RESUMO. Palavras-chave: Blastocisto. Sexagem. Sêmen. INTRODUÇÃO

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1 RELAÇÃO MACHO:FÊMEA DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO DE ACORDO COM O ESTÁGIOS DE DESENVOLVIMENTO RELATIONSHIP MALE:FEMALE OF BOVINE EMBRYOS IN VITRO PRODUCED ACCORDING TO DEVELOPMENT STAGES Camila de Menezes Watanabe Graduanda em Engenharia Agronômica Unisalesiano Lins camila.watanabe1@gmail.com Marcelo Carnelli Frade Mestre em Ciência Animal Unesp marcelo.frade@hotmail.com Profª Dra. Camila da Silva Frade Doutora em microbiologia Unisalesiano Lins camila.s.frade@gmail.com RESUMO A grande ocorrência de machos com o uso da produção in vitro de embriões bovinos tem levado a estudos sobre o desvio na proporção macho:fêmea. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a relação macho:fêmea de acordo com o estágio de desenvolvimento embrionário. Foram feitas aspirações foliculares guiadas por ultrassom em doadoras da raça Nelore e recuperados os oócitos, os quais foram fecundados in vitro com doses de sêmen de um único touro, os prováveis zigotos oriundos destes acasalamentos foram cultivados até o dia 7 pós-fecundação. Os embriões produzidos foram classificados (blastocisto/blastocisto expandido) e envasados. Estes foram transferidos para receptoras, previamente sincronizadas. Transcorrido 60 dias após a transferência dos embriões, foi realizado o diagnóstico de gestação e sexagem fetal. Houve um maior número de embriões fêmeas entre os blastocistos expandidos (348 embriões) contra os machos (322 embriões), entre os blastocistos a proporção inverteu, sendo 159 fêmeas contra 183 machos. As fêmeas apresentaram desenvolvimento embrionário mais rápido que os macho. Palavras-chave: Blastocisto. Sexagem. Sêmen. INTRODUÇÃO No sistema de produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, tem sido observado um grande número de embriões machos. Vários estudos têm reportado essa maior proporção de machos entre os embriões mamíferos produzidos in vitro (Avery et al., 1992; Carvalho et al., 1996; King et al., 1991; Marquant-Le-Guienne et al., 1992; Pedoraro et al., 1998, Hasler et al., 1995; Massip et al., 1996), fato este que pode limitar a aplicação da técnica de PIV, sobretudo em rebanhos bovinos com aptidão leiteira. Segundo Gutiérrez-Adán et al. (1996, 1998) embriões machos da espécie bovina desenvolvem-se mais rápido até o estágio de blastocisto, sendo assim uma maior porcentagem destes embriões atingem o estágio de blastocisto expandido. Universitári@ - Revista Científica do Unisalesiano Lins SP, ano 7, n.14, jan-jun de 2016 Edição Especial 841

2 Podendo assim, justificar o elevado número de bezerros machos nascidos de embriões produzidos in vitro (BEHBOODI et al., 1997). Esses achados condizem com os de (Avery et al., 1989; Seller et al., 1987; Itoh et al., 1986; Tsunoda et al., 1985), os quais encontraram 95% de embriões machos entre os blastocistos expandidos PIV. A glicose parece ser a responsável por este evento, estando envolvida na ocorrência do desvio na proporção macho:fêmea resultando na diferente velocidade de desenvolvimento entre os sexos (Gutierrez et al., 1993). Tiffin et al. (1991) constataram que o metabolismo da glicose é significativamente maior em embriões bovinos macho do que fêmea. A presença de radicais de oxigênio no meio de cultivo também parece participar do mecanismo que determina este desvio macho:fêmea relacionado com a velocidade de desenvolvimento. Estes radicais, embora apresentem ação citotóxica, possuem também efeito estimulante sobre o desenvolvimento dos embriões (RIEGER et al., 1992) e são encontrados em níveis mais baixos nos embriões fêmeas do que nos machos (PEIPO et al., 1995) Essas diferenças estão potencialmente relacionadas à expressão de genes na fase na pré-implantação, os quais podem ser responsáveis pelo desenvolvimento mais rápido dos embriões machos. Dois genes localizados no cromossoma X, a glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e hipoxantina fosforribosil transferase (HPRT), estão envolvidos no controle da quantidade de radicais de oxigênio e, portanto, eles podem ter influência no desenvolvimento do embrião. A expressão diferencial de G6PD e HPRT no estágio inicial do desenvolvimento confirma que as diferenças entre os sexos são evidentes antes da diferenciação gonadal. Estas diferenças podem ser responsáveis pelo desenvolvimento mais rápido na cultura de embriões bovinos machos PIV (GUTIERREZ et al., 2000). O papel das enzimas ligadas ao cromossomo X envolvidas no metabolismo de energia, especialmente de G6PD, a primeira enzima da pentose via de fosfato (PPP), tem sido considerada como um possível indicador das diferenças de sexo (RIEGER et al., 1992). A via pentose fosfato é quatro vezes mais ativa nos embriões fêmea (TIFFIN et al., 1991), além disso esta enzima também desempenham outras funções, tais como a desintoxicação de radicais de oxigénio (PEIPPO E BREDBACKA, 1995). Estes radicais não estão apenas envolvidos em mecanismos de dano celular, mas eles também têm um efeito estimulante do crescimento Universitári@ - Revista Científica do Unisalesiano Lins SP, ano 7, n.14, jan-jun de 2016 Edição Especial 842

