes-Tris + 4%LDL, Tes-Tris + 8%LDL, Tes-Tris + 14%LDL. As amostras do experimentos 1 e 2 foram analisadas pelo CASA no préresfriamento. Em todas as fases as amostras descongeladas foram submetidas ao teste de termoresistência, assistido pelo CASA, teste hiposmótico e teste de integridade de membranas por sondas fluorescentes (CFDA/Pi). As médias dos resultados obtidos nos três testes foram comparadas pelo Teste de Tukey (P<0,05). No Pré-experimento as motilidades pósdescongelamento foram semelhantes 40,97%±14,21; 37,13%±10,12; 32,81%±11,78 respectivamente para diluidor comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico. A partir da leitura de 30 minutos os diluidores comercial e Tes-Tris mostraram superioridade quanto à motilidade, em relação ao Tris-ácido cítrico. Os valores de VCL, VSL, VAP, LIN e BCF foram maiores para o diluidor comercial, e semelhantes para Tes-Tris e Tris-ácido cítrico. Não houve diferença entre tratamentos quanto à integridade de membranas. No Experimento 1 o diluidor comercial foi superior para motilidade, VCL, VSL, VAP, LIN e BCF nos períodos pré-diluição, pósdescongelamento e durante todo o TTR. A concentração de 2% de LDL teve pior efeito para preservar a integridade de membranas que o diluidor comercial completo. No Experimento 2 o Tes-Tris foi inferior a 2 e 4%LDL quanto a motilidade no pré-resfriamento. No pósdescongelamento, quanto à motilidade o Tes-Tris foi superior (56,53%±9,73) às diferentes concentrações de LDL (47,16%±11,06; 45,64%±7,46; 45,71%± 6,56; 43,33%±5,97, para 2, 4, 8 e 14%LDL). Porém durante o TTR as motilidades foram semelhantes. O Tes-Tris controle foi inferior a todas as concentrações de LDL para VCL, VSL, VAP, LIN e BCF, no préresfriamento, pós-descongelamento e durante todo o TTR. Não houve diferença entre tratamentos quanto à integridade de membranas. O diluidor comercial foi mais adequado para o congelamento de sêmen de búfalos. As concentrações de 2, 4 e 8% de LDL, em diluidor base Tes-Tris, foram mais eficazes que o diluidor Tes-Tris com 20% de gema de ovo para o congelamento de sêmen de búfalos. Palavras-chave: sêmen, búfalos, Diluidor comercial, Tes-Tris, Tris-ácido cítrico, LDL

9 ABSTRACT The aim of this study was analyze the effect of different extenders, consisting of egg yolk chicken or low density lipoproteins extracted from egg yolk, during the process of sperm cryopreservation of buffalo bulls in order to define which provides greater protective effect on sperm characteristics. This work was divided into three phases: Pre - experiment, Experiment 1 and Experiment 2. The purpose of the Pre-experiment was to compare three extenders, including a commercial, that have the egg yolk as a common component. In Experiments 1 and 2 compared different concentrations of LDL in semen extenders chosen at pre - experiment. Ejaculates from six Murrah buffaloes were divided and diluted according to the stage: Preexperiment - Diluidor comercial, Tes- Tris, Tris- citric acid; Experiment 1 Full commercial extender, commercial extender + 2 % LDL, commercial extender + 4%LDL, commercial extender + 8 % LDL, commercial extender + 14 % LDL; Experiment 2 - Tes- Tris, Tes- Tris + 2 % LDL, Tes- Tris + 4 %LDL, Tes- Tris + 8%LDL, Tes- Tris + 14% LDL. The samples of experiments 1 and 2 were analyzed by CASA in pre-cooling. At all stages thawed samples were submitted to the thermotolerance test, assisted by CASA, hypoosmotic test and integrity of membranes by fluorescent probes ( CFDA / Pi ). The average results of these three tests were compared by Tukey test (P < 0.05 ). In Pre - experiment post -thaw motility were similar, ± 14.21, ± 10.12, ± respectively for commercial extender, Tes- Tris, Tris - citric acid. From reading the 30 minutes commercial extender and Tes- Tris extenders showed superiority for motility, compared to Tris - citric acid. The values of VCL, VSL, VAP, LIN and BCF were higher for full commercial extender, and similar to Tes-Tris and Tris -citric acid. There was no difference between treatments regarding the integrity of membranes. In Experiment 1 the full commercial extender was superior to the motility, VCL, VSL, VAP, LIN and BCF in pre dilution, post-thawing periods and throughout the TTR. The 2%LDL concentration had lower effect to preserve the integrity of the membranes to full commercial extender. In Experiment 2 the Tes- Tris was less than 2 and 4% LDL for motility in pre-cooling. In the post - thaw motility the Tes- Tris was higher (56.53 ± 9.73 ) to all LDL concentrations ( ± 11.06, ± 7.46, ± 6, 56; ± 5.97 for 2, 4, 8 and 14% LDL). However, during the TTR motilities were similar between all extenders. The Tes- Tris was lower at all concentrations of LDL for VCL, VSL, VAP, LIN and BCF at pre -cooling, post-thaw and throughout the TTR. There was no difference between treatments regarding the integrity of membranes. The extender full commercial extender was more suitable for the freezing of buffalo semen. The concentrations of 2, 4 and 8% of LDL, in basic medium Tes- Tris, were more effective than Tes- Tris extender containing 20% of egg yolk for freezing sperm buffalo. Keywords: semen, buffaloes, commercial extender, Tes- Tris, Tris- citric acid, LDL.

