CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES

Transcrição

1 Dedicatória UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES BOTUCATU - SÃO PAULO 2002

2 Dedicatória UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - Câmpus de Botucatu, para a obtenção do título de Doutor em Reprodução Animal. Orientadora: Profª. Ass. Drª. Maria Denise Lopes BOTUCATU - SÃO PAULO 2002

3 Dedicatória FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SULAMITA SELMA CLEMENTE COLNAGO Cunha, Isabel Candia Nunes da Criopreservação do sêmen de cães / Isabel Candia Nunes da Cunha Tese (doutoramento) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Orientadora: Maria Denise Lopes 1. Cão Sêmen - Criopreservação CDD Palavras-chave: Sêmen; Cão; Criopreservação

4 Dedicatória A os meus pais Estevão e Maria e aos meus irmãos André e Bruno, que me apoiaram e incentivaram a cada passo da minha caminhada, dedico.

5 Dedicatória A gradeço especialmente à Profª Ass. Drª. Maria Denise Lopes pela amizade, apoio e orientação, sem os quais este trabalho não se realizaria.

6 Agradecimentos Agradecimentos A realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou indireta de muitas pessoas. Manifesto minha gratidão a todas elas e de forma particular: À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, Câmpus de Botucatu e Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelas oportunidades concedidas. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo subsidio do projeto e pela concessão da bolsa de estudos. Ao Professor Frederico Ozanam Papa, pelas correções e sugestões, sempre pertinentes. À Professora Fernanda Landim Alvarenga, pela amizade e pela orientação quanto à realização do teste de reação acrossômica. À Professora Carmem Estefânia Serrra Neto Zúccari pelo apoio e auxilio durante as sessões de fotografia e pelas longas horas de discussão, sempre muito prazerosas.

7 Agradecimentos Ao Professor Nereu Carlos Prestes pela sua disponibilidade e auxílio durante as correções finais e por compartilhar inúmeras risadas nos últimos nove anos. Ao Departamento de Clínica Veterinária, pelo empréstimo do microscópio de fluorescência. Ao Professor Adalberto José Crocci pela assessoria estatísca do Experimento I. Ao Professor Paulo Roberto Curi pela assessoria estatística dos Experimentos II, III e IV. Às bibliotecárias Rosemary Cristina da Silva e Luciana Pizzani pela revisão das referências bibliográficas e sugestões. Aos Professores, Residentes e Funcionários do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelo afeto e apoio ao longo destes anos. À pós-graduanda Fabiana Ferreira de Souza pela ajuda incondicional durante a realização de todas as fases deste trabalho. A todos os integrantes do Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e Silvestres por trabalharem para que nossa especialidade seja reconhecida e aprimorada. A todos os colegas de Pós-graduação, pelo agradável convívio e sugestões sempre pertinentes.

8 Agradecimentos Às grandes amigas Denise, Elaine, Maria Célia, Érika e Juliana por serem, Amigas acima de tudo,. A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste trabalho

9 Epígrafe O futuro não nos traz nem nos dá nada. Nós é que, para construí-lo, devemos dar-lhe tudo. Simone Weil

10 Sumário Sumário Lista de Figuras Lista de Tabelas Introdução e Revisão Geral Introdução Revisão Geral Membranas Espermáticas Estrutura e Composição da Membrana Plasmática Respostas da Célula Espermática à Baixas Temperaturas Interações dos Componentes dos Diluidores com a Célula 31 Espermática Experimento I Revisão de Literatura O ejaculado Canino A centrifugação Material e Método Animais Coleta do Sêmen Exame do Sêmen Procedimentos experimentais Métodos Estatísticos Utilizados Resultados Discussão Experimento II Revisão da Literatura Material e Método Animais Coleta do Sêmen Exame do Sêmen... 65

11 Sumário 2.4. Procedimentos Experimentais Métodos Estatísticos Utilizados Resultados Discussão Experimento III Revisão da Literatura Material e Método Animais Coleta do Sêmen Exame do Sêmen Procedimentos Experimentais Métodos Estatísticos Utilizados Resultados Discussão Experimento IV Revisão de Literatura Material e Método Animais Coleta do Sêmen Exame do Sêmen Procedimentos Experimentais Métodos Estatísticos Utilizados Resultados Discussão Conclusões Referências Bibliográficas Anexos Resumo Abstract 147

12 Lista de Figuras Lista de Figuras Experimento I FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais Experimento II FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais Experimento III FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais Experimento IV FIGURA 1 - Espermatozóides caninos corados com Fitc-PNA (emitindo fluorescência verde) e pelo PI (emitindo fluorescência vermelha). a reação acrossomal verdadeira, b - falsa reação do acrossomo c espermatozóides lesados FIGURA 2 - Esquema de formação dos grupos experimentais

13 Lista de Tabelas Lista de Tabelas Experimento I TABELA 1 - Valores médios de motilidade espermática (%) do sêmen de cães, nos os 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, TABELA 2 - Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, TABELA 3 - Valores medianos da aglutinação espermática do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, TABELA 4 - Porcentagem média de células espermáticas íntegras transformadas em arc sen x (em rad) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após as centrifugações (M1). Botucatu, Experimento II TABELA 1 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, TABELA 2 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos grupos tratados com meio TRIS Botucatu, TABELA 3 - Mediana do vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães avaliado antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, TABELA 4 - Mediana da porcentagem de células íntegras no sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu,

14 Lista de Tabelas Experimento III TABELA 1 - Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, Experimento IV TABELA 1- Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, TABELA 2- Medianas do vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos.botucatu,

15 Lista de Tabelas TABELA 4 - Medianas da qualidade do movimento espermático descrito por motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade média (VAP) e linearidade do movimento (LIN) avaliada após 30 minutos da descongelação. Botucatu, TABELA 5 - Mediana da porcentagem de células espermáticas de cães lesadas (Ls) e com reação do acrossomo verdadeiras (Rv) após a descongelação.botucatu,

16 Introdução e Revisão Geral Introdução e Revisão Geral

17 Introdução e Revisão Geral INTRODUÇÃO O interesse na reprodução dos cães, tanto com objetivo de melhoramento e difusão de diferentes raças ou como modelo experimental para a preservação de canídeos silvestres, desponta como um vasto campo para os pesquisadores da atualidade. Para que tais objetivos sejam atingidos com sucesso fazse necessário o aprimoramento de biotecnologias de avaliação, manipulação e conservação do sêmen dos canídeos, assim como, o conhecimento e controle do ciclo estral, com desenvolvimento de métodos precisos para a detecção da ovulação e de técnicas acessíveis e menos cruentas para o depósito do sêmen no trato genital da fêmea. Os primeiros animais prenhes por inseminação artificial (IA) foram cães, inseminados com sêmen a fresco, em estudos conduzidos pelo abade Lazzaro Spallanzani no ano de 1780, na Itália, provenientes desta experiência deu-se o nascimento de três produtos vivos e normais (Mies Filho, 1987). Elias Ivanov, após os trabalhos pioneiros de Spallanzani, demonstrou que a fecundação era possível mesmo quando se substituíam os líquidos produzidos pelas glândulas anexas masculinas por um soro artificial. O mesmo autor, prosseguindo os estudos sobre reprodução, esclareceu o papel do frio na conservação do sêmen extraorganismo (Mies Filho, 1987). A primeira gestação decorrente de IA com sêmen canino preservado em leite pasteurizado e refrigerado por 7 dias, foi descrita por Harrop (1954). A refrigeração é um processo de preservação do sêmen a

18 Introdução e Revisão Geral 18 uma temperatura de 5ºC por um período determinado indicado em alguns casos como, quando o macho e a fêmea encontram-se em lugares distintos de difícil acesso, ou nos casos de impedimento legal da entrada de animais em outro estado ou país, antes de um determinado período de observação (Cunha, 1997; Johnston et al., 2001). O sucesso na congelação de sêmen canino foi descrito por Rowson (1954). Coincidentemente, Seager (1969) anunciou a primeira prenhez, resultante de uma inseminação artificial com sêmen congelado em cães. Estudos realizados com sêmen congelado de cães demonstraram que, aparentemente, o espermatozóide descongelado não apresenta a mesma motilidade e vigor do sêmen fresco ou refrigerado, conseqüentemente, sua sobrevivência no trato genital feminino é reduzida (Gill et al., 1970; Oettlé, 1986; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Morton e Bruce, 1989; Rota et al., 1995; England e Ponzio, 1996; Gabaldi e Lopes, 1998; Peña et al., 1998; Johnston et al., 2001). Rotineiramente, o sêmen congelado é utilizado para a inseminação artificial em outras espécies como a bovina, eqüina, ovina e caprina, e, na maioria delas, o sêmen descongelado é depositado no útero, evitando desse modo, a barreira cervical, o que não ocorre na espécie canina, onde o sêmen é normalmente depositado no fundo da vagina (Morton e Bruce, 1989; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989). As técnicas de preservação de sêmen em baixas temperaturas, causam diminuição da fertilidade, devido principalmente, as lesões estruturais e funcionais dos espermatozóides advindas do estresse térmico (Morton e Bruce, 1989; Jasko, 1994). O estudo da complexa estrutura e funcionamento da membrana plasmática (MP) é um dos passos mais importantes para o

19 Introdução e Revisão Geral 19 entendimento das interações das células espermáticas com o meio que as circunda e ainda para que se minimizem os efeitos deletérios causados pelas alterações provocadas por diminuição ou aumento da temperatura, alterações no ph e na osmolaridade (Watson, 1981; Gennis, 1989). O caráter bioquímico dos componentes dos meios diluidores, a maneira como interagem com os espermatozóides e a possibilidade de sua metabolização ou até, os possíveis efeitos adversos aos espermatozóides devem ser minuciosamente avaliados. A técnica de preservação mais estudada no sêmen dos canídeos é a congelação, porém, existem ainda algumas dificuldades encontradas na padronização desta metodologia, devido principalmente, às particularidades inerentes a esta espécie. Em vista do exposto é que tivemos como objetivo deste trabalho estudar e avaliar o efeito de diferentes etapas da criopreservação do sêmen canino dando-se principal enfoque a: Verificar o efeito do processo de centrifugação sobre a qualidade do sêmen canino (experimento I). Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e momentos de glicerolização sobre o sêmen canino (experimento II). Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e diluidores na congelação do sêmen canino (experimento III). Verificar o efeito de três diferentes diluidores sobre o sêmen canino descongelado sob dois diferentes protocolos (experimento IV).

20 Introdução e Revisão Geral REVISÃO GERAL 2.1. MEMBRANAS ESPERMÁTICAS O estudo detalhado da estrutura e função das membranas espermáticas torna-se extremamente necessário quando objetivamos empregar, com êxito, biotécnicas de preservação espermática. Todas as células - procariontes ou eucariontes - são circundadas por uma membrana plasmática (MP) que define a delimitação da célula, separando seu conteúdo do meio que a circunda. Por servir de barreira seletiva, a MP determina a composição do citoplasma celular (Cooper, 1996), e, tem, papel fundamental na maioria dos fenômenos celulares (Singer e Nicolson, 1972). Segundo descrito por Singer e Nicolson (1972), o modelo básico das membranas biológicas segue a organização estrutural de: bicamada de fosfolipídios com proteínas associadas (Gennis, 1989; Cooper, 1996). O mesmo modelo é também verificado nas membranas espermáticas (Watson, 1981; Watson, 1995). Nos espermatozóides, o duplo folheto não é, simplesmente, uma bicamada passiva de membrana lipídica em que receptores recebem seus sinais moleculares específicos, mas sim, uma estrutura altamente especializada, assumindo um papel ativo na capacidade fertilizante, recebendo sinais e modificando-se ao longo do processo de espermatogênese, trânsito e armazenagem no epidídimo, ejaculação, depósito no trato genital feminino e, finalmente, capacitação e

21 Introdução e Revisão Geral 21 penetração do oócito (Bayard, 1982; O Rand, 1982; Holt, 1995; Watson, 1995; Lenzi et al., 1996). O padrão definitivo de lipídeos dos espermatozóides de um ejaculado só é estabelecido após sua maturação epididimária (Holt, 1984; Watson, 1995; Lenzi et al., 1996). Holt (1984) sugeriu que, além das modificações da superfície celular, relatadas como de maior importância neste processo, ocorrem ainda modificações no interior da MP dos espermatozóides durante sua passagem pelo epidídimo como modulação da fluidez, da permeabilidade e da mobilidade das proteínas integrais das membranas. Fatores externos às células espermáticas, tais como, alterações na composição, ph, temperatura e osmolaridade do meio que as circunda, podem provocar alterações irreversíveis em suas membranas limitando a função fertilizante dos espermatozóides (Gennis, 1989; Watson, 2000) ESTRUTURA E COMPOSIÇÃO DA MEMBRANA PLASMÁTICA Lipídeos Uma grande variedade de lipídeos pode constituir a MP de uma célula e a razão para a existência de tal diversidade parece estar diretamente ligada à função específica que cada membrana exercerá. A heterogeneidade em sua constituição, levando a uma especificidade de função, é o fator mais intrigante quanto à composição das membranas biológicas (Gennis, 1989).

