Avaliação da taxa de fertilidade in vivo de espermatozoides frescos e congelados

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1 Avaliação da taxa de fertilidade in vivo de espermatozoides frescos e congelados Anderson Candido de Oliveira Junior*(IC) 1, Klayto José Gonçalves dos Santos 2 (PQ), Aracele Pinheiro Pales dos Santos 2 (PQ), Raiany Soares de Paula 3 (PQ), Joyce Caroliny dos Santos Lopes 3 (PQ), Fausto Pereira Garcia 4 (PQ), Rogério Batista Rodrigues 5 (IC). 1 Graduando em Zootecnia, CNPQ, Universidade Estadual de Goiás, Câmpus São Luis de Montes Belos, andersonjunior.zootecnia@hotmail.com 2 Docente no curso de Zootecnia, Universidade Estadual de Goiás, Câmpus São Luis de Montes Belos 3 Zootecnista, Mestranda - Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Desenvolvimento Rural Sustentável - UEG, Câmpus São Luís de Montes Belos. 4 Zootecnista, Mestre em Produção Animal - Instituto Federal Goiano, Câmpus Rio Verde. 5 Graduando em Zootecnia, PIBIC/UEG, Universidade Estadual de Goiás, Câmpus São Luis de Montes Belos. Universidade Estadual de Goiás, Câmpus São Luis de Montes Belos. Resumo: O desenvolvimento de biotecnologias da reprodução pode contribuir enormemente com os programas de melhoramento animal. Dentre estas, a IA é de grande importância na agroindústria por ser de mais fácil acesso à maioria dos produtores, tendo como principal objetivo reproduzir uma genética mais valiosa, além de melhorar o desempenho reprodutivo do rebanho, diminuindo o intervalo entre partos (IEP). Após cada coleta, o ejaculado foi dividido em duas frações, uma fração testada a fresco e a outra fração diluída com dois diluentes diferentes: TRIS-gema e Botu-Bov Egg Free, após a diluição foi realizado o congelamento para as analises de motilidade progressiva (MP), vigor, porcentual de espermatozoides vivos, teste hiposmotico e ph. Houve perda da motilidade progressiva (MP) verificada imediatamente após a colheita e após congelação, o vigor não foi alterado nos tratamentos utilizando os meios de diluentes após congelação, mas sim comparado o sêmen fresco com congelado, verificou-se queda acentuada no percentual de células reativas ao teste hiposmótico, a redução do ph foi acentuada entre os tratamentos. Pode-se concluir que o sêmen fresco apresenta melhor viabilidade que o sêmen congelado. Palavras-chave: Reprodução. Sêmen. Diluentes.Inseminação artificial.

2 Introdução O desenvolvimento de biotecnologias da reprodução pode contribuir enormemente com os programas de melhoramento animal (Franco e Melo, 2006). Dentre estas, a IA é de grande importância na agroindústria por ser de mais fácil acesso à maioria dos produtores, tendo como principal objetivo reproduzir uma genética mais valiosa, além de melhorar o desempenho reprodutivo do rebanho, diminuindo o intervalo entre partos (IEP). Nota-se então, a importância da difusão desta e de outras biotecnologias reprodutivas para a região, visto que o emprego da IA com sêmen de touros provados geneticamente tem o objetivo de melhorar a eficiência reprodutiva, com consequente aumento na produção de bezerros de qualidade e na rentabilidade da propriedade. O aperfeiçoamento de análises espermáticas como uma ferramenta para predizer a fertilidade de reprodutores e assim poder aumentar a eficiência da IA e da produção in vitro de embriões, poderiam comprovar os resultados da literatura, ainda controversos, onde normalmente avaliam a motilidade espermática associada à fertilidade. Os testes de inseminação artificial (IA) ou fertilização in vitro (FIV) representam as técnicas de maior sensibilidade para o acesso ao potencial de fertilização das amostras seminais (Crespilho et al., 2009), pois permitem a avaliação simultânea dos requisitos mais importantes da célula espermática para o processo de fertilização (Rodriguez-Martinez, 2005). Entretanto, embora a técnica da IA tenha surgido na década de 70, ainda existem inúmeros estudos com a finalidade de aumentar sua eficiência. Entre estes estudos, podemos citar os relacionados à avaliação da qualidade seminal e a sua fertilidade pós-descongelamento, uma vez que os danos ocasionados pela criopreservação causam prejuízos das funções celulares, resultando em redução da fertilidade (Arruda et al., 2011). Logo, a interação entre as células espermáticas e o meio diluidor representa um fator crucial para a preservação da integridade espermática e habilidade de fecundação (Manjunath et al., 2002). Portanto, um meio diluente eficaz tem como finalidade de proteger a célula espermática durante as alterações térmicas na congelação/descongelação. Além disto, há uma grande variação na fertilidade entre touros, o que poderia estar relacionado com a qualidade dos espermatozoides pós-congelado de cada