10 1- INTRODUÇÃO A população mundial estimada de búfalo do Rio (Bubalus bubalis) é de aproximadamente 198,9 milhões de cabeças, das quais cerca de 97% estão na Ásia, e o restante se localizando principalmente no Mediterrâneo e América Latina (FAO, 2012). O rebanho brasileiro está estimado em torno de 1,26 milhão de bubalinos (FAO, 2012), sendo que 64% se encontram no estado do Pará. Entre 2010 e 2011 o rebanho bubalino foi o que apresentou maior crescimento no Brasil, sendo de 7,8% contra 1,6% do rebanho bovino (EBC, 2012; IBGE, 2012). O número de adeptos à bubalinocultura cresce de forma rápida, o que se deve, em grande parte as características peculiares dos produtos derivados do leite e carne de búfalos. O leite de búfala contém maior teor de proteínas, vitaminas A, D e B2, além de lipídeos, porém com menor teor de colesterol (ABCB, 2013), o que, entre outras vantagens, contribui para um maior rendimento na indústria de laticínios. A carne de búfalo por sua vez é considerada, quando comparada a carne bovina, tendo 40% menos colesterol, doze vezes menos gorduras totais, 55% menos calorias, 11% a mais de proteínas e 10 % a mais de minerais (ABCB, 2013). Acompanhando esse crescimento, as biotecnologias desenvolvidas com o objetivo de aumentar a produtividade do rebanho são cada vez mais requeridas pelo campo. Dessa forma as práticas já adotadas em rebanhos bovinos, como a inseminação artificial, passam a ser empregadas também como forma de melhorar a qualidade dos rebanhos bubalinos. Para o sucesso da tecnologia de inseminação artificial, é necessário que o sêmen utilizado tenha máxima capacidade fertilizante, independente se empregado fresco, resfriado, ou congelado. Sabe-se que os processos de resfriamento e congelamento do sêmen causam sérios danos ao espermatozoide e por isso, para minimizar esses efeitos, é necessário que se apliquem protocolos e meios diluidores adequados (Watson, 2000). Esses protocolos irão variar de acordo com as características intrínsecas do sêmen da espécie em questão, pois existem variações de perfil de lipídeos, concentrações de sais, entre outros, no plasma seminal e membranas espermáticas que proporcionarão exigências diferentes entre as espécies. Durante um longo período, e de certa forma ainda hoje, o sucesso da fertilização artificial em bubalinos foi comprometido pelos protocolos aplicados, uma vez que esses eram os mesmos aplicados aos bovinos (Vale, 2011). As características do sêmen da espécie são diferentes, e por isso protocolos específicos devem ser testados, visando maiores resultados quanto às taxas de fertilidade a campo. Outro fato relacionado à tecnologia de congelamento de sêmen é o emprego de produtos de origem animal em meios extensores, para garantir uma melhor proteção dos espermatozoides ao choque frio. Porém esses produtos podem estar relacionados ao transporte de patógenos, sobretudo vírus e bactérias (Bousseau et al., 1998). Por isso, tem-se buscado encontrar alternativas viáveis para a gema de ovo, como produtos de origem vegetal, a lecitina de soja, ou subprodutos purificados da gema de ovo, as lipoproteínas de baixa densidade da gema. Vários estudos têm sido conduzidos no intuito de confirmar o papel das lipoproteínas de baixa densidade extraídas da gema de ovo na proteção da membrana espermática contra o choque térmico, bem como seu mecanismo de ação e as concentrações necessárias, no diluidor, para que se tenha o efeito desejado. 8

11 Por isso, propôs-se a realização de um trabalho para testar a interação do sêmen de búfalos Murrah com diferentes diluidores, comerciais ou não, bem como o efeito desses diluidores quando a gema de ovo integral foi substituída por lipoproteínas de baixa densidade, extraídas da gema de ovo. Também se buscou identificar, em caso de efeitos positivos, qual a concentração de lipoproteína mais indicada para ser empregada no congelamento de sêmen de búfalos Objetivo geral Comparar o efeito de diferentes diluidores, constituídos por gema de ovo de galinha ou lipoproteínas de baixa densidade extraídos da gema de ovo, durante o processo de criopreservação do sêmen de touros búfalos da raça Murrah, a fim de definir qual fornece maior efeito protetor às características espermáticas. espermatozoide descongelado, e integridade de membranas; - Experimento 2: comparar o efeito da substituição da gema de ovo, no diluidor Tes-Tris, por 2, 4, 8 ou 14% de lipoproteínas de baixa densidade extraídas da gema de ovo, sobre as características cinéticas dos espermatozoides de búfalos antes do resfriamento; - Experimento 2: comparar o efeito da substituição da gema de ovo, no diluidor Tes-Tris, por 2, 4, 8 ou 14% de lipoproteínas de baixa densidade extraídas da gema de ovo, sobre a longevidade da motilidade e parâmetros CASA do espermatozoide descongelado, e integridade de membranas Objetivos específicos - Pré-experimento: comparar a eficácia de três diluidores produzidos com 20% de gema de ovo integral (Diluidor comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico) na criopreservação de espermatozoides de búfalos submetidos ao congelamento e descongelamento; - Experimento 1: comparar o efeito da substituição da gema de ovo, no diluidor comercial, por 2, 4, 8 ou 14% de lipoproteínas de baixa densidade extraídas da gema de ovo, sobre as características cinéticas dos espermatozóides de búfalos antes do resfriamento; - Experimento 1: comparar o efeito da substituição da gema de ovo, no diluidor comercial, por 2, 4, 8 ou 14% de lipoproteínas de baixa densidade extraídas da gema de ovo, sobre a longevidade da motilidade e parâmetros CASA do 9