22 Introdução e Revisão Geral 22 As principais classes lipídicas encontradas na MP dos espermatozóides de mamíferos e de aves não são diferentes daquelas encontradas em outras células animais, e incluem, primariamente, fosfolipídios, glicolipídios e esteróis. Contudo, a maioria das espécies moleculares dentro dessas classes lipídicas são também particulares dos espermatozóides e apresentam proporções variando substancialmente com o estágio de maturação e desenvolvimento desta célula e ainda com as espécies animais (Parks e Graham, 1992; Watson, 1995). Os fosfolipídios são constituintes de grande parte das membranas espermáticas, sendo responsáveis por cerca de 60 a 70% dos lipídeos totais de um ejaculado (Watson, 1981). São moléculas anfipáticas constituídas por duas cadeias de ácidos graxos hidrofóbicos ligados a um grupo fosfato que constitui a cabeça hidrofílica (Gennis, 1989; Cooper, 1996). Devido ao fato das caudas dos ácidos graxos serem dificilmente solúveis em água, os fosfolipídios, espontaneamente, formam uma bicamada quando em solução aquosa, com suas caudas hidrofóbicas voltadas para o interior da membrana, e seus grupos polares da cabeça, expostos para os dois lados, em contato com a solução aquosa (Cooper, 1996). Em adição aos fosfolipídios, a MP das células animais contém ainda glicolipídios e colesterol. Membranas diferentes podem conter quantidades distintas destes constituintes, diferindo em seus comprimentos e graus de saturação. Em combinação, estes parâmetros são importantes na determinação das propriedades dinâmicas das membranas (Widnell e Pfenninger, 1990). Os glicolipídios são encontrados exclusivamente no folheto externo da MP, com a porção glicosilada exposta na superfície

23 Introdução e Revisão Geral 23 celular. Estes são, relativamente, o menor componente, constituindo cerca de 2% dos lipídeos totais da MP (Cooper, 1996). O colesterol por outro lado, é o maior componente da MP de células animais, estando presente nas mesmas quantidades molares que os fosfolipídios (Cooper, 1996). A quantidade de colesterol encontrada na membrana espermática varia entre suas diferentes partes (e.x., a taxa de colesterol/fosfolipídio da membrana espermática é maior do que a da membrana acrossomal), entre as espécies animais e ainda varia entre indivíduos de uma mesma espécie (Gennis, 1989; Amann e Graham, 1993; Holt, 1995; Cross, 1998). Devido a sua estrutura de espiral rígido, o colesterol exerce uma função distinta na estrutura da membrana. Este, sozinho, não pode agrupar-se e formar uma bicamada, mas está inserido na bicamada de fosfolipídios, com seu grupo polar hidroxil voltado para a cabeça do grupo fosfolipídio (Cross, 1998; Cooper, 1996). O colesterol tem importante papel na regulação da estabilidade e da permeabilidade da MP (Yeagle, 1985), sendo que o efluxo de colesterol da MP dos espermatozóides é o primeiro passo para o início do processo de capacitação (Seki et al., 1992). Cross (1998) relatou que a taxa colesterol/fosfolipídio existente na membrana espermática exerce importante papel regulador do processo de capacitação espermática, e que, trocas de colesterol por fosfolipídios entre a MP e o meio externo, diminuindo o conteúdo de colesterol, e aumentando, com isso sua fluidez, desencadeiam a reação do acrossomo por: diminuir a microviscosidade da MP, diminuir a adesão entre os fosfolipídios e, talvez, permitir um maior influxo de cálcio para a célula espermática. Todos estes seriam passos inespecíficos que intermediariam a fusão da membrana plasmática com a membrana

24 Introdução e Revisão Geral 24 acrossomal externa, processo fusogênico conhecido por reação do acrossomo. Cross (1998) considerou ainda que a MP de um espermatozóide recém ejaculado é incapaz de sofrer a reação do acrossomo por estar, de alguma maneira, congelada pela alta quantidade de colesterol em sua estrutura. Dependendo da temperatura, o colesterol exerce efeitos distintos sobre a fluidez da membrana. Em altas temperaturas, o colesterol interfere no movimento das cadeias de ácidos graxos dos fosfolipídios, tornando a parte interna da membrana menos fluida, reduzindo a permeabilidade à pequenas moléculas. Em baixas temperaturas contudo, o colesterol exerce efeito contrário por interferir nas interações entre as cadeias de ácidos graxos, prevenindo a membrana dos efeitos da refrigeração e mantendo a sua fluidez (Cooper, 1996). A organização estrutural em forma de bicamada é essencial para que as funções primordiais da MP sejam cumpridas, esta conformação, composta de duas dimensões fluidas, permite que moléculas individuais, lipídeos ou proteínas encontrem-se livres para movimentos de rotação ou ainda para a movimentação lateral através da membrana (Gennis, 1989; Cooper, 1996). Proteínas Enquanto os lipídeos são os elementos estruturais fundamentais das membranas, as proteínas são responsáveis por intermediar e realizar suas funções específicas (Cooper, 1996).

25 Introdução e Revisão Geral 25 Quanto a sua massa, a MP é constituída de aproximadamente 50% de lipídeos e 50% de proteínas, com as porções de carboidrato dos glicolipídios e das glicoproteinas constituindo 5 a 10% (Singer e Nicolson, 1972; Widnell e Pfenninger, 1990; Amann e Graham, 1993; Cooper, 1996). Por serem as proteínas muito maiores que os lipídeos, esta porcentagem corresponde a aproximadamente uma molécula de proteína para cada 50 a 100 moléculas de lipídeos (Cooper, 1996). Segundo Amann e Graham (1993), embora uma grande parte destas proteínas sejam histonas envolvidas no acondicionamento de DNA, outras estão envolvidas com enzimas do acrossomo, receptores da MP, elementos de funcionalidade da membrana (transporte de íons e carboidratos) e estruturas do citoesqueleto (dando formato à cabeça ou provendo os filamentos da cauda). Singer e Nicolson (1972) distinguiram duas classes de proteínas associadas à membrana, chamando-as de proteínas periféricas e integrais à membrana. As proteínas periféricas não estão inseridas no interior hidrofóbico da bicamada lipídica, em vez disso, encontram-se indiretamente associadas com as membranas através de interações protéicas, que, freqüentemente, envolvem ligações iônicas que se desfazem por ph extremo ou frente a altas concentrações de sais. As proteínas integrais à membrana só podem ser liberadas por tratamentos que rompam a bicamada de fosfolipídios. Muitas das proteínas integrais são chamadas transmembrana, por apresentarem vários mergulhos na bicamada de fosfolipídio, desta forma, apresentam porções expostas para os dois lados da membrana. Assim como os fosfolipídios, as proteínas transmembrana são moléculas anfipáticas, com suas porções hidrofílicas expostas para o meio aquoso, dos dois lados da membrana. Algumas destas proteínas

26 Introdução e Revisão Geral 26 mergulham somente uma vez na membrana, outras realizam múltiplos mergulhos (Cooper, 1996). As proteínas e os fosfolipídios não são tão hábeis em se movimentar de um folheto para o outro da bicamada, por estarem inseridos em uma camada fluida, tanto os lipídeos como as proteínas são capazes de se difundir, com muita facilidade lateralmente através da membrana (Cooper, 1996). Ainda assim nem todas as proteínas são capazes de difundir-se livremente pela MP. Em alguns casos, a mobilidade das proteínas da membrana é restrita por associações com o citoesqueleto. Com intenção de manter funções distintas, algumas vezes a mobilidade das proteínas da MP pode ser restrita a domínios apropriados da superfície celular (Cooper, 1996). Imediatamente após a espermiogênese, o espermatozóide recém formado possui 3 áreas maiores de domínio em sua MP: cauda posterior, cauda anterior e conjunto da cabeça (Bartles, 1995). Em uma divisão futura, o domínio do conjunto da cabeça da MP dos espermatozóides divide-se em cabeça anterior e cabeça posterior, após sua passagem pela rete testis e pelo epidídimo (Holt, 1984; Bartles, 1995). Glicocálice Como já descrito anteriormente, a porção extracelular das proteínas da MP geralmente é glicosilada, com a porção carboidrato exposta na face externa da MP, conseqüentemente, a superfície da célula é coberta por uma camada de carboidratos, conhecida como glicocálice, formada por oligossacarídeos de glicolipídios e glicoproteinas transmembrana (Cooper, 1996).

27 Introdução e Revisão Geral 27 Uma parte da função dos glicocálices é de proteger a superfície celular. Além disso, os oligossacarídeos dos glicocálices servem de marcadores para uma grande variedade de interações celulares (Cooper, 1996). Amann e Graham (1993) citaram a presença do glicocálice na superfície da membrana espermática. Afirmaram, ainda, que muitas das proteínas da superfície externa da MP dos espermatozóides contêm cadeias de carboidratos que tendem a formar um campo de carga negativa e a atrair, e ligar-se, negligentemente, a outras proteínas do meio que os circunda. Devido a este material adsorvido, o aspecto externo da região do glicocálice dos espermatozóides pode variar, dependendo da sua situação ou do meio em que ele se encontra RESPOSTAS DA CÉLULA ESPERMÁTICA Á BAIXAS TEMPERATURAS A congelação e a posterior descongelação, com a manutenção de todas as funções vitais, é um desafio alcançado com sucesso por alguns microorganismos da natureza (Mazur et al. 1972). O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência, reduzindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição nos gastos energéticos e na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a preservação celular. Da mesma maneira que a congelação pode diminuir ou paralisar algumas reações bioquímicas celulares, ela pode, também, acelerar outras, levando a danos ou mesmo a morte celular (Mazur et al. 1972, Watson, 1981; Watson, 1995; Holt, 2000).

28 Introdução e Revisão Geral 28 Todos estes efeitos podem se apresentar de maneira diferente entre as várias espécies animais, entre indivíduos de uma mesma espécie e ainda entre os compartimentos do espermatozóide, como o acrossômico ou o mitocondrial (Watson, 1995; Holt, 2000; Kirk, 2001). De acordo com Jasko (1994), as técnicas de preservação do sêmen em baixas temperaturas, como a refrigeração ou a congelação, causam uma diminuição da fertilidade, devido às injúrias ocorridas nas células espermáticas, advindas do choque térmico. O termo Estresse Térmico ou Choque Térmico define um conjunto de alterações ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos quando resfriados rapidamente da temperatura corpórea até temperaturas próximas a 5 0 C, que tem como consequência um decréscimo irreversível da motilidade espermática, mudanças na bioquímica e no funcionamento das células espermáticas incluindo: diminuição da taxa da glicólise, da respiração celular e da frutólise, aumento na degeneração do ácido desoxirribonucléico e liberação de material intracelular (Amann e Graham, 1993; Jasko, 1994; Zúccari, 1998; Holt, 2000; Watson, 2000). A maioria das alterações causada pelo estresse térmico se inicia na membrana espermática (Jasko, 1994, Holt, 2000). A alteração da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou ph podem determinar mudanças na estrutura e organização da bicamada de fosfolipídios (Gennis, 1989). A redução de temperatura de 37ºC a valores próximos de 4-5ºC pode levar ao rearranjo de alguns fosfolipídios semelhantes dentro da bicamada, que podem agrupar-se e assumir configuração hexagonal do tipo II, na qual, as cabeças polares hidrofílicas dos fosfolipídios se agrupam formando micelas, com suas caudas hidrofóbicas voltadas para o lado externo. Com este rearranjo as propriedades básicas da membrana

29 Introdução e Revisão Geral 29 biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas, não são mantidas alterando a funcionalidade da membrana em questão (Watson, 1981; Gennis, 1989; Parks e Graham, 1992; Amann e Graham, 1993; Jasko, 1994; Watson, 1995; Holt, 2000; Watson, 2000). Watson (2000) citou ainda que outros elementos da bicamada de fosfolipídios podem ser extremamente afetados pela queda da temperatura, um exemplo seria a mobilidade das proteínas integrais que poderá ser restrita pelo efeito da fase transicional dos lipídios, o que levará a uma alteração em suas atividades, especialmente aquelas proteínas dependentes de sua modulação estrutural para a manutenção de suas funções, como é o caso das proteínas formadoras dos canais iônicos. A regulação do influxo de cálcio é claramente afetada pelo resfriamento, sendo indiscutivelmente, uma das mais graves alterações em termos de função espermática, e, em alguns casos, esta alteração pode ser incompatível com a viabilidade espermática. A entrada de cálcio na célula durante o resfriamento, mimetizando o que ocorre fisiológicamente durante a capacitação, contribui para o inicio das reações fusogênicas entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal externa. Watson (2000) relatou a existência de uma grande similaridade entre os danos verificados na MP durante a congelação e as alterações verificadas após a reação do acrossomo, este autor considerou uma a versão desorganizada da outra. Segundo a revisão de Watson (2000) existem ainda alguns elementos do citoesqueleto espermático sensíveis a alterações de temperatura, como é o caso dos filamentos de actina. O mesmo autor relatou que a despolimerização da F-actina é uma das etapas necessárias para permitir a aproximação da MP e da membrana acrossomal externa, promovendo a exocitose acrossomal e que, talvez, esta possa ser uma

30 Introdução e Revisão Geral 30 das explicações para a fusão desorganizada das membranas após o resfriamento e a criopreservação dos espermatozóides. Com o declínio constante da temperatura, as células estarão expostas à temperatura de congelação (abaixo de 0ºC), e com isto, as células espermáticas serão expostas a alterações de osmolaridade do meio que as circunda. A água presente no meio extracelular encontra-se sob a forma de solução, com a congelação de parte desta água, a saturação de solutos aumenta, tornando hipertônico o meio externo. Neste momento, para que um equilíbrio osmótico seja atingido, ocorre um efluxo de água da célula a ser congelada para o meio externo. Esta tentativa da célula em equilibrar o meio que a circunda pode levá-la a sofrer um efeito deletério devido a grande desidratação e a exposição a um meio extremamente saturado. Este efeito é chamado de Efeito de Solução e é considerado um dos pontos críticos no processo de congelação das células espermáticas (Mazur et al. 1972; Watson, 1981; Watson, 1995; Holt, 2000). Quando se congela uma célula lentamente, existe tempo hábil para que uma grande quantidade de água migre da célula espermática para o meio extracelular, na tentativa de reverter os danos do efeito de solução. Neste caso, é imprescindível que a descongelação se faça também lentamente, para que os volumes de água sejam reequilibrados antes da total descongelação, evitando que grandes alterações do volume celular provoquem lesão da membrana espermática, por outro lado, se a congelação se dá rapidamente não ocorre uma grande alteração no volume de água no interior da célula e microcristais de gelo serão ali formados. A descongelação neste caso deve ser realizada também de maneira rápida, pois, se esta é realizada de maneira lenta a água intracelular se descongela em um momento em que existe ainda temperatura baixa o suficiente para haver uma recristalização da água recém descongelada. Se isto acontecer, grandes

31 Introdução e Revisão Geral 31 cristais, advindos da recristalização se formarão, expondo a célula ao risco de sofrer perfurações por estes grandes cristais de gelo (Mazur et al. 1972, Watson, 1981, Watson, 1995, Holt, 2000). Watson (1995) afirmou ainda que a habilidade em suportar o choque térmico é adquirida pelos espermatozóides durante sua passagem pelo epidídimo e que esta capacidade de suportar flutuações de temperatura está diretamente relacionada com as mudanças nos lipídios das membranas espermáticas que ocorrem neste momento. Este mesmo autor sugeriu ainda que alterações tanto na freqüência das ejaculações, como no tempo do trânsito epididimário e da exposição dos espermatozóides aos fluidos epididimários, podem ser uma explicação em potencial, para diferenças de congelabilidade entre ejaculados de um mesmo indivíduo. Um dos aspectos de maior questionamento dentro dos estudos da criopreservação é saber quando as alterações ocorrem, se durante o congelamento ou se no descongelamento. Existem evidências sugestivas de que células congeladas podem ser danificadas pela descongelação e este efeito tem sido atribuído, principalmente, à recristalização dos microcristais durante uma descongelação inapropriada (Watson, 1995) INTERAÇÕES DOS COMPONENTES DOS DILUIDORES COM A CÉLULA ESPERMÁTICA Um protocolo de preservação adequado deve manter o potencial fertilizante das células espermáticas que deverão, ao final de todo o processo, apresentar a vitalidade necessária para atingir o local da fertilização e estarem aptas a concluir a capacitação e a reação acrossômica, que constituem o estágio final de maturação espermática e

32 Introdução e Revisão Geral 32 possibilitam a fecundação de um oócito (Watson, 1995; Rota, 1998; Ström Holst, 1999; Peña, 2000). Tanto para a refrigeração como para a congelação do sêmen, diluidores são utilizados com o intuito de proteger os espermatozóides de todos os efeitos críticos do processo de congelação. Para tanto, deverão ser adicionadas, aos diluidores, macromoléculas como lipoproteínas e fosfolipídios que atuarão como estabilizadores da MP e como crioprotetores. Deveremos ainda fornecer fonte de nutrientes para o metabolismo espermático e meio tampão para a manutenção do ph. O desenvolvimento de um meio diluidor está sempre voltado para a obtenção de uma boa estabilização dos componentes da MP (Parks e Graham, 1992; Jasko, 1994). Holt (2000) em sua revisão afirmou existirem diferenças na composição lipídica da MP entre espécies, raças e ainda entre indivíduos da mesma espécie, sendo talvez, a explicação para que um mesmo meio diluidor confira maior ou menor proteção aos espermatozóides de um determinado indivíduo. Watson (2000) e Kirk (2001) consideraram os indivíduos como bons congeladores e maus congeladores, e estas duas classes se diferenciam pela capacidade dos indivíduos em tolerar os efeitos deletérios da criopreservação. Açúcares Os açúcares têm sido incluídos nos diluidores para conservação de sêmen a baixas temperaturas como substrato de energia endógena, como componente osmótico e como agente crioprotetor (Farstad, 1996; Peña, 1997; Holt, 2000; Johnston et al., 2001).

