UTILIZAÇÃO DO LEITE DESNATADO NO CONGELAÇÃO DO SÊMEN DE CÃO

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1 ARS VETERINARIA, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 3, , ISSN UTILIZAÇÃO DO LEITE DESNATADO NO CONGELAÇÃO DO SÊMEN DE CÃO (USE OF SKIMINED MILK FOR FREEZING CANINE SEMEN) (UTILIZACIÓN DE LECHE DESNATADA EN EL CONGELAMIENTO DE SÉMEN CANINO) I. W. SANTOS 1, A. MEZZALIRA 2, L. C. BINSFELD 3, R. LEHNKOHL 4 RESUMO O objetivo deste trabalho foi comparar a adição de leite desnatado ou gema de ovo junto ao tampão Tris (hidroxymethylaminomethan) para congelação de sêmen canino. Trinta e cinco ejaculados de cinco cães adultos foram colhidos periodicamente através de massagem peniana. Após a colheita, os ejaculados foram avaliados macro e microscopicamente à temperatura de 37 o C, sendo imediatamente centrifugados a 700 G por 5 minutos e a fração rica dividida em duas porções, uma diluída em tris-gema (TG) e a outra em tris-leite (TL). O sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 ml que permaneceram por uma hora à temperatura de 5 o C, sendo transferidas para o vapor de nitrogênio por 15 minutos, mergulhadas em nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criobiológico. A descongelação foi realizada em banho-maria a 37 o C por 30 segundos e avaliados a motilidade, vigor e patologia. O TL foi superior ao TG em relação a motilidade e vigor (P<0,01), não havendo diferença significativa em relação à retenção acrossômica. No teste de termo-resistência rápido (TTR) não houve diferença significativa entre diluentes. Conclui-se que o leite pode ser utilizado junto ao Tris para congelação do sêmen canino. PALAVRAS-CHAVE: Sêmen. Leite desnatado. Cão. Congelação. ABSTRACT This study aimed at comparing the addition of either the skimmed-milk or the egg yolk to the buffered Tris for freezing dog semen. Thirty-five ejaculates of five adult dogs were collected periodically by masturbation. The rich fraction of the semen was preserved. After collection, the ejaculate was macro and microscopically evaluated at 37 0 C, and immediately centrifuged at 700G for 5 minutes. The rich fraction was divided in two parts, being the first diluted in Tris-yolk (TY) and the other in Tris-milk (TM). The semen was bottled in 0.5 ml straws, which were placed for one hour at 5 0 C, followed by nitrogen vapor for 15 minutes. The straws were then stored in a cryobiologic bottle in liquid nitrogen straws were thawed in water-bath at 37 0 C for 30 seconds. Motility, vigor and pathology were evaluated. TM was superior than TG in relation to motility and vigor (P <0.01), with no significant difference in relation to acrossomic retention. There were not significant difference between TY and TM in relation to the thermo resistance test (TRT). The use of the skimmed milk for freezing canine semen is feasible. KEY-WORDS: Semen. Skimmed-milk. Dog. Freezing. 1 Professor Dr. de Reprodução Animal, UFPR - Campus de Palotina - Rua Pioneiro, CEP Palotina, PR. E- mail: 2 Professor Dr. de Reprodução Animal, CAV-UDESC, Lages, SC. 3 Técnico do Laboratório de Reprodução Animal, UFPR - Campus de Palotina. 4 Professor Msc. de Reprodução Animal, UNICENTRO, Guarapuava, PR. 361

2 RESUMEN El objetivo de este trabajo fue comparar la adición de leche desnatada o yema de huevo con solución tampón Tris (hidroxymethyl-aminomethane) para el congelamiento de semen canino. Treinta y cinco eyaculados de cinco perros adultos fueron obtenidos periódicamente por medio de masaje peniano. Después de la obtención los eyaculados fueron evaluados macro y microscópicamente a temperatura de 37ºC. Inmediatamente después fueron centrifugados a 700 G durante 5 minutos y la fracción rica fue dividida en dos porciones, una diluida en Tris-yema (TG) y la otra en Tris-leche (TL). El semen fue envasado en pajillas de 0,5 ml, que permanecieron a 5ºC durante una hora, después fueron transferidas al vapor de nitrógeno por 15 minutos, sumergidas en nitrógeno líquido y almacenadas en cilindro criobiológico. El descongelamiento fue realizado al baño maría a 37ºC durante 30 segundos. Fueron evaluadas la motilidad, el vigor y patología. El TL fue superior al TG en relación a