12 2- REVISÃO DE LITERATURA 2.1- Bases da criopreservação de gametas masculinos Os espermatozoides são formados pelos túbulos seminíferos dos testículos, e apresentam-se divididos em cabeça (envolvida na interação espermatozoideoócito), peça intermediária (envolvida na produção de energia) e cauda (envolvida na motilidade). Todo o espermatozoide de mamíferos é recoberto por membrana plasmática, sendo que na região anterior da cabeça, situa-se o acrossoma, estrutura de parede dupla que contém os grânulos responsáveis pela digestão enzimática da zona pelúcida (Flesh e Gadella, 2000; Hafez e Hafez, 2004). A estrutura básica da membrana plasmática é o dito mosaico fluido, onde há uma dupla camada de glico e fosfolipídeos entremeados por moléculas de proteína e colesterol. A fluidez da membrana é determinada pela sua composição lipídica, sendo que quanto mais cadeias saturadas maior será a rigidez e maior a temperatura de fusão. O colesterol é também considerado um elemento regulador da fluidez da membrana, uma vez que ele mantém os fosfolipídeos desagrupados (Singer e Nicolson, 1972 citado por Valle e Silva Filho, 2001). Durante o resfriamento, os lípedes da membrana passam pela fase de transição, podendo alguns segmentos (em caso de resfriamento inadequado) passar da forma fluida para a cristalina. Por esse motivo há um deslocamento das proteínas intrínsecas da membrana para as regiões fluidas remanescentes permitindo que as cadeias de ácidos graxos poliinsaturados formem uma micela invertida, com as cabeças hidrofóbicas voltadas para a superfície externa. Dessa forma podem ser formados canais hidrofílicos pelos quais passariam íons e pequenas moléculas (Amann e Pickett, 1987 citado por Valle e Silva Filho, 2001). A composição lipídica da membrana pode afetar a sobrevivência espermática, e principalmente, diferenças na composição de ácidos graxos e nas concentrações de colesterol têm sido associadas à tolerância ao choque térmico (Neves, 2008). Para evitar esses e outros danos à membrana espermática e manter os espermatozoides armazenados por períodos maiores, durante a criopreservação do sêmen, é necessária a adição de uma solução protetora. Diferentes soluções têm sido utilizadas como diluentes, a maioria das quais são variações de poucas fórmulas principais (Hafez e Hafez, 2004). Os diluidores devem ser capazes de proteger as diferentes estruturas do espermatozoide em todas as etapas do processo de criopreservação. Portanto, em sua composição deve haver substâncias que garantam ph (soluções tampões), osmolaridade (crioprotetores), nutrição adequada (substâncias energéticas) e interrupção do crescimento bacteriano (antibacterianos) (Holt, 2000). Os crioprotetores podem ser classificados como penetrantes ou não penetrantes de acordo com sua capacidade de atravessar as membranas celulares (Hammerstedt, 1990). Glicerol e outras substâncias como metanol, etilenoglicol, 1,2-propanodiol, butanodiol, acetamida e DMSO são enquadrados como penetrantes, pois agem no interior da célula. O efeito protetor do glicerol nos espermatozoides parece estar associado as suas propriedades coligativas, a redução do ponto de congelamento e a conseqüente redução da concentração de eletrólitos na fração não congelada da célula. Isto ajudaria a conter o prejudicial efeito solução, que é causado pelo aumento da pressão osmótica no meio extracelular, em função da concentração de solutos na 10

13 porção de água ainda não congelada, que ocorre durante o processo de congelamento (Holt, 2000). Ou seja, o glicerol penetrando na célula, provoca rápida saída da água intra-celular seguido de lento retorno do volume interno inicial. O grupo dos crioprotetores não penetrantes inclui as proteínas, açúcares de elevado peso molecular, polivinilpirrolidona, entre outros, que atuam através de mecanismo osmótico promovendo a desidratação celular, durante o congelamento e impedindo a formação de grandes cristais de gelo no interior da célula, por restaurar o percentual de água ao redor dos grupos polares da cabeça dos fosfolipídios (Holt, 2000). Vishwanath e Shannon (2000) citam a importância da descoberta de Phillips (1939) quando este observou que a adição de gema de ovo ao diluidor do sêmen teve um efeito benéfico sobre o potencial de fertilização do sêmen resfriado. Acreditavase que a gema fornecesse proteção ao espermatozoide através da diminuição dos efeitos negativos do choque frio ao estabilizar as membranas espermáticas (Holt, 2000). A partir de então a grande maioria dos diluidores passaram a conter a gema de ovo como principal constituinte (Pace e Graham, 1974; Cookson et al., 1984). Porém, por se tratar de um produto de origem animal, várias desvantagens podem ser associadas ao uso da gema integral. Uma delas é a falta de padronização dos seus componentes, uma vez que eles podem variar de acordo com a nutrição e idade da ave (Anton et al, 2003). Outro importante fator é o risco potencial de contaminação do sêmen com bactérias, micoplasmas ou mesmo vírus. Para avaliar a contaminação de diluidores comerciais a base de gema de ovo, e também leite, Bousseau et al. (1998) realizaram testes microbiológicos, encontrando considerável contaminação, independente da presença de antibióticos na composição. Porém, independente desta contaminação os autores não encontraram diferenças significativas quanto ao potencial fertilizante das amostras congeladas com diluidores a base de gema ou leite (avaliação de taxa de clivagem, em fertilização in vitro e taxa de não retorno ao cio em vacas inseminadas). Outro inconveniente associado a alguns componentes da gema de ovo, presentes na porção dialisada da gema, causariam uma redução/inibição da respiração espermática e sua motilidade. Essa ação foi atribuída ao peróxido de hidrogênio, formado pela deaminação oxidativa, pelo espermatozoide, de substratos presentes na porção dialisada da gema (Tosic e Walton, 1950). Pelos motivos expostos, foram reforçadas as pesquisas para identificar qual a fração da gema seria responsável pela crioproteção, a fim de purificá-la e usá-la em substituição a gema integral em meios diluidores para criopreservação do sêmen As lipoproteínas de baixa densidade e sua aplicação para a criopreservação Caracterização das lipoproteínas de baixa densidade A gema corresponde a 36% do peso total do ovo de galinha. Em matéria seca representa entre 50-52%, dependendo da idade da ave e do tempo de armazenamento. Em termos de matéria seca, a gema de ovo é constituída por 66% de lipoproteínas de baixa densidade, 10% de livetinas, 16% de lipoproteínas de alta densidade, 4% de fosvitina e 4% de outros componentes (Powrie e Nakai, 1986). Os lipídeos são compostos de mais de 62% triglicérides, 33% fosfolípedes e menos de 5% colesterol. 11

14 Os carotenóides representam menos de 1% dos lipídeos da gema (Anton et al., 2009). A gema pode ser facilmente dividida em duas frações depois da diluição com NaCl 0,3M e centrifugação a g, quando poderão ser notados o plasma (fluido amarelo, constituído por 85% de lipoproteínas de baixa densidade - LDL e 15% de livetinas) e o grânulo/agregados (constituídos por 70% de lipoproteínas de alta densidade - HDL e 16% de fosvitina ligadas fortemente por pontes de fósforocálcio) (McBee e Cotterill, 1979; Jolivet et al., 2006) (Fig. 1). Figura 1- Representação esquemática das duas frações da gema de ovo obtida após centrifugação. (Fonte: Anton et al., 2009) As proteínas da gema (solúveis ou embebidas em estruturas de lipoproteínas) são derivadas das proteínas maternas séricas, e são sintetizadas no fígado, internalizadas por oócitos em crescimento por endocitose mediada por receptores, e parcialmente processadas. As lipoproteínas de muito baixa densidade da gema, que aumentam em quantidade no sangue durante a fase de maturidade sexual da fêmea (devido à secreção de estrógenos), são os precursores das lipoproteínas de baixa densidade da gema de ovo. As principais apoproteínas da lipoproteína de muito baixa densidade são a apovitelina 1 e a apo-b (similar a apolipoproteína B-100 humana) (Jolivet et al., 2006). A essa última é atribuída a responsabilidade pelo reconhecimento das lipoproteínas pelos receptores específicos e subsequente controle de seu metabolismo (Kuksis, 1992). As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são partículas esféricas, com diâmetro variando de 17 a 60 nm, com um núcleo lipídico em estado líquido (triglicérides e ésteres de colesterol) envolvido por uma monocamada de fosfolípedes radialmente orientados, com sua cabeça polar e as cadeias de proteínas localizadas nas regiões periféricas da proteína (Kamat e Lawrence, 1971; Evans et al., 1973) (Fig. 2). A microscopia eletrônica e a difração por raio- X reforçam o conceito de estrutura em mosaico da superfície da partícula de LDL, na qual as proteínas e os lipídeos recobrem áreas separadas da superfície e não formam associações fortes umas com as outras (não estáveis) (Holdsworth e Finean, 1972). Como os núcleos lipídicos dessas moléculas são encontrados de vários tamanhos, observa-se uma heterogeneidade quando da purificação das moléculas de lipoproteína por pesos moleculares (ultracentrifugações, cromatografia) (Evans et al., 1973). As LDLs são solúveis em soluções aquosas, independente das condições de ph e iônicas, devido a sua baixa densidade (0,982). São compostas por 11-17% de proteínas e 83-89% de lipídeos, dos quais 74% são lipídeos neutros e 26% fosfolípedes (Martin et al., 1964; Steer, Martin e Cook, 1968). Os dois fosfolípedes encontrados em grande quantidade na LDL da gema de ovo, após passagem em coluna de sílica, são fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina (Anton et al., 2003). 12