33 Introdução e Revisão Geral 33 O espermatozóide, como outras células, é capaz de metabolizar os hidratos de carbono mediante um mecanismo oxidativo ou aeróbico (do qual restam como resíduo CO 2 e H 2 O), ou por mecanismo anaeróbico (de degradação incompleta), na qual a quebra dos carboidratos estaciona na fase do ácido lático, que se acumula (Pérez e Pérez, 1994). Rigau et al. (2001), partindo do princípio de que os espermatozóides podem metabolizar tanto a glicose como a frutose, avaliaram os efeitos destas duas hexoses sobre o padrão de motilidade espermática em cães. Os autores concluíram que a frutose induz um padrão de motilidade mais rápido e mais linear que a glicose e especularam ainda que a incubação em presença de glicose resultou em padrão de motilidade semelhante àquele verificado em espermatozóides caninos hiperativados. Os di e trissacarídeos, não metabolizáveis pelos espermatozóides, exercem ainda um efeito crioprotetor em função de seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico atuando como substitutos de eletrólito. Não possuem capacidade de penetrar a membrana quando a concentração de solutos é elevada e dão melhores resultados quando acrescidos à fração glicerolizada do extensor (Salisbury e Vandemark, 1978). Além de suas propriedades coligativas, os açúcares exercem efeito crioprotetor interagindo diretamente com a membrana. Estas interações envolvem ligações de hidrogênio dos grupos hidroxil dos açúcares com o grupo fosfato localizados na cabeça dos fosfolipídios. Por restaurar o percentual de água ao redor dos grupos polares da cabeça dos fosfolipídios, os açúcares podem prevenir os danos causados pela desidratação extrema que pode ocorrer com a congelação (Holt, 2000). Geralmente, os dissacarídeos (sucrose, trealose) são mais efetivos em estabilizar a bicamada do que os monossacarídeos (De Leeuw, 1993).

34 Introdução e Revisão Geral 34 Gema de ovo Desde que Phillips e Lardy (1940) descobriram os efeitos benéficos da gema de ovo na conservação dos espermatozóides, muitos estudos foram realizados para elucidar a origem da indiscutível ação benéfica que este produto oferece aos espermatozóides na condução da conservação in vitro. O principal efeito protetor da gema do ovo parece ocorrer pela diminuição dos efeitos negativos do choque frio estabilizando as membranas espermáticas (Holt, 2000). Watson (1979) demonstrou que uma lipoproteína de baixa densidade encontrada na gema de ovo é o fator ativo que protege a célula espermática do choque frio, porém o mecanismo pelo qual este efeito se dá permanece obscuro. Watson (1981) demonstrou que a gema de ovo pode conferir diversos graus de proteção aos espermatozóides de diferentes espécies animais, sendo que a explicação para esta observação seja devido, principalmente, à comprovação da existência de distintas composições lipídicas das MP entre as espécies animais. Devido às recentes necessidades de controle de doenças e ainda, para se evitar o uso de meios diluidores compostos por substância biológicas existe um crescente desejo dos pesquisadores em encontrar um substituto bioquimicamente estável para a gema de ovo, porém, até o presente, devido, principalmente, à falta de dados sobre o mecanismo exato de como a gema do ovo interfere na estabilização das membranas espermáticas, este substituto ainda não foi encontrado (Holt, 2000).

35 Introdução e Revisão Geral 35 Leite O emprego do leite como meio diluente de sêmen foi primeiramente demonstrado por Donne em Segundo Hoffman (1905) o leite era um líquido orgânico com importante propriedade biológica para a conservação dos espermatozóides por possuir certa capacidade tampão, ação bactericida, viscosidade adequada para a manutenção dos espermatozóides no meio líquido com abundância de carboidratos que seriam utilizados pelos espermatozóides na produção de energia. Em 1950, Koelliker comprovou a eficácia do leite na criopreservação de sêmen e afirmou que duas substâncias eram responsáveis por esta característica: a lactose, que age como elemento energético, e proteínas que são substâncias capazes de potencializar a atividade cinética dos espermatozóides. Cunha (1997) e Johnston et al. (2001) verificaram a possibilidade da utilização de um diluidor a base de leite desnatado e glicose, rotineiramente utilizado na espécie eqüina, para a refrigeração e transporte do sêmen canino. Glicerol A adição de crioprotetores ao meio diluidor é essencial para a sobrevivência das células espermáticas após os processos de resfriamento, porém os crioprotetores podem acarretar danos às células (Parks e Graham, 1992). Muito são os compostos de ação crioprotetora que são tradicionalmente classificados como tendo ação intra ou extracelular. Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem o glicerol, o

36 Introdução e Revisão Geral 36 dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, metanol. A ação protetora destes crioprotetores é atribuída a suas propriedades coligativas e ligantes com água, diminuindo o ponto crioscópio intracelular, e, portanto, aumentando a quantidade de água que permanece no estado líquido sob baixas temperaturas, diminuindo a concentração intracelular de solutos e reduzindo os danos do efeito de solução (Peña, 1997; Holt, 2000). Desde que Polge et al. (1949) demonstraram a eficácia do glicerol, ele foi considerado o crioprotetor universal sendo a substância mais amplamente empregada na congelação de sêmen, incluindo a espécie canina (England, 1992). Durante o processamento do sêmen ocorrem bruscos movimentos de água e de crioprotetores em uma célula espermática, sendo possível que movimentos similares ocorram também em cada compartimento espermático. Este movimento de água através da membrana é influenciado, principalmente, pela existência de defeitos na membrana plasmática e pela composição e estrutura da bicamada lipídica (Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997). A primeira conseqüência da adição do glicerol em um meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma rápida saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento retorno ao volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula (Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997). Hammersted e Graham, 1990, descobriram que a exposição de células a um meio diluidor com concentração de 0,5 M de glicerol pode criar uma concentração intramembrana de 1mM de glicerol, logo, por alterar a composição da membrana espermática, o glicerol pode ainda alterar as propriedades básicas da MP por induzir mudanças no

37 Introdução e Revisão Geral 37 acondicionamento de fosfolipídios e ainda alterar a estabilidade e a permeabilidade a água. A fusogenicidade da membrana e o padrão de respostas induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas mudanças causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática, podendo este fato contribuir para a diminuição da sobrevivência espermática posterior ao processo de congelação/descongelação e acelerar a capacitação espermática (Watson, 1995). Segundo England (1992) a concentração de glicerol utilizada para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%, sendo que, segundo Watson (1979), a concentração ótima de glicerol em um meio diluente representa um equilíbrio perfeito entre o efeito protetor e o efeito tóxico do glicerol. O grupo dos agentes extracelulares inclui as proteínas, açúcares de elevado peso molecular, polivinilpirrolidona, etc. Atuam através de mecanismo osmótico promovendo a desidratação celular durante a congelação e impedindo a formação de grandes cristais de gelo no interior da célula (Peña, 1997; Holt, 2000). Tampões O contínuo metabolismo espermático, produzindo como resultado grandes quantidades de catabólitos tóxicos, acarreta num aumento do ácido lático no meio extracelular. Este acúmulo pode causar a morte dos espermatozóides devido a drásticas alterações do ph no meio extracelular. Daí a necessidade de adição de tampões ao meio diluidor (Pérez e Pérez, 1994; Farstad, 1996; Holt, 2000).

38 Introdução e Revisão Geral 38 O fosfato foi primeiramente testado para este fim, porém o citrato de sódio, introduzido por Salisbury em 1940, adaptou-se melhor a esta finalidade. O citrato de sódio aumenta a capacidade de diluição da gema de ovo ao meio líquido, fenômeno que favorece sobremaneira a ação da gema sobre os espermatozóides. Este fenômeno é particularmente notável no que diz respeito ao choque frio e, com o emprego do citrato de sódio, se obtém um aumento no tempo de sobrevivência dos espermatozóides (Pérez e Pérez, 1994). Tampões devem ser utilizados para a manutenção do balanço iônico e do ph no diluidor (Johnston et al., 2001). Substâncias de poder tampão, incluindo citrato de sódio, TRIS (trishidroximetilaminometano) ou TES, têm sido utilizados com sucesso na preservação de gametas de canídeos (Farstad, 1996, Rota, 1998, Holt, 2000; Peña, 2000; Johnston et al., 2001). Aditivos Espécies reativas de oxigênio (H 2 O 2 ; O - 2, - OH, ROOH,...) e os antioxidantes têm demonstrado um importante papel na fertilidade e na infertilidade. Algumas evidências diretas ou indiretas levam a crer que em vários momentos da criopreservação do sêmen estas espécies são formadas. O controle do nível das espécies reativas de oxigênio pela inclusão de antioxidantes ou pelo uso de condições que reduzam a oxidação durante a congelação tem sido descrito (Papa et al., 1993; Bilodeau et al., 2001). Vários aminoácidos, entre eles a glicina, têm sido incluídos na preservação do sêmen (Papa et al., 1993; Ball, et al., 2001; Bilodeau et al., 2001). De acordo com Papa et al. (1993) a ação da glicina ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se, que esse

39 Introdução e Revisão Geral 39 aminoácido participa na síntese de enzimas antioxidantes (Gluthation Peroxidase), inibindo a formação de radicais livres e, conseqüentemente, protegendo a membrana celular da oxidação. Segundo Bicudo (1993), a adição de glicina e OEP ao meio citrato-gema melhorou o vigor espermático assim como aumentou a retenção de acrossomo após a congelação do sêmen bovino. A adição de diferentes compostos detergentes, como o Equex STM paste ou o Orvus ES paste ambos tendo como fração ativa o SDS (dodecil sulfato sódico) em diluentes de congelação parece ser benéfica para várias espécies, incluindo a espécie canina (Rota et al., 1997; Holt, 2000; Peña, 2000). O SDS é um detergente aniônico do grupo alquil iônico, solúvel em água, que age desnaturando proteínas de membrana, e que, quando em altas concentrações, pode solubilizar completamente membranas biológicas. A natureza da proteção exercida pelo SDS não é completamente conhecida, sugere-se que o efeito do SDS possa ser exercido diretamente no meio extracelular, solubilizando as lipoproteínas da gema do ovo e aumentando, desta forma, seu potencial de proteção (Holt, 2000; Peña, 2000). Rota et al. (1997) incluíram o Equex STM paste ao seu diluidor para o sêmen de cão e constataram sua ação benéfica aos espermatozóides. Os mesmos autores, em acordo com o citado anteriormente, sugeriram que a fração ativa do Equex, o SDS, deve estar envolvida com a solubilização e a ativação de componentes da gema de ovo. Peña (2000) constatou que o Equex, quando utilizado em diluidores para o sêmen canino, exerceu um efeito protetor sobre as membranas espermáticas e sugeriu que o SDS possa ter reduzido a fase

40 Introdução e Revisão Geral 40 de transição lipídica e/ou protegido o funcionamento de bombas iônicas dos espermatozóides. Peña (2000) alertou para o fato de que a exposição prolongada dos espermatozóides ao SDS ou às lipoproteínas da gema de ovo tratadas pelo SDS, pode conferir um excesso de fluidez às membranas espermáticas indicando que seu efeito benéfico é dependente do tempo de exposição e da concentração deste no meio diluidor.

41 Experimento I Experimento I

42 Experimento I 42 EFEITO DO PROCESSO DE CENTRIFUGAÇÃO SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO 1. REVISÃO DE LITERATURA Os ejaculados caninos apresentam oscilações significativas de volume e concentração espermática devido, principalmente, a grandes variações de tamanho entre animais e entre as diferentes raças (Cunha, 1998). Para que se determine um protocolo de congelação na espécie canina, onde alguns fatores como: a concentração espermática por palhetas e a concentração de crioprotetor por célula espermática sejam constantes, faz-se necessário que esta variação de volume do ejaculado canino seja minimizada. A centrifugação é uma das formas propostas na literatura para se padronizarem essas variações e manter constantes o volume e a concentração espermática sem que se verifique influencia negativa sobre as células espermáticas (Papa, 1987; Lopes e Papa, 1998; Kirk, 2001) O ejaculado canino Segundo Heidrich (1977), foi Freiberg em 1935 o pioneiro a identificar o fracionamento no ejaculado do cão. Chamou a primeira fração de uretral ou pré-espermática, a segunda, de fração rica em espermatozóides, e a terceira, de fração prostática ou pós-espermática. A primeira fração ou pré-espermática apresenta um aspecto aquoso, cujo ph varia de 6,2 a 6,5 e um volume entre 2,4 ± 1,8ml

43 Experimento I 43 (Johnston, 1991; Silva et al., 1996, Peña, 1997). England e Allen (1992) sugeriram que as frações pré-espermática e pós-espermática são originadas na próstata. A segunda fração ou espermática apresenta um aspecto de cremoso a aquoso e sua coloração fisiológica varia de branco opalescente ao marfim, o ph situa-se entre 6,3 a 6,6 e o volume médio varia de 0,5 a 3,5 ml (Gunzel-Apel, 1994). A última fração do ejaculado é de origem prostática e apresenta um aspecto aquoso e seu ph oscila entre 6,5 e 7,0. O volume é diretamente proporcional à atividade secretória da glândula prostática e sua média é de 6,48 ± 4,32ml (Morton e Bruce, 1989; Aguiar et al., 1994). O fluido prostático é produzido continuamente nos machos caninos não castrados e reflui retrógradamente para a bexiga ou é eliminado pelo orifício externo da uretra em quantidades variando de pequenas gotas até muitos mililitros, dependendo do tamanho prostático (Johnston et al., 2000) A próstata é a única glândula acessória em cães, e seu tamanho e seu peso são dependentes da idade, raça e peso corpóreo (Di Santis et al., 2001). O volume de um ejaculado canino está diretamente ligado à quantidade de líquido prostático. A próstata canina, assim como a humana, tende a aumentar com o avanço da idade, como resultado de uma Hiperplasia Prostática Benigna. A maioria dos animais não castrados e com mais de cinco anos apresentam a próstata aumentada de volume e posicionada na região abdominal (Johnston, 2000; Di Santis, 2001). Rota et al. (1995) descreveram os efeitos prejudiciais do plasma seminal sobre a membrana plasmática dos espermatozóides bovinos e em seu estudo com sêmen canino, concluíram que a adição de