motilidad y vigor (P<0,01), no hubo diferencias significativas en relación a la retención acrosomal. En la prueba rápida de termorresistencia (TTR) no hubo diferencia significativa entre los diluyentes. Se concluyó que la leche puede ser utilizada con el Tris para el congelamiento de semen canino. PALABRAS CLAVE: Semen. Leche desnatada. Perro. Congelamiento. INTRODUÇÃO A coleta do sêmen canino, e a inseminação vaginal de cadelas, é um procedimento comum, já utilizado por muitos criadores e veterinários. Todavia, esta metodologia normalmente é empregada com sêmen fresco ou resfriado e normalmente para atender a situações muito específicas de pacientes que por algum motivo estejam impedidos de realizar a cópula. Desta forma, as publicações referentes aos resultados, bem como ao relacionamento da qualidade espermática com os índices de prenhez e tamanho das ninhadas, ainda são bastante escassos. Dois são os métodos principais para a coleta de sêmen no cão: o método da vagina artificial e o da masturbação. Este último parece proporcionar melhor qualidade de sêmen, e consiste em se fazer pressão alternada e sistemática sobre a glande, no exterior do prepúcio, onde rapidamente ocorre o desencadeamento da ereção e da ejaculação (MIES FILHO, 1987; HOE et al. 2001). ENGLAND & ALLEN (1992) não recomendaram a utilização de vagina artificial quando se deseja trabalhar com apenas a fração rica em espermatozóides. Segundo os autores, a prolongada exposição à primeira e à terceira fração seminal em um efeito negativo no percentual de espermatozóides vivos normais. A função fisiológica destas frações não é bem conhecida, mas é aceito que a primeira fração remove a urina da uretra, enquanto a terceira fração serve para facilitar a penetração da fração rica através do cérvix. Todavia, a presença de adrenalina e noradrenalina sugere estimulação no trato genital feminino. BICUDO (1984) sugeriu um coletor isotérmico para manter a real qualidade espermática durante a coleta. As características do sêmen canino são bastante variáveis de animal para animal, assim como entre diferentes ejaculados de um mesmo animal. SOUZA et al. (1989), avaliando sêmen de 25 cães da raça Pastor Alemão encontraram 7,17ml como volume médio e 68,84% de motilidade progressiva, e verificaram todavia uma grande variação entre ejaculados, recomendando que a avaliação da capacidade reprodutiva não deveria ser baseada em uma única amostra. BICUDO (1984) e CHRISTIANSEN (1988) verificaram motilidade progressiva de 75 e 80% respectivamente em sêmen canino coletado através de masturbação. Muito embora em espécies de interesse econômico como bovinos e ovinos a técnica de criopreservação de sêmen tenha sido amplamente estudada e perfeitamente dominada, o mesmo não acontece com o sêmen canino, que por suas particularidades ainda necessita de estudos e pesquisas que permitam a adequação da técnica para uso rotineiro. Por sua conveniência na preservação de material genético, a utilização de sêmen congelado tem sido incrementada na inseminação de cadelas. Porém, vários componentes para formular diluente, como o leite e outros, já foram utilizados (LINDE-FORSBERG, 1991). ANDERSEN (1975) inseminou 11 fêmeas com 150 a 200 milhões de espermatozóides congelados em tris-frutose-ácido cítrico com 8% de glicerol e 20% de gema. CHRISTIANSEN (1988) obteve 70 a 80% de motilidade espermática após descongelação de sêmen, congelado em tris-frutosecitrato após um período de equilíbrio de 60 a 120 minutos a 5 C, quando foi adicionado 16% de glicerol. ABREU et al. (1989) congelaram sêmen de um cão Rottweiler com motilidade de 70%, vigor 4-5, utilizando o diluente de 362