3 animal. Segundo alguns autores (Farrel et al., 1996; Hallap et al., 2004; Cox et al., 2006) a associação de múltiplas variáveis de movimento e de características espermáticas mostram maior correlação com fertilidade in vivo em relação à utilização de apenas uma característica avaliada. Entretanto, alguns trabalhos não identificaram qualquer característica da fertilidade in vivo com diferentes avaliações espermáticas (Rodriguez-Martinez, 2003). Portanto, a existência desta correlação ainda é controversa, sendo necessários mais estudos para confirmar esta hipótese. Desta forma, a associação de vários testes espermáticos com diferentes técnicas de avaliação poderia fornecer uma maior confiabilidade entre a correlação da fertilidade in vivo do sêmen com diferentes parâmetros espermáticos. Para a avaliação da viabilidade e integridade espermática, a citometria de fluxo surge como uma técnica vantajosa sobre as outras clássicas, pois tem a capacidade de examinar em torno de espermatozóides por amostra de sêmen em menos de um minuto, permitindo maior acurácia nos resultados (Arruda, 2000). Além disso, pode ser feita a avaliação de diversas características espermáticas, tais como integridade de membrana plasmática, de membrana acrossomal, capacitação e potencial mitocondrial. Para avaliação da cinética de movimento espermático o CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) é um sistema automático (hardware e software) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, fornecendo informações acuradas, precisas e significativas do movimento espermático. Outro ponto a ser considerado, é que além da avalição de cinética de movimento e características estruturais dos espermatozoides, uma avaliação da capacidade de fecundação dos espermatozoides, pode ser mais uma característica a ser utilizada na correlação de características espermáticas com a taxa de fertilidade in vivo. Para testar a taxa de fecundação dos espermatozoides, pode ser utilizada a taxa de produção in vitro de embriões (PIVE) ou mesmo a taxa de penetração dos espermatozoides ou taxa de clivagem. Além disto, a PIVE, permite a utilização de reprodutores com alto valor comercial, além de otimizar o uso do sêmen (Faber et al., 2003). Embora Alguns fatores como a qualidade dos ovócitos e do ambiente de cultivo possam afetar o sucesso da PIVE, outro fator importante é o touro, sendo esta uma grande fonte de variação. Diversos trabalhos mostram essa variação entre touros na taxa de blastocistos (Cesari et al., 2006; Alomar et al.,

4 2008). Palma e Sinowatz (2004) realizaram um estudo no qual utilizaram, na PIVE, sêmen de 63 touros que na IA haviam apresentado taxa de prenhez aos 60 a 90 dias de 65 a 75% e observaram taxas de blastocisto variando de 6,9 a 51,2%. Diante disto, os avanços em avaliações estruturais e funcionais dos espermatozoides têm tido grande utilidade para excluir amostras de sêmen de baixa qualidade, no entanto, apontar dentre os animais quais os mais aptos a proporcionar as maiores taxas de prenhez, ainda é um grande desafio (Arruda et al., 2010). Portanto, obter resultados através de uma associação de diferentes avaliações espermáticas e desta forma utilizá-los na pré-seleção de animais de alta fertilidade in vivo, e assim possibilitar o uso destes animais na IA, possibilitaria obter melhores índices na taxa de prenhez, diminuindo o IEP. Isso causaria diminuição dos custos, popularizando o uso da IA aos produtores. Contudo, se faz necessário avaliar a proteção e a viabilidade oferecida aos espermatozoides bovinos utilizando diluidores diferentes, compostos por proteína vegetal (extrato de soja) e gema de ovo por meio de testes complementares referentes à integridade das membranas e correlacionar através de análises in vitro características fisiológicas e estruturais dos espermatozoides frescos e criopreservados em diferentes meios diluentes, á fresco e congelado, correlacionando os resultados das análises com touros de alta e baixa fertilidade in vivo e in vitro. Material e Métodos O estudo está sendo realizado no laboratório da Universidade Estadual de Goiás (UEG-UnU de São Luís de Montes Belos) e em propriedades localizadas no município. Estão sendo utilizados oito touros da raça Holandesa (Bos taurus taurus) sexualmente maduros. Os animais estão sendo criados em regime de pasto com suplementação mineral, no momento da coleta os animais são contidos para que fossem realizados os procedimentos de coleta, ao seu início, realizou-se a higienização externa do prepúcio com água e sabão neutro, foram retiradas as fezes do reto dos animais para que em seguida fosse possível a introdução da probe (eletroejaculador) no reto, os eletrodos tocarão seu ventre, fixando-se o cabo contíguo à cauda, e os choques conduzidos de forma pulsátil. Os primeiros jatos de