44 Experimento I 44 extensores aumentaria o número de células espermáticas com membrana plasmática íntegra. A freqüência de coletas apresentada por Feldman e Nelson (1996) é de uma coleta a cada 48 horas, ou de uma coleta ao dia durante 3 dias consecutivos e um repouso de 2 dias, ou, ainda, duas coletas ao dia e repouso de 2 dias, podendo ocorrer um aumento na concentração total de espermatozóides após alguns dias de repouso sexual. Alguns experimentos de congelação do sêmen canino, sem a eliminação da primeira e da terceira fração, têm sido propostos. Porém os dados obtidos até o presente sugerem que a utilização unicamente da fração espermática gera melhores resultados (Peña, 1997). A utilização da centrifugação como forma de eliminar a primeira e a terceira fração tem sido realizada em alguns protocolos de preservação do sêmen canino (Lopes e Papa, 1998; Held, 1997) A centrifugação England e Allen (1992) citaram um efeito deletério da primeira e da terceira fração do ejaculado canino sobre as características espermáticas. Explicaram ainda que, na cobertura natural, o tempo de contato do espermatozóide com estas frações é reduzido, diminuindo este efeito. Os mesmos autores pesquisaram o efeito da incubação dos espermatozóides caninos diluídos na primeira e terceira frações do ejaculado e afirmaram existir um declínio no número de espermatozóides morfologicamente normais, decorrentes dos efeitos deletérios dessas frações. Papa et al. (1981) demonstraram que a centrifugação é um método adequado para o nivelamento da grande variação de

45 Experimento I 45 qualidade e quantidade de ejaculados eqüinos, e que diversas forças e tempos de centrifugação não apresentaram efeito negativo sobre a motilidade espermática, nem sobre a sobrevivência dos espermatozóides, avaliada por meio de coloração supra vital. Estes autores observaram efeito positivo da centrifugação sobre a motilidade espermática, além de que sua intensificação não depreciou a qualidade do sêmen in vitro durante o teste de termorresistência a 5ºC e a 37ºC. Vários autores têm sugerido com êxito a centrifugação de sêmen canino antes da criopreservação (Held, 1997; Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000). Lopes e Papa (1998) verificaram uma melhora da qualidade espermática do sêmen de cão descongelado no grupo onde foi realizada a centrifugação prévia ao processo de congelação. Jasko (1994) sugere ainda que vários diluidores podem ser utilizados para pré-diluir o sêmen durante a centrifugação e que este passo garante uma boa proteção à célula espermática durante este processo. O mesmo autor sugere a utilização de um meio diluidor à base de leite desnatado para a realização de tal procedimento. O leite pasteurizado foi o primeiro diluidor descrito para a refrigeração do sêmen em cães (Harrop, 1954). Devido a sua composição e capacidade tampão, diluidores à base de leite, assim como aqueles à base de gema de ovo têm sido amplamente difundidos para conservação do sêmen em todas as espécies animais (Cunha, 1997). A lavagem dos espermatozóides remove fatores inibidores da capacitação e prostaglandinas, sendo a técnica mais comumente utilizada no preparo dos espermatozóides humanos para inseminação artificial. Técnicas avançadas de preparo dos espermatozóides, incluindo o swin-up, swin-down, diferentes gradientes de centrifugação com Percoll, colunas de Sephadex e de Ficoll têm sido utilizados para eliminar espermatozóides imóveis, células brancas ou debrís dos ejaculados

46 Experimento I 46 humanos, e têm sido relacionadas ao aumento da porcentagem de espermatozóides móveis no sêmen (Carrell, 1998). Lopes e Papa (1998) afirmaram que a centrifugação do sêmen canino em Ficoll-Paque melhora significativamente os resultados de congelação e de descongelação em meio à base de glicina-gema para a espécie. O Percoll é uma suspensão coloidal de polivinilpirrolidina (PVP) ligada a sílica e esta coligação alivia as propriedades tóxicas do gel de sílica. A maior vantagem do Percoll é não penetrar em membranas biológicas, além disso, suas soluções possuem baixas viscosidade e osmolaridade. Devido ao grande tamanho de suas partículas, a centrifugação em velocidades moderadas pode gerar um gradiente de densidade próprio, sendo desta forma a separação desejada realizada rapidamente (Gennis, 1989). Amann e Graham (1993) citaram que o processo de centrifugação do sêmen pode aumentar a peroxidação lipídica das membranas espermáticas, porém, segundo Prakash (1998), a exposição ao Percoll protege os espermatozóides da produção excessiva de radicais livres, que podem causar alterações nas funções da membrana induzindo a peroxidação lipídica. Tendo-se em vista o exposto, o objetivo do presente trabalho foi testar os efeitos do processo de centrifugação no sêmen canino e comparar a pré-diluição do sêmen em meio à base de leite desnatado e glicose, Percoll ou plasma seminal autólogo na realização deste procedimento.

47 Experimento I MATERIAL E MÉTODO 2.1. Animais Após realização de exame clínico detalhado, coleta de sangue para hemograma, pesquisa de Brucelose e Leptospirose, e de sêmen para o exame andrológico foram selecionados cinco (5) cães adultos, SRD, pesando entre 10 e 20 kg, provenientes do Biotério Central da Unesp de Botucatu, e cinco (5) cães adultos, da raça Cocker Spaniel, pesando entre 15 e 20 kg, provenientes de criatórios particulares da cidade de Botucatu-SP. Os animais provenientes do Biotério foram mantidos em canis com solário durante a fase de coleta do sêmen, os cães de criatórios particulares permaneceram em seus respectivos canis, com boas condições de higiene e alimentação durante a fase experimental. O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da Pós Graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área de Reprodução Animal da FMVZ-UNESP- Botucatu, para análise e manipulação Coleta do Sêmen O ejaculado completo foi coletado por meio de massagem peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira dentro de uma garrafa de isopor.

48 Experimento I Exame do Sêmen ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva. ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de sêmen é colocada sobre lâmina aquecida (38-40ºC) e recoberta por lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (Colégio Brasileiro de Reprodução Animal -CBRA, 1996) para o vigor. Aglutinação espermática: Foi descrita como aglutinação a observação visual e subjetiva, sob microscopia de contraste de fase, de grupos de células espermáticas aderidas cabeça-cabeça. O resultado foi descrito através de um escore variando de zero a três, onde: 0- não se observa aglutinação. 1- aglutinações esparsas, visualizadas em campos isolados. 2- aglutinações esparsas, observadas em todos os campos. 3- aglutinações muito freqüentes, em todos os campos.

49 Experimento I 49 Concentração espermática: Foi determinada através de contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em água e o número de espermatozóides expresso por ml.. Espermiograma: Foi realizado na fase de seleção de animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10 minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et al, 1986) foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e os resultados expressos em porcentagem, registrados individualmente. A classificação da patologia espermática foi feita segundo Oetllé (1988). Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se iodeto de propídio e carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic Fluorescence Attchment EFA HalogenLamp Set) e contadas 200 células classificadas como: células íntegras - células emitindo fluorescência verde, células lesadas - possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha Procedimentos experimentais Foram utilizados dez (10) ejaculados completos de dez (10) cães diferentes (n=10). Após a avaliação inicial dos parâmetros espermáticos, o ejaculado foi dividido em três partes iguais e transferido para tubos plásticos de centrífuga graduados e centrifugados a 800g por 15 minutos, formando os seguintes grupos (figura 1): G1 (n=10): 1\3 do sêmen não foi centrifugado. O sêmen foi mantido em banho Maria a 37ºC, durante a centrifugação dos outros grupos; G2 (n=10): 1\3 do sêmen foi centrifugado em plasma seminal autólogo (PSA); G3 (n=10): 1\6 do

50 Experimento I 50 sêmen foi diluido 1:1 em meio à base de leite desnatado e glicose (LG) (Kenney et al., 1975) (ANEXO II); G4 (n=10): 1\6 do sêmen foi centrifugado sobre diferentes gradientes de Percoll (Sigma) (ANEXO III) (figura 1). Protocolo Diluidor Não centrifugado Plasma seminal autólogo (PSA) G1 (1/3 do sêmen) Leite desnatado e glicose (LG) Percoll Centrifugado G2 (1/3 do sêmen) G3 (1/6 do sêmen) G4 (1/6 do sêmen) FIGURA 1 Esquema de formação dos grupos experimentais. Após a centrifugação, foi descartado o sobrenadante de todos os grupos centrifugados. Foram retirados 10µl do pellet para avaliação da integridade das membranas espermáticas, através do teste fluorescente, descrito por Cunha et al. (1996) onde os espermatozóides foram incubados junto aos corantes fluorescentes e avaliados sob iluminação epifluorescente (400x). Os pellets foram então ressuspendidos em 2ml de LG. A mesma quantidade do mesmo diluidor foi acrescida ao G1. Todos os grupos foram avaliados quanto a motilidade e vigor espermático (M1). As amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC. Decorridos 30 minutos de incubação (M2), as amostras foram novamente avaliadas quanto à motilidade e o vigor espermático.

51 Experimento I Métodos Estatísticos Utilizados Para as variáveis motilidade e vigor, foi utilizada a análise de perfil, visando comparar os 4 grupos caracterizados por: G1- grupo controle da centrifugação, G2- grupo controle dos diluidores, G3- grupo Kenney, G4 - grupo Percoll, em cada um dos dois momentos: M1- logo após a centrifugação, M2- após imersão das amostras centrifugadas em banho Maria a 37ºC por 30 minutos. Também pela análise de perfil pôdese comparar cada grupo, os momentos através dos valores médios observados nas amostras. Para a variável aglutinação a comparação entre os grupos foi feita pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, em cada momento, e pelo teste de Friedman, utilizando os valores medianos amostrais, compararam-se para cada grupo os momentos. Para a variável porcentagem de células íntegras, foi utilizada a análise de variância de um delineamento inteiramente casualizado com 4 tratamentos (grupos) e 10 repetições. Nesta análise, utilizou-se a transformação arc sen % visando a normalização da distribuição dos dados amostrais.

52 Experimento I RESULTADOS Imediatamente após a centrifugação não houve diferença estatística significativa quanto à motilidade espermática entre os grupos. Porém, após 30 minutos de incubação em banho Maria a 37ºC os grupos centrifugados apresentaram-se significativamente superiores ao grupo onde não houve centrifugação (G2=G3=G4>G1) quanto à motilidade espermática (tabela 1). TABELA 1- Valores médios de motilidade espermática (%) do sêmen de cães, nos os 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, M1 M2 G1 71aA 47aB G2 79aA 61bB G3 79aA 67bB G4 74aA 63bB para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) Em todos os grupos estudados, verificou-se diminuição significativa da motilidade espermática após a incubação (M2< M1) (tabela 1).

53 Experimento I 53 TABELA 2- Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, M1 M2 G1 3,2aA 2,aB G2 3,7aA 2,7abB G3 3,8aA 3,1bB G4 3,5aA 3bA para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) O vigor espermático imediatamente após a centrifugação (M1) não diferiu significativamente entre os grupos (G1=G2=G3=G4). Porém, quando se comparou o vigor espermático dos grupos decorridos 30 minutos de incubação, verificou-se superioridade dos grupos centrifugados em diluidor LG (G3) e em diferentes gradientes de Percoll (G4) (tabela 2). Decorridos os 30 minutos de incubação não foi observada diminuição significativa do vigor espermático no grupo centrifugado em diferentes gradientes de Percoll (M1=M2) (tabela 2). TABELA 3- Valores medianos da aglutinação espermática do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, M1 M2 G1 0A 0A G2 0A 1,5B G3 0A 0A G4 0A 1,5B em cada grupo, mediana de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)

54 Experimento I 54 Verificou-se aumento significativo de aglutinação espermática após a incubação em banho Maria a 37ºC nos grupos centrifugados em PSA (G2) e naqueles centrifugados em diferentes gradientes de Percoll (G4). Não houve diferença estatística significativa entre os grupos em nenhum dos momentos (tabela 3) TABELA 4- Porcentagem média de células espermáticas íntegras transformadas em arc sen x (em rad) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após as centrifugações (M1). Botucatu, média desvio padrão médias originais G1 1,38a 0,155 98,2 G2 1,43a 0,141 99,0 G3 1,41a 0,190 98,7 G4 1,38a 0,151 98,2 médias de grupos seguidos de letras iguais, não diferem estatisticamente (p>0,05). Não se verificou diferença estatística significativa quanto à integridade das membranas espermáticas entre os grupos estudados imediatamente após as centrifugações (tabela 4).

55 Experimento I DISCUSSÃO Os ejaculados caninos apresentam grande variação em seu volume devido, principalmente, à diferenças individuais. Entre animais, esta variação deve-se à diferença de tamanho entre raças ou mesmo devido a características individuais, como a idade ou tamanho da próstata. Individualmente pode-se verificar diferenças de volume entre dois ejaculados devido à atividade sexual no período da coleta ou mesmo em conseqüência do envelhecimento deste animal. Todas as diferenças de volume acima descritas devem-se, exclusivamente, a alterações fisiológicas comuns e inerentes à espécie canina (Cunha, 1998). Para que um protocolo de congelamento de sêmen seja estabelecido, estas diferenças de volume que, conseqüentemente, levarão a uma diferença de concentração espermática por mililitro de ejaculado, devem ser eliminadas, possibilitando desta forma um tratamento semelhante a cada célula espermática, no que diz respeito à diluição, à concentração de crioprotetor no meio que a circunda, ao envase e ao volume da dose inseminante (Papa, 1987; Lopes e Papa, 1998; Dell aqua Junior, 2000). Vários autores (Held, 1997; Lopes e Papa, 1998; Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000) têm descrito metodologias de criopreservação do sêmen canino utilizando a centrifugação como forma de eliminar plasma seminal e padronizar o volume do ejaculado. Os dados encontrados neste experimento concordam com estes autores, já que verificamos que a centrifugação não alterou a qualidade espermática no que diz respeito à motilidade e vigor espermático e à integridade das membranas espermáticas.