3 Nagase, com tempo de equilíbrio de 6 horas. Após descongelação, obtiveram 40% de motilidade e vigor 4, não verificando alterações no quadro morfológico. PEÑA et al. (1998) descongelaram sêmen canino com 57% de motilidade, quando utilizaram diluente tris acrescido de 8% de glicerol e 20% de gema. SILVA et al.(2000) congelaram sêmen canino com tris-gema e obtiveram 60% de motilidade pós-descongelação. ROTA et al. (2001) testaram leite desnatado junto ao diluidor tris-glicose-ácido cítrico e compararam com o mesmo diluidor acrescido com gema de ovo e concluíram que não houve diferença na motilidade, vigor e morfologia espermática entre os diluidores compostos por leite e gema de ovo. O objetivo do presente trabalho foi testar o leite como componente do diluente tris na congelação do sêmen de cães. MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi realizado nas dependências do Hospital Veterinário da UFPR-Palotina, PR. Trinta e cinco ejaculados colhidos de cinco cães sem raça definida (SRD) com padrão andrológico exigido pelo Manual de Andrologia do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998) serviram de doadores para o experimento. Semanalmente, foram coletados ejaculados pelo método da massagem peniana, perfazendo um total de 7 para cada cão. Imediatamente após a coleta, determinou-se o volume, a coloração e o aspecto e, em seguida, realizou-se o exame microscópico para determinar o vigor e a motilidade progressiva em microscópio óptico 1 100x. A concentração foi feita com sêmen diluído 1:50 em formol citrato em câmara de Neubauer, procedendo-se a contagem e o cálculo final pela fórmula de KRAUSE (1966). O sêmen foi centrifugado a 700G por 5 minutos e, após a retirada do sobrenadante, foi diluído em dois diluentes propostos a saber: TG Tris 2 (3,028 g), frutose 3 (1,260 g), ácido cítrico 4 (1,780 g), gema (20 ml) e glicerol 5 (8 ml), água bidestilada qsp 100 ml e TL Tris (3,028 g), frutose (1,260 g), ácido cítrico (1,780 g) e leite desnatado (30 ml) e glicerol (8 ml), água bidestilada qsp 100 ml. Após a diluição pelo método One Step, o sêmen foi envazado numa concentração de 50 x 10 6 de espermatozóides viáveis em palhetas de 0,5 ml, e após estabilização por 1 hora à temperatura de 5 C, foram colocadas em vapor de nitrogênio por 15 minutos, então, foram mergulhadas em nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criobiológico. A descongelação de uma palheta de cada ejaculado de ambos os grupos foi realizada em banho maria a 37 C por 20 segundos, e, em seguida, avaliadas quanto à motilidade e vigor em microscópio óptico100x. Para avaliar as alterações acrossômicas do sêmen pós-descongelado, foram utilizados espermatozóides obtidos através de swim up e avaliados por meio de esfregaços corados pelo método de Cerovski (MIES FILHO, 1987) e OETTLE & SOLEY (1988). Uma alíquota do sêmen foi transferida para temperatura de 46 o C por 30 minutos em banho-maria para a realização do Teste de Termo-resistência (TTR), conforme BARNABÉ et al. (1980). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando-se o teste de diferença entre duas amostras pareadas (teste T de Student) com significância de 5%. Tabela 1 Valores médios e desvio padrão de motilidade, vigor, retenção acrossômica pós-descongelação e teste de termo-resistência de sêmen canino congelado com TL e TG. UFPR-Palotina, PR, Colunas com letras diferentes indicam tratamento significativo: a, b = P<0,01. 1 Olympus BX41TF Japão 2,3,4,5 Merk - Alemanha 363

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO O leite desnatado vem sendo utilizado como diluidor de sêmen de diferentes espécies para a inseminação artificial com sêmen fresco ou resfriado. Atualmente, o leite está sendo incluído nas formulações de diluentes para criopreservação do sêmen de várias espécies de animais. Os valores obtidos após descongelação do sêmen canino criopreservado com TL e TG demonstram a variabilidade entre os diluentes em relação a motilidade, vigor e TTR (Tabela 1). A gema de ovo é largamente difundida nos diferentes tipos de diluentes utilizados no sêmen canino, como os descritos por CHRISTIANEN (1988) e BICUDO (1984), que encontraram resultados superiores aos descritos no presente trabalho, porém, PEÑA et al. (1998) e SILVA et al. (2000) obtiveram resultados semelhantes aos aqui demonstrados (62,72%). Os resultados podem sofrer variações em função de diversos fatores como individualidade de cada cão doador, formulação do diluente bem como a metodologia usada no processamento do sêmen. Em relação à motilidade (P<0,01), o TL mostrou-se superior ao TG. Esses resultados corroboram com os estudos de ROTA et al. (2001), os quais verificaram que o leite desnatado era mais uma alternativa para a congelação