15 amônio e solução de NaCl seguido de centrifugação (60 min); adição de mais uma parte de sulfato de amônio com nova centrifugação (30 min); a fração flutuante foi então dissolvida em tampão TRIS-HCl com EDTA, dialisada e submetida à coluna cromatográfica de DEAE- celulose. Os produtos obtidos desse processo apresentavam quantidades de fosfolipídeos e proteínas semelhantes àqueles obtidos por ultracentrifugação, permanecendo porém uma pequena contaminação de livetinas. Figura 2- Representação esquemática da molécula de lipoproteína de baixa densidade. (Fonte: As LDLs são responsáveis pela geleificação do ovo durante o tratamento térmico ou no processo de congelamentodescongelamento, enquanto que os outros componentes da gema não participam diretamente. A geleificação ocorre quando, pelo calor ou frio, a estrutura da molécula da lipoproteína se rompe, rompendo também as ligações lipídeos-proteína e aumentando as ligações proteína-proteína. Os principais constituintes dessas ligações são apoproteínas, que possuem grande parte dos aminoácidos hidrofóbicos, favorecendo a formação dos géis (Anton et al., 2009). As primeiras metodologias para separação das lipoproteínas de baixa densidade da gema de ovo de galinha consistiam na realização de diversas ultracentrifugações, por longos períodos (30 a 40 horas), intercaladas ou não por diluição em solução de baixíssima densidade (principalmente soluções de cloreto de sódio). Porém, como nem todos os laboratórios dispunham de tais equipamentos, Raju e Machadevan (1974) propuseram como alternativa a separação por cromatografia. Nesse trabalho as lipoproteínas de muito baixa densidade foram obtidas em 4 passos: centrifugação da gema diluída com água destilada (60 min); adição de sulfato de Novos protocolos para extração das lipoproteínas da gema de ovo Durante muitos anos as metodologias empregadas para a separação das lipoproteínas oriundas da gema de ovo permaneceram baseadas em ultracentrifugações e/ou utilização de colunas cromatográficas. Porém esses métodos demandavam longos períodos de produção e proporcionavam uma baixa recuperação de lipoproteína (Moussa et al., 2002). Por esse motivo Moussa et al. (2002) propuseram um método de extração em que são realizadas centrifugações brandas favorecendo o gradiente de densidade e precipitação em sulfato de amônio para remoção de proteínas contaminantes. Após uma eficiente diálise, para remoção do sulfato de amônio, uma LDL 97% pura é obtida após uma última centrifugação. O rendimento dessa forma de extração foi é 67%, em função da matéria seca. Para o congelamento de sêmen bovino, Moussa et al. (2002) usaram a LDL (em diferentes concentrações) em substituição a gema de ovo em diluidor comercial Triladyl. Eles encontraram que quanto à característica do movimento dos espermatozoides congelados e descongelados, os diluidores que continham de 5 a 10% de LDL foram superiores ao controle (20% de gema de ovo), sobretudo 13

16 quando se utilizou concentração de 8% (p/v). Com base no conhecimento da gelatinização das lipoproteínas, sobretudo abaixo de -6 C (Anton et al., 2009), Moussa et al. (2002) também sugerem que essa gelatinização em torno do espermatozoide possa protegê-lo da formação de cristais de gelo durante o processo de congelamento. Visando aumentar a eficiência da extração das LDL da gema de ovo pelo protocolo proposto por Moussa et al. (2002), Neves (2008) testou a adição de diferentes concentrações de sulfato de amônio ao plasma de gema (após centrifugação). Para isso a autora se utilizou de soluções saturadas de sulfato de amônio, adicionadas ao plasma a 4 C. A partir da eletroforese e teor de lipídeos, sugeriu-se que a solução saturada a 50% de sulfato de amônio adicionada ao plasma resultaria em uma melhor purificação das lipoproteínas de baixa densidade extraídas da gema de ovo. Uma nova forma de extração de lipoproteínas proposta por Laca et al. (2010) (que investigam as lipoproteínas pelo seu poder emulsificante, para a indústria alimentícia) envolve a diluição da gema em água, apenas uma centrifugação e adição de solução de alginato de sódio a 1%. Após mais uma curta centrifugação são obtidas as lipoproteínas de baixa densidade (chamada pasta lipídica). No perfil eletroforético da fração de lipoproteína se observam pesos moleculares de 175, 137, Da, correspondentes a apoproteínas presentes na LDL, muito semelhante ao perfil eletroforético encontrado por outros autores (Moussa et al., 2002; Neves, 2008). Porém apresentou também uma contaminação com apoproteína de HDL 53 Da Mecanismos de ação das LDL para criopreservação de espermatozoides Uma vez comprovado que a gema de ovo seria o agente crioprotetor principal, Pace e Graham (1974) buscaram identificar qual a fração da gema estaria relacionada a essa ação, sobre o espermatozoide bovino. Foram feitas centrifugações e diluições da gema em NaCl obtendo-se como resultado: fração de baixa densidade e fração solúvel em água, além da fração granular. Quanto à capacidade de proteção ao frio, a fração granular apresentou os piores