56 Experimento I 56 A associação da retirada do plasma seminal através da centrifugação com a adição de uma solução de centrifugação, com propriedades protetoras e ação de tampão, pode ser uma alternativa viável para a eliminação do plasma seminal, sabidamente deletério ao espermatozóide canino, prolongando a sobrevida dos espermatozóides. Após a cobertura natural o metabolismo espermático no trato genital feminino é intenso, este acontecimento fisiológico pode ser mimetizado em condições laboratoriais incubando-se o sêmen a uma temperatura de 37ºC por um determinado período, este aumento de metabolismo é responsável pelo aumento da produção de catabólitos tóxicos que, em contato com a célula espermática, induzirem danos à integridade funcional e morfológica da célula espermática (Amann e Graham, 1993). Verificamos que o sêmen centrifugado em Percoll ou em LG, após incubado em LG por 30 minutos, apresentou melhor vigor espermático que o sêmen incubado em mesmas condições e previamente centrifugado sem solução de centrifugação ou não centrifugado. Provavelmente, substâncias presentes nos diluidores de centrifugação proporcionaram maior atividade tampão, antioxidante e substrato para metabolismo (G3) ou uma melhor lavagem das substâncias nocivas presentes no plasma seminal (G4) fazendo que o vigor fosse mantido por um período mais longo. Verificamos, porém, que, após a centrifugação em diferentes gradientes de Percoll e a completa eliminação do plasma seminal houve também um aumento a aglutinação cabeça-cabeça das células espermáticas, mesmo tendo sido estes espermatozóides acrescidos de um diluidor durante a incubação a 37ºC. Sabendo-se que o potencial de membrana, que se reflete como uma característica de carga elétrica positiva ou negativa à membrana externa do espermatozóide, pode ser alterado pelos radicais

57 Experimento I 57 de hidrato de carbono ligados a lipídios e proteínas constituintes da membrana (Amann e Graham, 1993) e, lembrando-se ainda, que estas ligações podem se desfazer com certa facilidade (Gennis, 1989), sugerimos que o Percoll possa ter realizado uma lavagem de radicais glicosilados ligados à membrana espermática promovendo alterações de cargas elétricas de algumas células espermáticas. Como conseqüência deste desequilíbrio elétrico, as células espermáticas podem ter se agregado umas as outras na dependência da característica de repulsão ou de atração de cargas elétricas presentes em sua superfície externa. Após a avaliação dos nossos dados verificamos que a centrifugação do sêmen canino não afetou a qualidade do movimento espermático e a integridade das membranas e ainda que a centrifugação em meio à base de leite desnatado e glicose conferiu maior manutenção da qualidade do movimento espermático durante a incubação em banho Maria a 37 C.

58 Experimento II Experimento II

59 Experimento II 59 EFEITO DE DIFERENTES PERÍODOS DE EQUILÍBRIO E MOMENTOS DE GLICEROLIZAÇÃO SOBRE O SÊMEN CANINO 1. REVISÃO DE LITERATURA A principal função de uma célula espermática é a fertilização de um óvulo, e para que isso ocorra, o espermatozóide necessita das habilidades adquiridas a cada passo da maturação espermática. Pode-se dizer que a maturação de um espermatozóide se inicia nos túbulos seminíferos dos testículos, e só é finalizada, quando se dá o encontro e a união do gameta masculino com o gameta feminino (Watson, 1995). Para que a preservação de uma célula espermática seja realizada com sucesso, cada passo desta maturação celular deve ser respeitado e viabilizado e, ainda, é necessário que cada etapa seja realizada exatamente em seu devido momento (Kirk, 2001). O resfriamento da célula espermática (39~25ºC até ~0ºC) é o primeiro momento crítico dentro do processo de preservação pelo frio. Dentro deste procedimento alterações na membrana espermática, ocasionando danos à sua estrutura e função, podem ocorrer. Estas modificações são conhecidas como efeito de fase transicional (Gennis, 1989; Jasko, 1994; Zúccari, 1998; Holt, 2000; Kirk, 2001). Os espermatozóides caninos, assim como todas as outras células são circundadas por uma membrana plasmática, que define a delimitação da célula, separando seu conteúdo do meio externo. Da

60 Experimento II 60 mesma forma, como as membranas biológicas de outras células, as membranas dos espermatozóides são extremamente especializadas às funções a elas atribuídas (Watson, 1995). Quando em temperatura ambiente ( 25ºC) ou próxima à temperatura corpóre da espécie em questão, a membrana espermática, assim como qualquer membrana biológica encontra-se em conformação de bicamada fluida de fosfolipídios e proteínas, como descrito por Singer e Nicolson em Dentre os fosfolipídios integrantes da membrana existem aqueles aos quais a conformação de monocamada seria mais adequada, devido, principalmente, à conformação da sua cabeça polar (Gennis, 1989). Estes fosfolipídios encontram-se geralmente próximos às proteínas integrantes das membranas. Com a diminuição da temperatura os fosfolipídios se agrupam formando micelas dentro da membrana espermática e, em alguns casos, quando se reaquece a membrana, os fosfolipídios não se misturam completamente aos outros elementos, mudando desta forma a conformação da membrana (Amann e Graham, 1993). Para evitar ou minimizar as alterações que podem ocorrer durante a refrigeração celular este processo deve ser realizado de maneira controlada e agentes crioprotetores devem ser adicionados ao meio diluidor de sêmen (Aman e Graham, 1993; Zúccari, 1998; Kirk, 2001). A inclusão de um crioprotetor ao meio diluidor é de vital importância para o sucesso da preservação pelo frio. O crioprotetor mais utilizado, quando se deseja congelar sêmen canino, é o glicerol, porém o mesmo agente de crucial importância no processo de congelação exerce um efeito tóxico sobre a célula espermática (England, 1992, Farstad, 1996; Peña et al., 1998).

61 Experimento II 61 A eficácia e praticidade de um grande número de crioprotetores permeáveis ou não às células que diminuem a formação e o tamanho dos cristais de gelo intracelulares, têm sido testados quanto a sua utilização no resfriamento de células espermáticas (De Leeuw et al., 1993). O glicerol é um crioprotetor intracelular e sabe-se que sua principal função como crioprotetor se dá na regulação do fluxo de água para a célula espermática controlando, desta forma, a desidratação, minimizando o efeito de solução, que é um dos pontos críticos do processo de congelamento celular (Peña, 1997). Além da regulação osmótica do glicerol existem ainda evidências de que ele se liga aos grupos hidrofílicos da cabeça dos fosfolipídios regulando a fluidez das membranas e às proteínas integrais e glicoproteinas causando um agrupamento das partículas intramembranosas (Parks e Graham, 1992). Os agentes crioprotetores intracelulares, particularmente o glicerol, exercem seu maior papel de crioproteção durante a cristalização (-10 ~ -15ºC), onde os efeitos de solução e de recristalização podem afetar negativamente a morfofisiologia da célula espermática (Zúccari, 1998; Holt, 2000), portanto, sua inclusão em um meio diluidor pode ser realizada a temperaturas mais baixas sem que isso atrapalhe seus efeitos benéficos. Polge (1957) indicou que a sobrevivência espermática pós-descongelação era superior quando o glicerol era acrescido a 5ºC. Miller e Vandertmark (1962) demonstraram que a porcentagem de espermatozóides móveis era maior quando o glicerol era acrescido a temperatura de 4,5ºC ao invés de 10ºC.

62 Experimento II 62 O momento ideal para a adição do glicerol durante o processo de congelação/descongelação do sêmen canino também tem sido estudado. Rohloff (1978) não encontrou diferença entre a adição de um diluente glicerolizado ao sêmen canino a 25 ou a 5ºC. Fontbonne e Badinand (1993) concluíram que o glicerol pode ser adicionado ao sêmen canino à temperatura ambiente durante a primeira fase de diluição. Em sua revisão, Salisbury e vandemark (1978) afirmaram que os danos espermáticos são superiores quando a temperatura de exposição ao glicerol é maior que 5ºC. Os mesmos autores verificaram ainda que a motilidade e a capacidade fecundante dos espermatozóides bovinos pós-descogelação aumentam quando existe um intervalo entre a adição do glicerol e o início da congelação, e que esta etapa pode ser chamada de período de equilíbrio. England (1992) sugeriu que o sêmen de várias espécies animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação para que desenvolva uma máxima resistência aos efeitos do congelação e concluiu ainda que o tempo de equilíbrio pode ser extremamente variável de acordo com o protocolo de congelação/descongelação e ainda de acordo com a espécie em questão. Watson (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada do glicerol como se acreditava anteriormente, mas também permite que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram. England (1992) comprovou que uma curva de resfriamento (39ºC até 4ºC) em nove minutos e um tempo de equilíbrio de 4 horas e posterior congelação/descongelação conferiu maior viabilidade ao sêmen canino.

63 Experimento II 63 Rota (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen canino a 4ºC durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era atingida após 45 minutos de resfriamento. Olar et al. (1989) concluíram que a curva de refrigeração de 1 hora com um período de equilíbrio a 5ºC de 1 hora era favorável na preservação do sêmen canino. Porém, estes autores só conseguiram chegar a tal conclusão sobre a superioridade desta curva após congelarem e descongelaram as amostras de sêmen. Em vista da diversidade entre os protocolos para a congelação do sêmen canino, que apresentam grandes diferenças entre os tempos de equilíbrio e ainda no momento ideal para a adição do glicerol, é que tivemos como objetivo do presente estudo: testar um período de equilíbrio ideal para o sêmen canino congelado em um meio diluidor á base de glicina e gema de ovo e em um outro diluidor á base de TRIS, ácido cítrico e glicose. E ainda, verificar os efeitos da adição do glicerol à temperatura ambiente ou a 5ºC sobre a viabilidade espermática e sobre a integridade de suas membranas.

64 Experimento II MATERIAL E MÉTODO 2.1. Animais Foram utilizados dez cães: dois (2) SRD, um (1) Pointer, quatro (4) Cocker Spaniel, um (1) Pastor Alemão, um (1) Dog Alemão, um (1) Fox Terrier, sendo um SRD proveniente do Biotério Central da Unesp de Botucatu e todos os outros cães provenientes de criatórios particulares da cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados apresentaram-se em perfeitas condições para participação neste projeto. O cão proveniente do biotério foi mantido em canil com solário pertencente à pós-graduação durante a fase de coleta do sêmen. Os cães de criatórios particulares permaneceram em seus respectivos canis. Todos os animais foram mantidos sob ótimas condições de higiene e conforto durante a fase experimental. O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da pós-graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área de Reprodução Animal da FMVZ- UNESP- Botucatu, para análise e manipulação Coleta do Sêmen Foram realizadas trinta (30) coletas de sêmen de dez (10) cães. Cada ejaculado completo foi coletado por meio de massagem peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira dentro de uma garrafa de isopor.

65 Experimento II Exame do Sêmen ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva. ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de sêmen é colocada sobre lamina aquecida (38-40ºC) e recoberta por lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (CBRA, 1996) para o vigor. Concentração espermática: Foi determinada através de contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em água e o número de espermatozóides expressos por ml. Espermiograma: Foi realizado na fase de seleção de animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10 minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et al, 1986), foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e os resultados expressos em porcentagem, e registrados individualmente. A classificação das patologia foi feita segundo Oetllé (1988). Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto

66 Experimento II 66 de Propídio e Carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon-Episcopic Fluorescence Attchment EFA HalogenLamp Set) e contadas 200 células classificadas como: células íntegras- células emitindo fluorescência verde, células lesadas- possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha Procedimentos Experimentais Foram utilizados dez (10) cães sendo que cada cão doou três (3) ejaculados completos em dias diferentes (n=30). Após a avaliação inicial dos parâmetros espermáticos, cada ejaculado foi dividido em duas partes iguais contendo cada qual 200 milhões de espermatozóides (sptz) em média. As metades foram centrifugadas em 800g por 5 minutos diluídos 1:1 em meio à base de leite desnatado e glicose (ph- 6,91; 330mosm). Descartado o sobrenadante, um pellet foi ressuspendido em 2,14 ml de diluidor Glicina-Gema (GG) sem glicerol (ph-7,0; 318mosm) (ANEXO II). Do total desta amostra, 1,07 ml foi acrescido de 0,93 ml de diluidor GG com 12,8% de glicerol, segundo Lopes e Papa (1998) e envasados em 4 palhetas de 0,5 ml contendo em média 25 milhões de sptz cada. A outra metade da amostra (1,07 ml) foi mantida em um tubo de centrifuga (20ml) plástico fechado. O outro pellet foi ressuspendido em 2ml de diluidor TRIS (ANEXO II) com 3% de glicerol (ph-6,39; 685mosm). Do total desta mostra, 1ml foi acrescido de 1ml de diluidor TRIS com 7% de glicerol (Rota, 1997) e envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo em média 25

67 Experimento II 67 milhões de sptz cada. A outra metade da amostra (1ml) foi mantida em tubo de centrifuga (20ml) plástico fechado. Neste momento foram avaliadas amostras de cada tratamento quanto à motilidade e ao vigor espermático (M1) segundo protocolo descrito anteriormente. As amostras foram levadas ao refrigerador 5 C e ali mantidas durante o período de equilíbrio designado. Foram testados períodos de equilíbrio de 40 (n=10), 60 (n=10) ou 90 (n=10) minutos. Foi utilizado um ejaculado diferente de um mesmo cão para o teste de cada tempo de equilíbrio. Desta forma foram formados 12 grupos experimentais, sendo eles (figura 1) : G1- sêmen diluído em meio GG com glicerolização antes dos 40 minutos de equilíbrio; G2- sêmen diluído em meio GG com glicerolização antes dos 60 minutos de equilíbrio; G3- sêmen diluído em meio GG com glicerolização antes dos 90 minutos de equilíbrio; G4- sêmen diluído em meio GG com glicerolização posterior aos 40 minutos de equilíbrio; G5- sêmen diluído em meio GG com glicerolização posterior aos 60 minutos de equilíbrio; G6- sêmen diluído em meio GG com glicerolização posterior aos 90 minutos de equilíbrio; G7- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total antes dos 40 minutos de equilíbrio; G8- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total antes dos 60 minutos de equilíbrio; G9- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total antes dos 90 minutos de equilíbrio; G10- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total posterior aos 40 minutos de equilíbrio; G11- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total posterior aos 60 minutos de equilíbrio; G12- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total posterior aos 90 minutos de equilíbrio.

68 Experimento II 68 Diluidor Glicina (GG) TRIS Período de equilíbrio Glicerolização antes do equilíbrio G1 G2 G3 G7 G8 G9 Glicerolização após o equilíbrio G4 G5 G6 G10 G11 G12 FIGURA 1 Esquema de formação dos grupos experimentais. Para cada ejaculado coletado de cada cão, lembrando-se que cada cão doou 3 ejaculados, foram realizados os procedimentos dos grupos: G1, G4, G7 e G10 para um ejaculado; G2, G5, G8 e G11 para outro ejaculado e G3, G6, G9 e G12 para um terceiro ejaculado. A escolha do período de equilíbrio utilizado em cada ejaculado diferente de cada cão foi estabelecida de maneira completamente aleatória. Decorrido o período de equilíbrio designado, o grupo diluído em GG e glicerolizado após o equilíbrio (G4, G5 ou G6) foi acrescido de 0,93 ml do mesmo diluidor com 12,8%, de glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo 25 milhões de sptz em média cada, ficando cada amostra com concentração final de 5% de glicerol. O grupo diluído em TRIS com glicerolização parcial após do equilíbrio (G10, G11 ou G12) foi acrescido de 1 ml do mesmo diluidor com 7% de glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo 25 milhões de sptz em média cada, ficando cada amostra com concentração final de 5% de glicerol. Todas as amostras foram então aquecidas por 10 minutos a 37 C e avaliadas (M2) quanto à motilidade e ao vigor espermático através de microscopia de contraste de fase e quanto à integridade das membranas espermáticas sob microscopia epifluorescente, com o uso de sondas fluorescentes como já descrito anteriormente.