5 sêmen foram descartados, e somente recolhidos àqueles mais consistentes, foram utilizados apenas os ejaculados com motilidade >70% e anormalidades morfológicas <30%, os ejaculados eram coletados em tubos Falcon. Após a coleta, cada ejaculado foi dividido em duas frações. Uma fração, a fresco, utilizada para avaliação da cinética espermática. A outra fração foi congelada, sendo diluída 1:1 com a fração I (sem glicerol) dos diluentes TRIS-gema e Botu-Bov Egg Free (constituído de lecitina de soja), sendo refrigeradas à 4 ºC por 90 min. Para avaliar as diferenças entre os meios diluentes foi acrescidas nas amostras 50% do volume com as respectivas frações II dos diluentes (com 13% de glicerol) padronizando a concentração final em 30x10 6 espermatozóides viáveis (adotando a motilidade espermática como critério), envasadas em palhetas de 0,5mL devidamente identificados os grupos e lacradas com álcool polivinílico. Posteriomente congeladas em máquina de congelação TK 4000 compacta (TK, Uberaba, MG, Brasil). Ao final do programa de congelação, todas as palhetas foram imersas em nitrogênio líquido. Parte do ejaculado que foi congelado, será descongelado posteriormente para produção de embriões in vitro, outra parte será avaliada quanto a cinética espermática pelo CASA, integridade das membranas espermáticas, capacitação e potencial de membrana mitocondrial por citometria de fluxo, teste de termo-resistência (TTR) e taxa de prenhez na IA. Resultados e Discussão Os resultados referentes às análises para o experimento estão mostrados na TABELA 1. Houve perda da motilidade progressiva (MP) verificada imediatamente após a colheita e após congelamento (P<0,05). Para os experimentos a adição do meio diluente utilizado após centrifugação resultou em perda da MP, diferindo entre os tratamentos (P<0,05). O vigor não foi alterado nos tratamentos utilizando os meios de diluentes após congelação, mas sim comparado o sêmen fresco com congelado (P<0,05). Verificou-se queda acentuada no percentual de células reativas ao teste hiposmótico (HO) entre as amostras avaliadas imediatamente após a colheita ou refrigeração passiva. A redução do ph foi acentuada entre os tratamentos, tanto nas amostras processadas imediatamente após a colheita quanto aquelas congeladas (P<0,05).

6 TABELA 1 Resultados das análises do sêmen utilizando TRIS GEMA e BUTO-BOV TT M Mot (%) Vigor Vivos (%) HO (%) ph Sêmen Fresco 70,7 ± 5,9ª 4 ± 0,5ª 76,5 ± 7,8ª 60,0 ± 14,0 a 6,8 ± 0,4 1 66,0 ± 5,5 A 4 ± 0,5 A 6,6 ± 0,5 A 2 66,7 ± 5,8 A 4 ± 0,5 A 6,0 ± 0,0 B 3 50,0 ± 8,2 B 3 ± 0,5 B 5,5 ± 0,5 B Sêmen congelado 51,8 ± 4,0 b 3 ± 0,5ª 76,6 ± 8,1 a 49,12±12,2 b 6,6 ± 0,5 1 53,3 ± 11,5 1 3 ± 0,6 a 6,6 ± 0, ,0 ± 17,3 1 3 ± 0,6 ab 6,0 ± 0, ,0 ± 10, ± 0,0 ab 5,5 ± 0,5 3 Letras minúsculas, maiúsculas e números diferentes na mesma coluna indicam diferenças (P<0,05). TTM= Tratamento 1(controle), 2 (TRIS GEMA), 3 (BUTO BOV). Diferentes protocolos de congelamento têm sido utilizados para criopreservar espermatozóides. No entanto, como existe uma variação nos diluentes e nos procedimentos utilizados em cada protocolo, a comparação direta dos resultados não é adequada. Durante o procedimento de congelamento de sêmen dois importantes processos acontecem, o primeiro é a produção de espécies reativas de oxigênio (BAUMBER et al., 2005) que induzem mudanças na função e estrutura da membrana (GADEA et al.; 2005). Até o momento o experimento está sendo desenvolvido conforme previsão. Considerações Finais Diante do presente estudo, conclui-se que o sêmen fresco apresenta melhor viabilidade que o sêmen congelado e o meio de diluente TRIS GEMA apresentou melhor viabilidade que o Buto-Bov na diluição a fresco quanto na congelação de sêmen.