resultados, sendo seguida pela fração solúvel em água. Já a fração de baixa densidade crua apresentou os mesmos resultados que os obtidos pela gema integral. Dentro da fração de lipoproteína foi observado que havia grande variação quanto ao peso molecular, o que poderia contribuir para a variação entre trabalhos. Estimulados por esse problema, Martin et al. (1964) buscaram metodologias para purificar essa fração de baixa densidade, fracionando-a em duas afim de caracterizar cada uma quanto ao peso molecular, conteúdo de lipídeos e outras propriedades. Eles empregaram técnicas de ultracentrifugação, por várias horas, e em colunas de cromatografia, Biogel A50 e Sephadex G-200. O conteúdo lipídico das duas frações foi similar, e constituído principalmente por fosfolípedes, com baixa concentração de proteína. Quanto ao peso molecular a fração 1 (supernadante) foi de 10,3 x 10 6 Da e a fração 2 (subnadante) foi de 3,3 x 10 6 Da. Apesar dessas diferenças, Pace e Graham, 1974, empregando metodologia similar, observaram que quanto a capacidade de proteger a motilidade espermática pósdescongelamento, não haviam diferenças significativas entre as duas frações obtidas da LDL. Para avaliar a atividade de preservação da fração de lipoproteína de baixa densidade 14

17 da gema de ovo, Watson (1976) criopreservou espermatozoides de carneiros e touros usando diluidores que continham a LDL como substituto da gema de ovo. Mais uma vez o que se observou foi que a LDL tinha um potencial de preservação similar ao da gema de ovo, quando considerada a motilidade pós-descongelamento. Entretanto, quando a lipoproteína foi liofilizada, se observou perda do seu potencial, mas ainda assim mantendo uma capacidade de proteção considerável. Foulkes (1977) utilizou a metodologia de ultracentrifugação em altas concentrações de sais inorgânicos e posterior separação por coluna de cromatografia de agarose para a separação de frações purificadas de lipoproteínas da gema de ovo de galinha. Essas frações foram investigadas quanto a seu efeito sobre a motilidade do espermatozoide de bovino criopreservado. Além disso, foi estudada a ligação do espermatozoide à lipoproteína por meio de gema de ovo marcada com radiação. O pesquisador encontrou, após a passagem do extrato de lipoproteínas de baixa densidade em coluna de cromatografia Sepharose 2B, três frações distintas. As duas primeiras continham maior razão lipídeo:proteína, e a terceira era composta pela maior parte dos lipídeos presentes na lipoproteína de baixa densidade inicial. Porém quanto aos tipos de lipídeos essas frações não apresentavam diferenças significativas. Ao se acrescentar cada uma das frações ao diluidor citrato o que se observou foi que o gema/glicerol proporcionou maior proteção geral e que a terceira fração de lipoproteínas foi a mais efetiva das frações de lipoproteína (motilidade pós- descongelamento de 28 e 30%, respectivamente). A partir desses achados o autor destaca que seria então possível a substituição da gema de ovo integral por apenas essa fração da lipoproteína. O autor também destacou que é muito difícil determinar quimicamente se ocorre uma ligação dos lipídeos da gema na membrana do espermatozoide ou incorporação dos mesmos ou se essas moléculas se prendem apenas entre as células, uma vez que qualitativamente o conteúdo lipídico é muito similar. Indícios de que há ligação de componentes da gema ao espermatozoide foram dados ao se acrescentar ao sêmen diluidor contendo gema radioativamente marcada. Após sucessivas lavagens ainda foi possível notar radioatividade na membrana espermática, sem, no entanto, ser possível a identificação específica de qual tipo de lipídeo estaria associado. Além disso, a emissão de radiação foi maior quando usado no diluidor apenas o sobrenadante oriundo da ultracentrifugação da gema, reforçando a idéia do papel das lipoproteínas de baixa densidade. No mesmo ano, Foulkes e Stewart (1977) testaram a fertilidade in vivo do sêmen diluído em diluidores contendo a terceira fração da lipoproteína de baixa densidade (10 mg de proteína/ml) comparando com aqueles contendo 20% de gema.para isso foram usadas (99/grupo) vacas Friesian, não selecionadas, inseminadas apenas uma vez e monitoradas quanto ao retorno ao cio em 16 semanas. O que se observou foi que não houve diferenças entre as taxas de não retorno das vacas, independente do diluidor empregado, reforçando que as lipoproteínas desempenham também papel protetor durante os processos de resfriamento e congelamento. Uma vez tendo comprovada a eficácia da utilização de lipoproteínas de baixa densidade em substituição a gema integral para preparação de diluidores para sêmen, intensificou-se a busca para comprovar como e se acontecia interação entre esses lipídeos e o espermatozoide (Foulkes, 1977; MacDonald e Foulkes, 1981; Quinn et al., 15