69 Experimento II Métodos Estatísticos Utilizados Para a comparação entre dois momentos no mesmo tratamento: prova não paramétrica de Wilcoxon para pequenas amostras pareadas, com o cálculo da estatística p. Para a comparação entre tratamentos em cada momento: prova não paramétrica de Friedmam com o cálculo das estatísticas χ 2 e p. As estatísticas calculadas foram consideradas significativas quando p<0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida tendência à significância, já que p é a probabilidade de erroneamente concluir pela significância.

70 Experimento II RESULTADOS Logo após as primeiras diluições do sêmen com os diluidores não se verificou diferença estatística significativa de motilidade espermática entre os períodos de equilíbrio de 40, 60 ou 90 minutos entre os tratamentos (p>0,05). Quando verificado o efeito de tratamento em cada período de equilíbrio distinto, nos grupos tratados com diluidor TRIS, quando a glicerolização total seria efetivada após o equilíbrio de 40 e de 90 minutos (G10 e G12), houve, no entanto, tendência à superioridade (p<0,10) (tabela 1). TABELA 1- Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, Glicerolização antes do equilíbrio GG Glicerolização após o equilíbrio Glicerolização antes do equilíbrio TRIS Glicerolização após o equilíbrio G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 M a 80a a 85* 80a 80a* M b 75b 80* 80 70b 80* 80b 70b Para cada grupo, momentos seguidos de letras diferentes diferem estatisticamente (p<0,05). *indica tendência à superioridade entre dados em uma mesma linha (p<0,10)

71 Experimento II 71 Quando a motilidade espermática foi avaliada após os períodos de equilíbrio e após a realização de todas as glicerolizações (M2), os grupos propostos não apresentaram diferença estatística significativa (p>0,05), porém podemos verificar que os grupos tratados com diluidor TRIS, tendo sido estes glicerolizados totalmente antes ou após o equilíbrio de 40 minutos (G7 e G10), apresentaram tendência à superioridade para esta variável (p<0,10) (tabela 1). Quando o diluidor GG foi avaliado no M2 (após o período de equilíbrio), a motilidade espermática dos períodos de 40, 60 ou 90 minutos de equilíbrio não diferiu estatisticamente (p>0,05), tanto nos grupos onde a glicerolização foi efetuada antes como após o período de equilíbrio. TABELA 2 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos grupos tratados com meio TRIS Botucatu, G7 G8 G9 G10 G11 G12 M M2 80* 80* 70 80* 80* 70 *indica superioridade entre dados em uma mesma linha (p<0,05) Quando contrastados os grupos onde o diluidor TRIS foi utilizado, após a glicerolização total de todos os grupos (M2), tendo sido a glicerolização realizada antes ou após o equilíbrio, os períodos de 40 e 60 minutos de equilíbrio se apresentaram estatisticamente superiores ao equilíbrio de 90 minutos (tabela 2).

72 Experimento II 72 TABELA 3- Mediana do vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães avaliado antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, Glicerolização antes do equilíbrio GG Glicerolização após o equilíbrio Glicerolização antes do equilíbrio TRIS Glicerolização após o equilíbrio G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 M Aa 4Aa 3Aa Aa 4Aa 3Aa M2 3A* 3A* 2A 3Ab* 2,5Ab* 2Ab 3B* 3B* 2B 3Bb* 3Bb* 2,5Bb Para cada grupo, valores seguidos de letras minúsculas diferentes diferem estatisticamente (p<0,05). Para um momento. valores seguidos de letras maiúsculas diferentes diferem estatisticamente (p<0,05) * indica diferença estatística significante entre os períodos de 40, 60 e 90 minutos de equilíbrio (p<0,05) Verificamos diferença estatística significante entre os valores de vigor avaliados antes e após a glicerolização para os grupos onde esta foi realizada após o equilíbrio (G4, G5, G6, G10, G11 e G12) (tabela 3). Para o vigor espermático, após as primeiras diluições do sêmen com os diluidores (M1), verificou-se uma superioridade significante nos grupos onde a glicerolização seria realizada após o período de equilíbrio (G4, G5, G6, G10, G11 e G12) sobre os grupos onde a glicerolização foi efetivada antes do período de equilíbrio (G1, G2, G3, G7, G8 e G9) (tabela 3). Quanto ao vigor espermático avaliado após o período de equilíbrio (M2), verificamos que os grupos tratados com o meio diluidor TRIS apresentaram resultados significativamente superiores (p<0,05) aos resultados apresentados pelos grupos tratados com meio GG (tabela3).

73 Experimento II 73 Verificamos ainda que, de maneira geral, não houve diferença estatística significante entre os grupos que receberam a glicerolização antes ou após o período de equilíbrio. Houve um efeito significativo de duração do período de equilíbrio sendo, no geral, os tempos de 40 e 60 minutos equivalentes e significativamente superiores ao equilíbrio de 90 minutos quanto ao vigor espermático. TABELA 4- Mediana da porcentagem de células íntegras no sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, GG TRIS Glicerolização antes do equilíbrio Glicerolização após o equilíbrio Glicerolização antes do equilíbrio Glicerolização após o equilíbrio G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 M2 95a 93a 82b 96a 92a 83b 96a 94,5a 90,5b 97,5a 94a 89b Valores seguidos de letras diferentes diferem estatisticamente (p<0,05) A porcentagem de células espermáticas íntegras sofreu efeito de tempo, sendo que, naqueles grupos onde o período de equilíbrio foi de 90 minutos os valores foram significativamente inferiores (p<0,05). Quando os dados foram contrastados para verificar se houve efeito de tratamento verificamos que aos 40 e 60 minutos de equilíbrio os meios GG (com glicerolização antes ou após) e os meios TRIS (com glicerolização total antes ou após) obtiveram porcentagem de células espermáticas íntegras estatisticamente equivalentes (p>0,05).

74 Experimento II DISCUSSÃO Para que os resultados de congelação de sêmen dos cães resultem em melhores resultados de fertilidade in vivo, vários passos do protocolo de congelação do sêmen canino vêem sendo testados e aprimorados (Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000). A glicerolização é um passo necessário na congelação do sêmen, porém é sabido que o glicerol exerce também um efeito tóxico sobre a célula espermática. Quando a glicerolização é realizada a 5 ºC este efeito tóxico pode ser minimizado devido, principalmente, à diminuição da taxa de entrada de glicerol nas células espermáticas, levando a uma desidratação mais lenta destas células (Parks e Graham, 1992). Em nosso experimento buscamos contrastar os efeitos da glicerolização a 37ºC e a 5ºC e verificamos que, de uma maneira geral, a glicerolização antes ou após o equilíbrio não apresentou diferenças significantes para as variáveis avaliadas, concordando tanto com as afirmativas de Fontbonne e Badinand et al.(1993), que concluíram que o glicerol pode ser adicionado ao sêmen canino à temperatura ambiente durante a primeira fase de diluição como com as de Rota (1998) que indica a glicerolização a 5ºC. Devemos ressaltar, entretanto, que, em nosso experimento, as últimas avaliações foram realizadas antes do congelamento e descongelamento das células espermáticas. Sabemos que as maiores injúrias celulares são causadas no momento da congelação e descongelação das células. Segundo Holt (2000), os efeitos deletérios da desidratação (durante a congelação) e posterior hidratação das células espermáticas (durante a descongelação) são as etapas críticas do processamento do sêmen podendo traduzir as

75 Experimento II 75 maiores alterações morfofuncionais às células espermáticas. Podemos aqui especular que alguma diferença entre os grupos quanto ao momento de glicerolização poderia ter sido verificada após a finalização do processo, ou seja, após a congelação e descongelação das amostras, como verificado por Olar (1984). Verifica-se, na literatura atual que o tempo necessário para que a célula espermática se estabilize em um meio diluidor é extremamente variável entre os protocolos existentes (Olar, 1984; England, 1992; Lopes e Papa, 1998; Rota, 1998). Este tempo depende, principalmente, dos constituintes do diluidor e do protocolo adotado para um determinado diluidor, porém depende ainda de características dos espermatozóides de uma determinada espécie e do indivíduo (Rota, 1997; Holt, 2000). Para que a congelação se torne um processo rápido e ágil busca-se o menor tempo de equilíbrio, porém todos os benefícios advindos deste procedimento devem ser garantidos às células espermáticas em questão. Em nosso experimento testamos três diferentes tempos de equilíbrio, 40, 60 e 90 minutos. Notamos que, para a variável motilidade espermática, quando as amostras foram equilibradas por 40 minutos (G1, G4, G7, G10), não houve diferença estatística significante entre os valores verificados antes (M1) e após (M2) o equilíbrio (tabela 1). Nos grupos onde a glicerolização foi realizada após o equilíbrio, sendo ele de 60 ou de 90 minutos, verificamos um decréscimo da motilidade durante o equilíbrio, sendo os valores de M1 significativamente maiores que os de M2. Lembramos aqui que o glicerol exerce um efeito tóxico à célula espermática e, imediatamente após a inclusão do glicerol, podemos claramente verificar uma alteração no

76 Experimento II 76 padrão de movimentação espermática advinda desta toxicidade (Watson, 1981; England, 1992). O vigor espermático em todos os períodos de equilíbrio foi significativamente menor quando a glicerolização foi realizada após o equilíbrio. Provavelmente, nos protocolos aqui propostos, as células espermáticas precisem de um tempo maior para que o influxo de glicerol seja equilibrado e para que a célula recobre sua movimentação normal, como recomendado por Watson (1981). Salientamos mais uma vez que a última avaliação foi realizada imediatamente após o equilíbrio e que a congelação e descongelação das amostras não foi realizada. O número de células espermáticas íntegras foi maior nos grupos onde foram realizados 40 e 60 minutos de equilíbrio sendo que, nestes mesmos períodos de equilíbrio, não verificamos também influência do meio diluidor sobre a integridade das células espermáticas. Olar et al. (1989) verificaram que os efeitos de diferentes períodos de equilíbrio sobre a motilidade espermática só foram observados após a congelação e a descongelação do sêmen canino. Estes autores só puderam constatar a superioridade de uma curva de refrigeração de 1 hora com equilíbrio de 1 h sobre a de 1h com equilíbrio de 2 horas após a descongelação das amostras. Quando buscamos um protocolo de congelação procuramos o mais rápido, ágil e eficiente. Tendo-se em vista estas premissas podemos concluir que os períodos de 40 e 60 minutos foram superiores aos de 90 minutos e que a glicerolização anterior ao equilíbrio, em nossas condições, apresentou-se vantajosa frente a glicerolização pós-equilíbrio, tanto pela praticidade como pela tendência dos resultados aqui verificados, porém, como discutido acima, a avaliação da viabilidade espermática após a congelação e descongelação das amostras fazem-se necessárias para que os dados aqui encontrados sejam confirmados.

77 Experimento III Experimento III

78 Experimento III 78 EFEITO DE DIFERENTES PERÍODOS DE EQUILÍBRIO E DE DIFERENTES DILUIDORES NA CONGELAÇÃO DO SÊMEN CANINO 1. REVISÃO DE LITERATURA A globalização, processo que provocou drásticas mudanças no cenário mundial, contribuiu para que proprietários de cães se interessassem pelas mais diversas raças. Exemplares de muitas delas não estão disponíveis no mercado nacional, a mesma realidade é enfrentada em outros países. A congelação e o transporte de gametas podem servir para transpor barreiras de distância e tempo, viabilizando o trânsito de sêmen de machos melhoradores ou mesmo de raças exóticas, com menores despesas e riscos para proprietários e animais. Soma-se a este fato, a possibilidade da utilização do cão como modelo experimental para aperfeiçoamento de biotecnologias para a conservação de gametas de canídeos selvagens. Desde que Seager em 1969 relatou a 1 gestação e parto proveniente de uma inseminação artificial (IA) com sêmen canino congelado, várias etapas deste processo vêm sendo testadas e aperfeiçoadas na tentativa de obtenção de melhores resultados de fertilidade in vivo. Estudos realizados com sêmen congelado de cães mostraram que o espermatozóide descongelado não demonstra a mesma vitalidade do sêmen fresco ou refrigerado, conseqüentemente, sua

79 Experimento III 79 sobrevivência no trato genital feminino é reduzida ( Gill et al., 1970; Olar, 1984; Oettlé, 1986; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Morton e Bruce, 1989; Brown, 1992; Linde-Forsberg, 1995; Rota et al., 1995; England e Ponzio, 1996). Apesar das dificuldades encontradas no processo de congelação do sêmen canino, Linde-Forsberg et al. (1999) analisaram dados de 327 inseminações artificiais realizadas de 1983 a 1995 utilizando sêmen congelado pelo método CLONE (Cryogenetic Laboratories) e constataram taxas de nascimento maiores de 70% quando o sêmen descongelado apresentava mais de 40% de motilidade espermática no momento da inseminação. O meio diluidor utilizado para a congelação do sêmen deve fornecer energia metabolizável para que os espermatozóides mantenham-se viáveis após o processo de descongelação, apresentar um ph e osmolaridade compatíveis com os espermatozóides de cada espécie, levando-se em consideração que a habilidade dos espermatozóides em resistir a refrigeração e ao congelamento difere entre as espécies animais (Farstad, 1996). Para a congelação do sêmen, o diluidor deve ainda conter um crioprotetor. O glicerol é largamente utilizado para a congelação do sêmen dos animais domésticos, entretanto, apresenta um efeito tóxico sobre os espermatozóides, envolvendo todas as zonas da membrana espermática. A concentração final de glicerol usada para a congelação do sêmen canino varia, geralmente, de 2 a 10% (Olar, 1984; Farstad, 1996, Peña et al., 1998). O meio diluidor à base de TRIS, Ácido Cítrico e Glicose vem se mostrando bastante viável na refrigeração e no congelamento do sêmen canino (Olar, 1984; Rota, 1998; Santos et al.; 1999; Strom Holst, 1999; Peña, 2000).