de sêmen canino, coincidindo com os relatos de LINDE- FORSBERG (1991). No tocante ao vigor (P<0,01), o TL foi superior ao TG, em que foi observado escore médio de 3,83 contra 3,09 respectivamente, aproximando-se dos resultados de ABREU et al. (1989), que obtiveram vigor 4 pósdescongelação utilizando diluente de Nagase. Quando um diluente é modificado, sempre surge a preocupação com as injúrias que ele pode causar ao espermatozóide, principalmente na integridade do acrossoma. No presente estudo observou-se uma baixa percentagem de alterações acrossômicas após descongelação (TABELA 1), não havendo diferença significativa entre os diluentes TL e TG. Outros pesquisadores também observaram poucas alterações morfológicas quando utilizaram diluente TG (ABREU et al. 1989). O exame TTR não apresentou diferença significativa entre TG e TL, porém, esse exame é pouco conhecido para o sêmen canino, no entanto, os resultados aqui apresentados foram baseados na metodologia preconizada por BARNABÉ et al. (1980). CONCLUSÕES Após a análise dos resultados, conclui-se que a inclusão do leite desnatado no diluente tris-frutose-ácido cítrico para criopreservação do sêmen canino é viável, e até superior em relação à motilidade e vigor, quando comparado com o mesmo diluente acrescido de gema de ovo. O leite desnatado preservou a integridade da membrana espermática durante o processo de congelação quando comparado com a gema de ovo. Certamente, mais estudos deverão ser conduzidos para se aprimorar o processo de congelação do sêmen canino. ARTIGO RECEBIDO: Julho/2003 APROVADO: Junho/2004 REFERÊNCIAS ANDERSEN, K. Insemination with frozen semen based on a new insemination technique. Zuchthygiene, v.10, n.1, p.1-4, ABREU, J.J., VALE FILHO, V.R., AGUIAR, P.H.P., TEIXEIRA COSTA, M.E.L. Estudo dos aspectos reprodutivos da espécie canina: Congelação do sêmen - Recuperação pós- congelação. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.1, supl., p. 212, BARNABÉ, V.H., BARNABÉ, R.C., VISINTIN, J.A. Estudo comparativo entre as provas rápidas e lentas de termoresistência para avaliação de sêmen congelado. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.4, p , BICUDO, S.D. Estudo de algumas características do sêmen do cão. In: SIMPOSIO NACIONAL DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 5., 1984, Belo Horizonte. Anais... p CHRISTIANSEN, I. Reprodução no cão e gato. São Paulo: Manole, p ENGLAND, G.C.W., ALLEN, W.E. Factors affecting the viability of canine spermatozoa.ii- Effects of seminal plasma and blood. Theriogenology, v.37, n.2, p , HOE, F.G.H., SOUZA, F.F., TRINCA, I., LOPES, M.D. Efeito do diluidor sobre a viabilidade das células espermáticas caninas, mantidas à 37 C. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.25, n.3, p.466-7,

5 KRAUSE, D. Untersuchungen am Bullensperma unter Berücksichtigung der fertilitätsdiagnostichen Bedeutung der Befunde f. Tese (Livre Docência)- Tierärztliche Hochschule, Hannover, LINDE-FORSBERG, C. Achieveng canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen. Small Animal Practice, v. 21, n. 3, p , MIES FILHO, A. Reprodução dos Animais e Inseminação Artificial. 6. ed., Porto Alegre: Sulina, v.2, p OETTLE, E.E., SOLEY, J.T. Anomaliás de los espermatozoides en el perro: estudio. Noticias Médico Veterinarias de imágenes obtenidas al microscopio óptico y electrónico., v.59, p , ROTA, A., FRISHLING, A., VANNOZZI, I., CAMILLO,F., ROMAGNOLI, S. Effect of skimmed milk in freezing extenders on the viability of canine spermatozoa after thawing. Journal of Reproduction and Fertility, n.57, p , 2001 (Suppl.). SILVA, A. R., CARDOSO, R.C.S., UCHOA, D.C., SILVA, L.D.M. Efeito do tampão tris, gema de ovo e glicerol na congelação do sêmen canino. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.24, n.4, p , SOUZA, J.A., SPICCIATI,W., VISINTIN, J.A. Características do sêmen de cães da raça Pastor Alemão. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.1, p. 233, PEÑA, A.I., BARRIO, F., QUINTELA, L. A., HERRADÓN, P. G. Effect of different glycerol treatments on frozenthawed dog sperm longevity and acrossomal integrity. Theriogenology, v. 50, p ,

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