18 1980; Cookson et al., 1984; Vishwanath et al., 1992; Manjunath et al., 2002; Moussa et al., 2002; Bergeron et al., 2004). Aproveitando-se da forte ligação de alguns corantes fluorescentes à membrana plasmática do espermatozoide, MacDonald e Foulkes (1981) utilizaram o corante 1- anilino-naphthalene-8-sulphonate (ANS) para investigar o local de interação dos componentes de uma fração das lipoproteínas de baixa densidade (com eficácia na criopreservação de gametas comprovada por Foulkes, 1977 e Foulkes e Stewart, 1977) com o espermatozoide de touros. Ao incubar a fração da lipoproteína da gema de ovo com espermatozoides (na ausência de plasma seminal) na presença de ANS o que se observou foi um aumento na fluorescência, que foi atribuída a um aumento do número de sítios de ligação do corante à membrana, aumento da afinidade dos sítios existentes, ou uma combinação de ambos os mecanismos. A partir destes resultados os autores reforçaram a afirmação de que as lipoproteínas exerciam sua função crioprotetora ao estabilizar a membrana do espermatozoide durante o processo de congelamento e descongelamento. Quinn et al. (1980) investigaram como os fosfolípedes externos, presentes na gema de ovo adicionada aos diluidores, proporcionavam proteção às células espermáticas contra o choque frio. Em seu estudo as hipóteses levantadas foram de uma possível fusão das vesículas dos fosfolípedes ou interpolação de fosfolípedes individualmente dentro da membrana plasmática aumentando as razões fosfolípes: proteína: colesterol ou alterando a razão de lipídeos poliinsaturados: saturados da membrana. Outra hipótese seria de que esses fosfolípedes externos interagiam de forma reversível com a superfície da membrana, causando um rearranjo dos seus constituintes. Este estudo confirmou a proteção contra o choque frio proporcionado pela adição de fosfolípedes ao diluidor, porém essa proteção desapareceu quando a mistura foi lavada, mostrando que a ligação dos lipídeos externos com a membrana plasmática seria fraca e removível. O método de anticorpo marcado por enzima também foi empregado a fim de explicar como ocorre o processo de proteção pela lipoproteína da gema de ovo. Foram produzidos anti-corpos específicos anti - fração 3 da lipoproteína (Foulkes, 1977), em coelhos. Esses anticorpos foram incubados com solução contendo espermatozoides bovinos e diluidor com lipoproteína. Como resultado, os pesquisadores encontraram uma forte ligação dos anticorpos anti-lipoproteína à membrana espermática, além de mostrarem que se ligava aos espermatozoides individualmente (marcação concentração espermática dependente) (Cookson et al, 1984). Na década de 80 o grupo de pesquisa de Shannon (citado por Vishwanath et al., 1992) assinalaram para a existência de um grupo de peptídeos catiônicos no plasma seminal que ao se ligarem à membrana do espermatozoide, que possui carga negativa, causariam uma desestabilização dessa membrana. Por esse motivo esses pesquisadores acreditaram que uma das formas de proteção contra o choque frio e armazenamento das células espermáticas à temperatura ambiente, através do emprego da gema de ovo ou leite, seriam exercidos por peptídeos catiônicos presentes nesses compostos. Vishwanath et al. (1992) comprovaram os efeitos positivos do extrato catiônico da gema de ovo sobre a sobrevivência a temperatura ambiente e após o choque frio e sobre a manutenção da fertilidade de espermatozoides bovinos. Eles reiteraram que o efeito deveria ser exercido por uma forte ligação à membrana 16

19 plasmática, mas também por competição com componentes do plasma seminal. Mais tarde, um grupo de proteínas presentes em abundância no plasma seminal de bovinos, as ditas proteínas do plasma seminal (BSPs), foram relacionadas como um fator prejudicial para o armazenamento dos espermatozoides bovinos, quer seja a temperatura ambiente quer seja resfriado/congelado. Foi descrito que as BSP estimulam o efluxo de colesterol e fosfolípedes da membrana, tornando-a mais susceptível a injúrias durante os processos de criopreservação (Thérien et al., 1999; Manjunath e Therien, 2002). Homólogos das proteínas BSP são descritos também no plasma seminal de outras espécies como bisão, eqüinos, ovinos, caprinos (20-30% do total de proteínas) e suínos (próximo a 1% do total), variando quanto a quantidade no plasma seminal, sendo que essa variação pode implicar na resposta ao processo de armazenamento das células espermáticas (Manjunath, 2012). Contudo comprovou-se que as ações fisiológicas das BSP são tempo e concentração dependentes (Manjunath et al., 2002). Assim sendo uma das formas de proteção exercida pela gema de ovo/lipoproteínas de baixa densidade da gema de ovo, quando adicionadas aos diluidores, seria a de impedir a função das BSP, preservando a integridade da membrana plasmática do espermatozoide (Manjunath et al., 2002). A ligação das proteínas BSP ao espermatozoide ocorre de forma gradual, estando o sêmen diluído ou não. Entretanto, no sêmen diluído com meios contendo gema a ligação de proteínas BSP é 50 a 80% menor. Considerando que as LDL são o único componente da gema que se liga especificamente às proteínas BSP (Manjunath et al., 2002), então as LDL são ditas as responsáveis por prevenir a ligação das proteínas BSP ao espermatozoide durante a diluição (Bergeron et al., 2004). Estimou-se que 104 moléculas