80 Experimento III 80 O meio diluidor à base de glicina - gema de ovo apresenta excelentes resultados quando utilizado na congelação do sêmen nas espécies bovina (Bicudo et al., 1993), equina (Papa et al., 1993), ovina (Gonzales, 1996) e na refrigeração e congelação do sêmen canino (Lopes e Papa, 1996; Cunha, 1997; Santos et al., 1999). A utilização de um diluidor denominado M9, composto de 33% de meio Merck-gema (Martin et al., 1979), 33% de meio à base de leite desnatado e glicose (Kenney et al., 1975) e 33% de DME (Sigma) acrescido de glicerol até a concentração final de 5%, melhorou os resultados de congelação do sêmen eqüino (Neves Neto, et al. 1999; Dell Aqua Junior, 2000). De acordo com Watson (1979) e Jasko (1994), antes da congelação, os espermatozóides devem permanecer um determinado período de tempo a uma temperatura de equilíbrio, para que ocorra diminuição do metabolismo espermático e para que iniciem as interações com os componentes do meio diluidor antes do estresse do congelamento, diminuindo, dessa forma, os riscos de um choque térmico. O período de equilíbrio ideal pode variar para cada espécie animal e para cada diluidor utilizado (Chacur, 1996). Tendo em vista a diversidade de protocolos para a congelação do sêmen canino tivemos como objetivo no presente experimento: verificar os efeitos de dois diferentes períodos de equilíbrio com uma mesma curva de resfriamento e três diferentes diluidores sobre a motilidade e o vigor espermáticos e sobre a integridade das membranas do sêmen canino congelado e descongelado a 37 0 C por 30 segundos.

81 Experimento III MATERIAL E MÉTODO 2.1. Animais Foram utilizados cinco (5) cães sendo: três (3) SRD, um (1) Weimaraner e um (1) Pointer. Os cães SRD foram provenientes do Biotério Central da Unesp de Botucatu e os outros cães provenientes de criatórios particulares da cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados apresentaram-se em boas condições para participação neste projeto. Os cães provenientes do biotério foram mantidos em canil com solário pertencente a pós-graduação durante a fase de coleta do sêmen. Os cães de criatórios particulares permaneceram em seus respectivos canis. Todos os animais foram mantidos sob ótimas condições de higiene e alimentação durante o experimento. O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da pós-graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área de Reprodução Animal da FMVZ UNESP-Botucatu, para análise e manipulação Coleta do Sêmen Foram realizadas duas coletas de sêmen de cada cão, sendo as coletas de um mesmo cão realizadas em dias diferentes (n=10). Cada ejaculado completo foi coletado por meio de massagem peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira dentro de uma garrafa de isopor.

82 Experimento III Exame do Sêmen ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva. ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de sêmen é colocada sobre lamina aquecida (38-40ºC) e recoberta por lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (CBRA, 1996) para o vigor. Concentração espermática: Foi determinada através de contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em água e o número de espermatozóides expressos por ml. Espermiograma: Foi realizada na fase de seleção de animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10 minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et al, 1986), foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e os resultados expressos em porcentagem, registrados individualmente. A classificação das patologia foi feita segundo Oettlé (1988). Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto de Propídio e Carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por

83 Experimento III 83 Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon-Episcopic Fluorescence Attchment EFA HalogenLamp Set) e contadas 100 células classificadas como: células íntegras- células emitindo fluorescência verde, células lesadas- possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha Procedimentos experimentais Foram coletados dez ejaculados e avaliados segundo os parâmetros acima descritos, cada amostra de sêmen foi dividida em 3 amostras idênticas. Cada amostra foi acrescida na proporção de 1:1 de meio à base de leite desnatado e glicose (Kenney, 1975) (ph 7,26; 355 mosm) e centrifugada por 5 minutos a 800g. Após a eliminação do sobrenadante, os grupos foram acrescidos dos meios diluidores sob os seguintes protocolos: Glicina Gema Um pellet foi ressuspendido em 2,4ml de meio Glicina-Gema de ovo (GG) sem glicerol (ph 7; 285 mosm) e decorridos 5 minutos acrescido de 1,6 ml de GG com 12,8% de glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml, ficando esta amostra com 5% de glicerol em sua concentração final (Lopes e Papa, 1998). Tris - O segundo pellet foi ressuspendido em 2ml de meio TRIS, Ac.Cítrico e Glicose (TRIS) com 3% de glicerol (ph 6,10; 788 mosm) e decorridos 5 minutos acrescido de 2ml de TRIS com 7% de glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml, ficando esta amostra com 5% de glicerol em sua concentração final (Rota,1997).

84 Experimento III 84 M9 - Um terceiro pellet foi ressuspendido em 4 ml de M9 (33% Merck-gema, 33% Kenney, 33% DME, 5% glicerol na solução final) (Dell Aqua Junior, 2000) (ANEXO II) e envasado em 4 palhetas de 0,5ml, ficando esta com 5% de glicerol em sua concentração final. Amostras tratadas sob cada protocolo foram avaliadas quanto à motilidade e vigor espermático através de microscopia de contraste de fase e, imediatamente após, levadas ao refrigerador computadorizado MINITUB programado para a temperatura de 5ºC. A temperatura de 5ºC foi atingida em média após 20 minutos de refrigeração, sendo este período nomeado Curva de Refrigeração (CR). Para cada grupo, um ejaculado de cada cão foi manipulado como descrito e posteriormente mantido a 5ºC por 40 (n=5) ou 60 minutos (n=5), sendo este período denominado Período de Equilíbrio (PE). Desta forma, foram formados 6 grupos quanto ao tratamento das amostras de sêmen (figura 1), sendo eles: G1 congelado em GG após CR de 20 minutos e PE de 40 minutos; G2 - congelado em GG após CR de 20 minutos e PE de 60 minutos; G3 - congelado em TRIS após CR de 20 minutos e PE de 40 minutos; G4 - congelado em TRIS após CR de 20 minutos e PE de 60 minutos; G5 - congelado em M9 após CR de 20 minutos e PE de 40 minutos;g6 - congelado em M9 após CR de 20 minutos e PE de 60 minutos. Protocolos Diluidores GG Tris M9 CR de 20 PE de 40 G1 G3 G5 CR de 20 PE de 60 G2 G4 G6 FIGURA 1 Esquema da formação dos grupos experimentais

85 Experimento III 85 Após o PE (40 ou 60 minutos), 2 palhetas de cada grupo foram levadas a um isopor contendo 5 cm de nitrogênio líquido (N 2 ) e mantidas a 4 cm deste durante 20 minutos. Decorrido este tempo, as palhetas foram mergulhadas no N 2 raquiadas e armazenadas em botijões apropriados. O conteúdo das 2 outras palhetas de cada grupo foi levado diretamente do PE ao banho Maria 37ºC por 10 minutos e avaliado (M1) quanto à motilidade e vigor espermáticos. As palhetas armazenadas foram posteriormente (> 24 horas) descongeladas a 37ºC por 30 segundos e avaliadas (M2) quanto à motilidade e vigor espermáticos e integridade das membranas espermáticas. As amostras descongeladas foram ainda mantidas em banho Maria a 37ºC durante 1 hora para teste de longevidade espermática e após este período reavaliadas (M3) quanto à motilidade e vigor espermáticos e integridade das membranas espermáticas Métodos Estatísticos Utilizados Para a comparação entre dois momentos no mesmo tratamento: prova não paramétrica de Wilcoxon para pequenas amostras pareadas, com o cálculo da estatística p. Para a comparação entre 3 momentos no mesmo tratamento: prova não paramétrica de Friedman para amostras dependentes, com o cálculo das estatíticas χ 2 e p. Para a comparação entre tratamentos em cada momento: prova não paramétrica de Friedmam com o cálculo das estatísticas χ 2 e p.

86 Experimento III 86 As estatísticas calculadas foram consideradas significativas quando p< 0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida tendência à significância, já que p é a probabilidade de erroneamente concluir pela significância.

87 Experimento III RESULTADOS TABELA 1 Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 80Aa 80Aa 70Ba 80Ba 70Ba 80Ba M2 50ab 40ab 40ab 30ab 50ab 40ab M3 30b 20b 20b 10b 20b 40b Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05) Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05) não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05) Verificamos que houve decréscimo da motilidade espermática após o processo de descongelação para todos os grupos, sendo que, ao final do teste de longevidade (M3) todas as amostras apresentaram motilidade espermática significativamente diminuída frente aos valores iniciais (p<0,05) (tabela 1). Quando comparados os dados obtidos em cada momento, verificamos que não houve diferença significante na motilidade espermática após a descongelação e após o teste de longevidade, porém, imediatamente após o período de equilíbrio, a motilidade espermática dos grupos diluídos em GG apresentaram valores significativamente mais elevados (p<0,05) (tabela 1).

88 Experimento III 88 TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, Grupos G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 3Aa 2Aa 2Ba* 2Ba 3Aa 3Aa* M2 2ABab 2ABab 2Ba* 1Bab 2Aab 3Aa* M3 1b 1b 0a* 1b 0b 2a* Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas seguidas do símbolo * representam tendência estatística (p<0,10). não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05) Na tabela 2, observa-se que as amostras congeladas com TRIS (G3 e G4) apresentaram resultados significativamente inferiores após a descongelação, porém, após o teste de longevidade (M3), não se observou diferença estatística significativa entre os grupos (p>0,05). Observa-se ainda que, verificando-se o vigor dentro de um mesmo grupo, houve tendência à manutenção do vigor espermático após o período de equilíbrio, descongelação e após teste de longevidade (M1 = M2 = M3) (p<0,10) nos grupos onde o sêmen foi congelado com TRIS com PE de 40 minutos (G3) e com M9 com PE de 60 minutos (G6).

89 Experimento III 89 TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, Grupos G1 G2 G3 G4 G5 G6 M2 46Aa 35Aa 37Aa 43Aa 60Ba 50Ba M3 36Ab 25Aa 32Aa 40Ab 62Ba 50Ba Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05). não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05) Na tabela 3, verificou-se que os dois grupos congelados com meio o M9 (G5 e G6) apresentaram-se significativamente superiores (p<0,05) após a descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3). Observa-se ainda que os grupos G2, G3, G5 e G6 mantiveram, significativamente equivalentes, as porcentagens de células espermáticas íntegras entre os momentos M2 e M3 (p<0,05).

90 Experimento III DISCUSSÃO A utilização do sêmen congelado de canídeos será um grande passo na criação nacional, possibilitando a difusão do sêmen de machos melhoradores de raças, e ainda, servindo de seguro biológico na preservação de espécies ameaçadas de extinção. O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência, diminuindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição dos gastos energéticos e diminuição na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a preservação celular (Mazur, 1970, Watson, 1981, Watson, 1995, Holt, 2000). As técnicas de preservação do sêmen em baixas temperaturas podem provocar a diminuição da fertilidade devido, principalmente, às injúrias ocorridas aos espermatozóides durante o processo de resfriamento (fase de transição), congelação e descongelação (efeito de solução e recristalização) (Jasko, 1994, Zúccari, 1998; Holt, 2000; Kirk, 2001). A alteração da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou ph podem determinar mudanças irreversíveis na estrutura e organização das membranas espermáticas (Gennis, 1989). A avaliação seqüencial da motilidade espermática obtida após o período de equilíbrio (M1), descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3) corroboram com estas afirmações, sendo verificado um decréscimo significativo destes valores no decorrer destes processos em todos os grupos.

91 Experimento III 91 O vigor espermático das amostras congeladas com TRIS com PE de 40 minutos e congeladas com M9 com PE de 60 minutos não apresentaram decréscimo significativo após o descongelamento e o teste de longevidade. O G3 apresentou resultados significativamente inferiores quando comparado aos outros grupos em M1 e em M2, logo, esta manutenção do vigor espermático é menos significativa para este grupo. Ao contrário deste fato, em G6, onde se utilizou o M9 como diluidor com 60 minutos de PE, verificou-se uma superioridade sobre os outros grupos, tanto no M1 como em M2, além de ter havido a manutenção dos valores durante o processo de equilíbrio, descongelação e longevidade. Podemos afirmar que houve uma maior manutenção da viabilidade espermática no G6. O M9 é um diluidor rico em aminoácidos e tampões que funcionam tanto como crioprotetores como antioxidantes e são, provavelmente, estes componentes que conferem a ele maior poder de proteção quanto aos efeitos adversos das alterações de temperatura. Os dados aqui encontrados são concordantes com os obtidos por Neves Neto (1999) e Dell Aqua Junior (2000) que obtiveram melhores resultados de congelação para o sêmen eqüino congelado neste diluidor. Os efeitos deletérios da refrigeração da célula podem se apresentar de maneira diferente entre as diferentes espécies animais, entre indivíduos e ainda entre os compartimentos de um espermatozóide, como o acrossômico ou o mitocondrial (Garner et al., 1999, Holt, 2000). O sêmen de várias espécies animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação para que desenvolva uma máxima resistência aos efeitos adversos da criopreservação. Watson (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada do glicerol como se acreditava anteriormente, mas este tempo permite que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram.

92 Experimento III 92 Na literatura atual existem vários protocolos para a congelação do sêmen canino, dentre eles, vários são os períodos de equilíbrio propostos (Olar, 1984; England, 1992; Rota, 1998; Santos, 1999). Após a avaliação estatística de nossos dados, observamos que os dois períodos de equilíbrio propostos (40 ou 60 minutos) não influenciaram estatisticamente os dados avaliados. No Experimento II, observamos a superioridade dos períodos de equilíbrio de 40 e 60 minutos frente ao de 90 minutos. Somando-se a curva de refrigeração de 20 minutos ao período de 60 minutos, observamos que os mesmos têm uma duração total bastante próxima. Provavelmente aqui, a curva de refrigeração mais rápida (20 minutos) em contraste com uma curva de refrigeração mais longa (~45 minutos) pode ter sido benéfica à célula espermática canina, evitando maiores danos que poderiam ter sido causados devido aos efeitos da fase de transição, que ocorre em temperaturas entre 20 e 5ºC. Após o término do processo de preservação, os espermatozóides devem apresentar uma boa motilidade para que possam atingir o local da fertilização e penetrar o óvulo. Precisam, também, manter a integridade de suas membranas espermáticas, para sua posterior ligação com a zona pelúcida e membrana vitelínica, resultando na formação do zigoto (Holt, 1995; Zúccari, 1998). Nos grupos congelados com M9, a integridade das membranas espermáticas foi significativamente superior após descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3). Acrescenta-se, ainda, que os G5 e G6 mantiveram significativamente estáveis a porcentagem de membranas íntegras durante o teste de longevidade sendo que, ao final deste, M2=M3 (p>0,05). Os aminoácidos presentes neste diluidor podem ter interagido positivamente na manutenção das

93 Experimento III 93 membranas espermáticas e ainda, a presença do EDTA, um quelante do cálcio, pode ter protegido a célula espermática de alterações de permeabilidade que podem levar à lesão da membrana plasmática. Podemos concluir que o M9 resultou em melhores resultados de preservação espermática quando utilizada uma curva de refrigeração de 20 minutos com período de equilíbrio de 40 ou 60 minutos e descongelação em 37ºC por 30 segundos.