7 Referências Alomar, M.; Tasiaux, H.; Remacle, S.; George, F.; Paul, D.; Donnay, I.; Kinetics of fertilization and development, and sex ratio of bovine embryos produced using the semen of different bulls. Animal Reproduction Science, 107: 48-61, Arruda, R. P.; Avaliação dos efeitos de diluidores e crioprotetores para o espermatozóide eqüino pelo uso de microscopia de epifluorescência, citometria de fluxo, análises computadorizadas da motilidade (CASA) e da morfometria (ASMA) f. Tese (Livre Docência) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Arruda, R. L.; Orros, I. R.; Passos, T. S.; Costa e Silva, E. V.; ZÚCARI, C.; Técnicas para avaliação laboratorial da integridade estrutural e funcional do sêmen congelado de touros. Revista Brasileira Reprodução Animal. 34: , Arruda, R. P.; Celeghini, E. C. C.; Alonso, M. A.; Carvalho, H. F.; Oliveira, L. Z.; Nascimento, J.; Silva, D. F.; Affonso, F. J.; Lemes, K. M.; Jaimes, J. D.; Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros. Revista Brasileira Reprodução Animal. 35: , BAUMBER, J.; BALL, B.A.; LINFOR, J.J. Assessment of the cryopreservation of equine spermatozoa in the presence of enzyme scavengers and antioxidants. American Journal of Veterinary Research, v.66, p , Cesari, A.; Kaiser, G. G.; Mucci, N.; Mutto, A.; Vincenti, A.; Fornés, M. W.; Alberio, R. H.; Integrated morphophysiological assessment of two methods for sperm selection in bovine embryo production in vitro. Theriogenology, 66: , 2006.

8 Cox, J. F.; Alfaro, V.; Montenegro, V.; Rodriguez-Martinez, H.; Computer-assisted analysis of sperm motion in goats and its relationship with sperm migration in cervical mucus. Theriogenology, 66: , Crespilho, A. M.; Papa, F. O.; Martins, J. A.; Dell Aqua, J. J. A.; Evalulation of frozen bovine semen: How do semen collection and processing centers evaluate the quality of commercialized samples? Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 16: , Faber, D. C.; Molina, J. A.; Ohlrichs, C. L.; Vander Zwaag, D. F.; Ferre, L. B.; Commercialization of animal biotechnology. Theriogenology, 59: , Franco M. M.; Melo E. O.; Melhoramento animal: o uso de marcadores moleculares e da reprodução assistida. Documentos Embrapa, v. 188, Farrel, P. B.; Foote, R. N.; Mcardle, M. M.; Trouern-Trend, V. L.; Tardif, A. L.; Media and dilution procedures tested to minimize handling effects on human, rabbit and bull sperm for computer-assisted sperm analysis (CASA). Journal of Andrology, 17: , Hallap, T.; Haard, M.; Jaakma, U.; Larsson, B.; Rodriguez-Martinez, H.; Does cleansing of frozen-thawed bull semen before assessment provide samples that relate better to potential fertility? Theriogenology, 62: , Manjunath, P.; Nauc, V.; Bergeron, A.; Major proteins of bovine seminal plasma bind to the low-density lipoprotein fraction of hen s egg yolk. Biology of Reproduction. 67: , Palma, G. A.; Sinowatz, F.; Male and female effects on the in vitro production of bovine embryos. Anatomy, Histology and Embryology, 33: , Rodriguez-Martinez, H.; Laboratory semen assessment and prediction of fertility: still utopia? Reproduction in Domestic Animals., 38: , 2003.

9 Rodriguez-Martinez H. Methods for semen evaluation and their relationship to fertility. In: Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 16, 2005, Goiânia, GO. Anais:Palestra Belo Horizonte, MG: CBRA, p.CD-ROM