de BSP1 podem se ligar a uma partícula de LDL, sendo que os principais sítios de ligação seriam as fosfatidilcolinas (Lusignan et al., 2011). Quando existe a presença de gema de ovo no diluidor, foi observado um ganho de lipídios pelos espermatozoides. Com base nesses achados Bergeron et al. (2004) reforçaram a idéia de que o colesterol e os fosfolípides colina da gema de ovo são adicionados ao espermatozoide, ou mesmo a molécula inteira de LDL se liga ao espermatozoide durante a incubação do sêmen diluído com gema de ovo ou com a LDL derivada da gema. Porém os mesmos autores também destacam que esse ganho de lipídeos é maior quando o sêmen diluído é incubado a 37 C que quando permanece a 4 C. Eles atribuem esse comportamento à fase de transição que ocorre nas membranas biológicas durante o resfriamento. Nessa fase elas se tornam menos fluidas e, portanto menos susceptíveis às trocas lipídicas. É possível que, associado a esse comportamento, um filme de fosfolípides da molécula de LDL formado sobre a membrana do espermatozoide previna parcialmente as trocas de lipídeos. Como base em todas as pesquisas descritas seria possível dizer que há um conjunto de ações atribuídas à LDL que resultam na proteção da célula espermática durante os processos de criopreservação Emprego das LDL no congelamento de espermatozoides de mamíferos Uma vez tendo-se a comprovação, por diversas pesquisas, da eficácia no emprego das LDL em substituição da gema de ovo em diluidores usados para preservação de sêmen de diversas espécies, os trabalhos 17

20 atuais tem focado na identificação de uma concentração ideal de lipoproteínas que teria o melhor efeito protetor final, com base em estudos in vitro e in vivo (Moussa et al., 2002; Yamauchi et al., 2009; Moustacas et al., 2011; Dong et al., 2011; Akther et al., 2011; El-Sharawy et al., 2012). Para avaliar o efeito das lipoproteínas, bem como qual a sua concentração ideal para a utilização na criopreservação do sêmen de suínos, Yamauchi et al. (2009) compararam diluidores contendo 20% de gema de ovo, com outros contendo 2, 4, 6, 8 ou 10% de LDL. Nas concentrações de 4 e 6% foi observado maior concentração de colesterol na membrana do espermatozoide, além de melhores parâmetros cinéticos pósdescongelamento. Nesse estudo, foi observada importante interação entre o tratamento de LDL e o indivíduo, o que pode indicar que o efeito protetor da LDL pode variar de acordo com o animal. Sugeriu-se que essa observação poderia ser atribuída a diferenças no conteúdo de ácidos graxos e níveis de esteróides presentes na membrana. Em sêmen de ovinos, Moustacas et al. (2011) encontraram, comparando diluidores a base de gema de ovo integral ou de 8 a 20% de LDL natural ou liofilizada, que os resultados in vitro para os parâmetros cinéticos e estruturais do espermatozoide foram similares para os diluídos em meios contendo gema ou LDL natural. Porém a lipoproteína liofilizada não foi capaz de proteger os espermatozoides contra os danos da criopreservação. Dong et al. (2011) testaram as LDL na diluição do sêmen de macacos, nas concentrações de 10 a 30% e depois de 2 a 10%, em comparação com diluidores a base de gema integral e a base de HDL. Eles também não encontraram superioridade nos resultados pós-descongelamento em sêmen diluído com gema ou LDL. Quanto a HDL, os autores afirmaram que elas teriam um papel neutro na criopreservação dos espermatozoides de macacos. Assim sendo, os autores acenam para possíveis vantagens de se utilizar a gema integral, tais como a presença de fatores antioxidantes (vitaminas A e E), luteína e outros aminoácidos. Em búfalos dois trabalhos podem ser citados empregando as LDL em substituição a gema de ovo. Akhter et al. (2011) testaram concentrações de 2,5 a 15% de LDL e encontraram que os meios contendo 10% de lipoproteínas preservaram melhor os parâmetros espermáticos pósdescongelamento que as demais concentrações e também que os que continham 20% de gema de ovo, bem como apresentou maiores taxas de fertilidade. De forma semelhante El-Sharawy et al. (2012) encontraram os melhores resultados, in vitro pós-descongelamento e taxas de fertilização in vivo, para a concentração de 12% de LDL. Em bovinos, Hong Hu et al. (2011) aplicaram concentrações de 7, 8 ou 9% para avaliar a motilidade pós-descongelamento e a atividade anti-oxidante do sêmen de touros congelado. A concentração de 8% exibiu os maiores valores de motilidade, integridade de acrossoma e integridade de membrana, além disso houve maior atividade anti-oxidante da catalase, glutationa reduzida e glutationa peroxidase. Já foram também testadas associações da LDL com outros componentes, como açucares, antioxidantes e aminoácidos. Amirat-Briand et al. (2009) mostraram que a adição de 10mM de glutamina a diluidores contendo 8% de LDL para o congelamento de sêmen de touros levou a um significativo aumento da motilidade pós-descongelamento. No ano seguinte Amirat-Briand et al. (2010) empregaram diluidores contendo 8% de LDL em sêmen de touros, para inseminação artificial. Eles não encontraram diferenças significativas 18