94 Experimento IV Experimento IV

95 Experimento IV 95 EFEITO DE TRÊS DIFERENTES DILUIDORES SOBRE O SÊMEN CANINO DESCONGELADO SOB DOIS DIFERENTES PROTOCOLOS 1. REVISÃO DE LITERATURA A criopreservação e suas conseqüências sobre a célula espermática são os assuntos mais descritos e estudados pelos pesquisadores da área de biotecnologia do sêmen. Sabemos que tanto a refrigeração como a congelação e descongelação são eventos que podem culminar em alterações irreversíveis da célula espermática. São necessários ainda muitos estudos para que possamos compreender a origem destas alterações para que, num futuro, estes efeitos deletérios possam ser minimizados ou eliminados (Watson, 1995; Peña, 2000). Watson (1995) afirmou que as mudanças pósejaculatórias do espermatozóide no trato feminino em sua preparação para a fusão com o oócito devem ser vistas como a continuidade no desenvolvimento e maturação espermática, processo este que teve inicio no epidídimo. A criopreservação implica em uma pausa neste processo natural durante a qual o espermatozóide é inativado, porém, ao invés de ser reativado no estágio de onde tinha parado, sua maturação é afetada pelo processo. Watson (1995) concluiu ainda que o processo de criopreservação faz com que os espermatozóides se tornem mais reativos pelo fato de suas membranas sofrerem mudanças na fluidez e tornaremse mais permeáveis ao cálcio. Estes fenômenos podem promover a capacitação e reação do acrossomo, diminuindo o tempo de vida útil do

96 Experimento IV 96 espermatozóide, impossibilitando a futura fecundação do óvulo no local e momento apropriado. O meio diluidor deve proteger as células espermáticas dos efeitos adversos de todo o processo de criopreservação. As propriedades protetoras de um meio diluidor são atribuídas aos diferentes componentes deste meio e da sua interação com as células espermáticas de uma determinada espécie, e ainda, de um determinado indivíduo (Watson, 1995; Rota, 1998; Holt, 2000). Watson (1995) sugeriu ainda que um mesmo indivíduo pode apresentar sua característica de congelabilidade seminal irregular, e que esta irregularidade pode ser conseqüente de diferenças no tempo de exposição das células espermáticas de diferentes ejaculados ao ambiente epidídimário, que é o local onde os espermatozóides adquirem a maioria de suas habilidades para suportarem as flutuações de temperatura. Lopes e Papa (1998) compararam efeitos da centrifugação e da congelação nos diluidores glicina e TRIS sobre a motilidade e vigor do sêmen canino. Estes autores verificaram que houve uma interação positiva entre a centrifugação e o congelação e concluíram que o grupo centrifugado e congelado em meio glicina apresentou melhores resultados. Santos et al.(1999) avaliaram o efeito de cinco diferentes diluidores na congelação do sêmen canino, sendo eles, TRIS-frutoseac.cítrico, glicina, lactose, leite desnatado e TRIS-frutose-citrato, com a adição do glicerol em todos os casos realizada a 5ºC. Estes autores concluíram que os diluidores TRIS-frutose-ac.cítrico e glicina proporcionaram melhora na motilidade retilínia progressiva e vigor espermáticos. Os autores comentaram que todos os diluidores aumentaram a taxa de patologia espermática.

97 Experimento IV 97 Barnabé e Barnabé (1995) avaliaram a qualidade do movimento e o estado acrossomal do sêmen de búfalo congelado nos diluidores TRIS, TRIS-TES e glicina e, posteriormente, incubados em heparina ou cafeina. Estes autores verificaram que o meio glicina melhorou a qualidade do movimento espermático imediatamente após o descongelamento e que o diluidor TRIS após incubação tanto em cafeína como em heparina apresentou maiores quantidades de lesão acrossomal. Neto Neves et al. (1999) em seus estudos sobre congelação do sêmen eqüino concluiram que o meio M9 conferiu melhor motilidade e vigor espermáticos frente ao diluidor Merck-Gema, imediatamente após a descongelação e aos 60 minutos do teste de termorresistência. O processo de descongelamento parece ser tão deletério aos espermatozóides quanto à congelação e os principais efeitos adversos são atribuídos à recristalização de microcristais de gelo intracelular, quando o descongelamento é realizado lentamente ou devido a alterações bruscas do volume celular, quando o descongelamento se procede muito rapidamente, além de alterações de estrutura e função da MP ( Watson, 1981; Watson, 1995; Zúccari, 1998; Holt, 2000). A temperatura sob a qual se descongela uma amostra de sêmen influencia na viabilidade pós-descongelação deste sêmen, sendo, principalmente, descritas alterações no movimento espermático e na integridade das membranas (Ivanova-Kicheva et al., 1995; Watson, 1995; Holt, 2000; Peña, 2000). Um protocolo de congelação e descongelação de sêmen deve incluir a temperatura e o período de exposição ideal, considerandose, para tanto, as características particulares daquele protocolo. Várias temperaturas e tempos de exposição têm sido descritos para a descongelação do sêmen canino, assim como inúmeros protocolos de

98 Experimento IV 98 congelação e descongelação (Olar, 1984; England, 1992; Rota, 1998; Peña 2000). Penã (2000) afirmou que a temperatura de 70ºC, por 8 segundos, melhorou os resultados de fertilidade para o sêmen canino. Em seu experimento a autora sugeriu que o descongelamento a 37ºC, por 15 segundos, pode expor as membranas espermáticas a variações de temperatura que induzem à reorganização de lipídeos ou à movimentação de proteínas mais severamente que as alterações ocorridas a 70ºC por 8 segundos. A descongelação, sob altas temperaturas com um tempo de exposição bastante curto, tem sido preconizado para a descongelação do sêmen canino (Olar, 1984; England, 1992; Ivanova-Kicheva et al., 1995; Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000) conferindo longa viabilidade às amostras de sêmen tanto in vitro como in vivo. Em contrapartida, os protocolos mais utilizados para outras espécies animais, incluindo aquele preconizado pelo Ministério da Agricultura (CBRA, 1996), indicam a descongelação de palhetas de 0,5ml à 37ºC durante 30 segundos. Após o processo de congelação e descongelação das células espermáticas, testes de alta correlação com a fertilidade devem ser realizados, para que se verifique a viabilidade dos diluidores e\ou dos métodos de congelação utilizados (Penã, 2000; Kirk, 2001). A avaliação da motilidade espermática, definida como o percentual de espermatozóides móveis de um ejaculado e da intensidade do movimento, constitui-se num parâmetro importante de avaliação da qualidade e viabilidade do sêmen (Linde-Forsberg, 1995), porém, Blach et al. (1989) afirmaram que alguns espermatozóides que estão móveis in vitro podem tornar-se imóveis in vivo ou vice versa.

99 Experimento IV 99 O movimento retilíneo progressivo é considerado normal em cães, e reflete uma completa habilidade e viabilidade para fertilizar o óvulo (Mies Filho, 1987; Christiansen, 1988; Feldman e Nelson, 1996; Rota et al., 1997). A avaliação subjetiva do movimento espermático é muito importante e deve ser rotineiramente realizada, no entanto, pelo fato de ser realizada por um técnico, pode estar sujeita a um grande número de variações, principalmente, no que diz respeito ao grau de habilidade e experiência do avaliador (Iguer-Ouada e Verstegen, 2001). Para que estas variações sejam minimizadas uma avaliação computadorizada do movimento espermático pode ser realizada. Muitas têm sido as tentativas de padronização desta avaliação na espécie canina. Recentemente, Iguer-Ouada e Verstegen (2001) propuseram a padronização de um avaliador computadorizado de movimento espermático (HTR-IVOS10 analyzer, Hamilton Thorn Research, Beverly, Mass, USA) que apresentou ótimos resultados na avaliação de espermatozóides da espécie canina. Utilizando-se este sistema podemos avaliar a motilidade espermática total, motilidade total progressiva, padrão médio de velocidade espermática (VAP), velocidade de deslocamento em linha reta (VSL), velocidade de deslocamento curvilíneo (VCL), sobreposição do deslocamento retilíneo e a do deslocamento curvilíneo VSL/VCL (STR) e ainda a linearidade do movimento, ou seja a proximidade da linha de deslocamento com uma linha linear (LIN) dos espermatozóides (Iguer- Ouada e Verstegen, 2001). Métodos identificadores da integridade das membranas espermáticas têm sido utilizados na avaliação de diferentes técnicas de conservação do sêmen (Blach et al., 1989; Harrison e Vickers, 1990; Kumi- Diaka, 1993; Peña, 2000; Kirk, 2001).

100 Experimento IV 100 Segundo Cunha (1997), um dos métodos que pode ser utilizado na verificação da integridade das membranas espermáticas de cães é o emprego de sondas fluorescentes, sendo elas o diacetato de carboxifluoresceína (FDA) e o iodeto de propídeo (PI). Quanto ao mecanismo de ação, o FDA, um éster não polar e não fluorescente atravessa a membrana plasmática e, uma vez no interior da célula, é hidrolisado por esterases não específicas, resultando na formação de 6- carboxifluoresceína, composto impermeável à membrana plasmática, que emite fluorescência verde nos compartimento celulares onde há integridade de membranas. Ao contrário, o PI, com forte afinidade aos ácidos nucléicos, é impermeável à membrana plasmática, e, portanto, as células com a membrana plasmática lesada, tornando possível a ligação do PI com o DNA presente no núcleo, emite fluorescência vermelha. O isotiocianato fluorescinado (Fitc) é uma sonda fluorescente comum e largamente utilizada para verificação do estado acrossomal (Penã, 2000; Kirk, 2001; LANDIM-ALVARENGA 1 ). O Fitc deve estar ligado a uma lecitina, que é uma proteína ou uma glicoproteina isolada de sementes de várias plantas. Estas lecitinas se ligam especificamente a resíduos de açúcares. As duas lecitinas mais utilizadas na verificação de estado acrossomal são o PSA - aglutinina Pisum sativum oriunda da ervilha e o PNA - aglutinina Arachis hypogea originária do amendoim (Cross e Watson, 1994; Kirk, 2001). O PSA e o PNA exibem padrões diferentes de afinidades a açúcares, sendo que o PSA se liga manose e ao metil α - D - glicosideos enquanto o PNA se liga a galactose. PNA liga-se preferencialmente à membrana acrossomal externa enquanto que o PSA se liga à matriz acrossomal (Cross, 1998, Peña, 2000; Kirk, 2001). 1. LANDIM- ALVARENGA, F. Docente do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ UNESP Botucatu

101 Experimento IV 101 A alteração da fluidez das membranas espermáticas durante a capacitação propicia a fusão da membrana acrossomal externa com a membrana plasmática, este fenômeno fusogênico é conhecido como reação do acrossomo (Cross, 1998; Kirk, 2001). Cross e Watson (1994) e Kirk 2 utilizaram o Fitc-PNA para verificar o estado acrossomal de espermatozóides bovinos e eqüinos, respectivamente, e sugeriram que tal sonda fluorescente se liga a membrana acrossomal externa quando esta exibe uma alteração de permeabilidade. Para que se pudessem diferenciar os espermatozóides com a total perda do acrossomo dos acrossomos intactos utiliza-se o PI em conjunto com o Fitc PNA (Kirk 2, 2001, LANDIM-ALVARENGA 3 ). O Fitc-PNA liga-se a resíduos de açúcares, logo, ligar-seá aos resíduos de açúcares presentes no meio, e ainda, a maioria das lecitinas liga-se ao leite, gema de ovo e a outras partículas presentes no plasma seminal (Kirk, 2001). Com vista no exposto tivemos como objetivo deste experimento avaliar o efeito de dois diferentes protocolos de descongelação do sêmen canino congelado com três diferentes diluidores sobre a qualidade do movimento espermático, integridade das membranas espermáticas e a condição acrossomal. 2. KIRK, E Colorado State University c.f. nota 1, pág ----

102 Experimento IV MATERIAL E MÉTODO 2.1. Animais Foram coletados e processados ejaculados de nove cães, sendo eles: um (1) SRD, três (3) Cocker Spaniel, dois (2) Weimaraner e três (3) Rottweiller, todos eles provenientes de criatórios particulares da cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados apresentaram-se em boas condições de saúde. Os cães permaneceram em seus respectivos canis durante a fase experimental do projeto. Todos os animais foram mantidos sob boas condições alimentares e de higiene durante a fase experimental. O sêmen foi coletado no próprio criatório e transportado imediatamente até o laboratório da Área de Reprodução Animal da FMVZ UNESP- Botucatu, para análise e manipulação Coleta do Sêmen Foi realizada uma coleta sêmen de cada cão (n=9). O sêmen foi coletado por meio de massagem peniana e o ejaculado completo recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira dentro de uma garrafa de isopor.

103 Experimento IV Exame do Sêmen ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva. ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de sêmen é colocada sobre lâmina aquecida (38-40ºC) e recoberta por lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (CBRA, 1996) para o vigor. Concentração espermática: Foi determinada através de contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em água e o número de espermatozóides expressos por ml. Espermiograma: Foi realizada na fase de seleção de animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10 minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et al, 1986) foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e os resultados expressos em porcentagem, e, registrados individualmente. A classificação das patologia foi feita segundo Oetllé (1988). Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto de Propídio e Carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por

104 Experimento IV 104 Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996)(ANEXO I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon-Episcopic Fluorescence Attchment EFA HalogenLamp Set) e contadas 100 células classificadas como: células íntegras- células emitindo fluorescência verde, células lesadas- possuem o núcleo emitindo fluoresncência vermelha. Avaliação do estado acrossomal: Para avaliação do estado acrossomal recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto de Propídio e Fitc-PNA, de acordo com a técnica descrita por Kirk (2001) modificada por LANDIM-ALVARENGA 4. Para a realização desta, misturou-se 10µl da amostra a 40µl da solução de trabalho (ANEXO IV). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic Fluorescence Attchment EFA HalogenLamp Set. Foi realizada a contagem das células espermáticas de um campo claro e, imediatamente após, este mesmo campo foi verificado sob epifluorescência. Foram anotadas as células que emitiam qualquer fluorescência a cada campo. No total era realizada a contagem de 200 células em campo claro. A classificação das células era realizada segundo descrito por LANDIM-ALVARENGA 3 : reação acrossomal verdadeira emitindo apenas fluorescência verde (Fitc-PNA); falsa reação do acrossomo emitindo fluorescência verde na região acrossomal (Fitc-PNA) e vermelha (PI); espermatozóides lesados emitindo apenas fluorescência vermelha (PI); espermatozóides intactos - células não coradas. 4. c.f. nota 1 pág ----

105 Experimento IV 105 a c b c FIGURA 1 Espermatozóides caninos corados com Fitc-PNA (emitindo fluorescência verde) e pelo PI (emitindo fluorescência vermelha). a reação acrossomal verdadeira, b - falsa reação do acrossomo c espermatozóides lesados.