3 (RIEGER et al., 1992). O nível mais baixo de radicais de oxigênio nos embriões fêmea, devido à dose dupla de HPRT, pode ser responsável pelo retardamento no desenvolvimento; portanto, machos, com níveis de radicais de oxigênio adequado, desenvolvem-se mais rápido do que os blastocistos fêmeas (GUTIERREZ et al., 2000). Estes efeitos podem explicar porque os embriões PIV mostram um desvio significativo da proporção de macho:fêmea, já que são expostos a condições ambientais (oxigênio e luz) que facilitam a formação de radicais de oxigênio. 1 OBJETIVO Avaliar a relação macho:fêmea em embriões bovinos produzidos in vitro, de acordo com o estágio de desenvolvimento embrionário. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Aspiração de oócitos das fêmeas doadoras Doadoras das raças Nelore foram aspiradas para a coleta dos oócitos via punção folicular guiada por ultrassom (OPU). Os animais foram contidos e foi realizada a anestesia epidural caudal com 5 ml de lidocaína 2%, a fim de facilitar a manipulação transretal. A vulva e a região perineal foram lavadas com água e secas com papel toalha. Cada ovário foi localizado por palpação retal e direcionado para o transdutor (5 MHz, probe transvaginal, Aloka SSD 500). Após a identificação dos folículos presentes foi realizada a punção dos folículos com diâmetro superior a 3 mm. Os oócitos foram coletados em tubo cônico de 50 ml (Marca BD) com auxílio de bomba vácuo (VMAR-5100, Cook Veterinary Products, Austrália) a uma pressão de 80 mmhg. Após o procedimento de OPU, os oócitos foram lavados em membrana filtrante com solução tamponada de fosfato (PBS, Nutricell), mantida a temperatura de 38 C. Em seguida, foi realizada a contagem e classificação dos oócitos viáveis. Os oócitos selecionados como viáveis foram enviados para o laboratório para a realização dos procedimentos referentes às etapas de maturação, fecundação e cultura in vitro. Universitári@ - Revista Científica do Unisalesiano Lins SP, ano 7, n.14, jan-jun de 2016 Edição Especial 843

4 2.2 Produção in vitro dos embriões Para a realização do procedimento de maturação in vitro (MIV), grupos de 20 a 25 oócitos foram transferidos para placas de Petri (35x10 mm) em gotas de 60 µl meio base de maturação (MM-b), constituído de TCM-199 (M-3769, Sigma Co., St. Louis, USA), 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 50 µg/ml de piruvato de sódio, 50 µg/ml de sulfato de gentamicina, suplementado com 1 g/ml de FSH (Folltropin - V, Bioniche Inc., Canadá), 5 µg/ml de LH (Lutropin Bioniche Inc., Canadá) e 10% de SFB (Nutricell Ltda, Brasil). As gotas foram dispostas sob óleo mineral. A incubação foi realizada em estufa de cultura (Forma Scientific, USA), em atmosfera úmida, com 5% CO 2 e a 39 o C por um período de 24 horas. No procedimento de fertilização in vitro (FIV) foi realizada a seleção espermática pela técnica de gradiente de Percoll. Utilizou-se doses de sêmen de um único touro. Desta forma, em um tubo de 15 ml foi adicionado o volume de 1mL de Percoll a 45% e no fundo do tubo, 1 ml de Percoll a 90%. Os tubos foram colocados em estufa de CO 2, durante 1 hora. Após esse período, uma palheta de sêmen de touro escolhido para o acasalamento, foi descongelada a 37 o C por 30 segundos. A amostra de sêmen foi cuidadosamente, depositada na superfície da solução de Percoll a 45% e o tubo foi submetido à centrifugação a 700 x g, por 20 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi removido e o pellet ressuspendido em 50 µl de meio TALP-FERT (acrescido de 20 µg/ml de heparina e PHE: 2 mm de penicilamina, 1mM de hipotaurina e 250 mm de epinefrina). Posteriormente, foi realizada a contagem espermática em câmara de Neubauer (5 µl da suspensão de espermatozóides em 95 µl de solução formol-salina). A motilidade e o vigor dos espermatozóides foram avaliados por microscopia óptica. Os oócitos foram co-incubados com espermatozóides (concentração final de 1 x 10 6 sptz/100 µl), em gotas de meio TALP-FERT, em atmosfera úmida a 5% de CO 2 a 39 o C durante 20 horas. Na cultura in vitro (CIV) as células do cumulus foram removidas parcialmente, através de sucessivas pipetagens, e os prováveis zigotos foram transferidos para gotas de meio de cultura SOF-m (modificado), onde permaneceram durante as primeiras 52 horas. Ao final desse período, ou seja, 72 horas pós-fecundação (PF) a clivagem foi verificada e 50% de meio fresco foi adicionado às gotas. Este procedimento foi repetido com 120 horas PF. A cultura dos embriões foi realizada sob as mesmas Universitári@ - Revista Científica do Unisalesiano Lins SP, ano 7, n.14, jan-jun de 2016 Edição Especial 844

5 condições descritas para a MIV e FIV. O desenvolvimento embrionário foi monitorado às 72, 144 e 168 horas pós-fecundação. No dia 7 (D7) os embriões resultantes da produção in vitro foram classificados segundo estágio de desenvolvimento embrionário em blastocisto inicial (Bi), blastocisto (BI), blastocisto expandido (Bx) ou blastocisto eclodido (Be), envasados e transportados à temperatura de 36 C até o local onde estavam as receptoras, as quais receberam os embriões. 2.3 Sincronização dos estros e das ovulações no protocolo de TETF As receptoras receberam dispositivo intravaginal contendo progesterona (Cronipress 1g; Biogênesis, Curitiba - PR). Na colocação do dispositivo as novilhas receberam 1 mg de Benzoato de Estradiol (Bioestrogen 1mg; Biogênesis, Curitiba - PR), via IM. O dispositivo permaneceu no animal durante 8 dias. No momento da retirada do dispositivo as novilhas receberam 0,150 mg de D-Cloprostenol (Croniben 0,075mg; Biogênesis, Curitiba - PR), 300 UI de gonadotrofina coriônica equina (Novormon 5000 UI; Intervet Schering, Cotia - SP) e 0,6mg de cipionato de estradiol (ECP 2 mg/ml; Pfizer, São Paulo - SP), todos via IM. As receptoras receberam os embriões e 60 dias após a transferência dos embriões para as receptoras foi realizado o diagnóstico de gestação e sexagem fetal. 2.4 Análise estatística A análise da diferença entre os embriões machos e fêmeas de acordo com o estágio de desenvolvimento embrionário foi feita pelo teste de qui-quadrado, sendo considerado diferença significativa para p<0,05. 3 RESULTADOS Houve um maior número de embriões fêmeas entre os blastocistos expandidos (348 embriões) quando comparado aos machos (322 embriões), já entre Universitári@ - Revista Científica do Unisalesiano Lins SP, ano 7, n.14, jan-jun de 2016 Edição Especial 845

6 os blastocistos a proporção inverteu, sendo 159 embriões fêmeas contra 183 machos. Sendo um total de 507 e 505 embriões, fêmeas e machos, respectivamente (Figura 1). Figura 1 Embriões machos e fêmeas de acordo com o estágio de desenvolvimento (blastocisto BL e blastocisto expandido BX) N embriões a b a b 0 BL BX embrião macho embrião fêmea Fonte: Elaborado pelos autores, a,b Letras diferentes para o mesmo estágio embrionário, indica diferença significativa (p<0,05). 4 DISCUSSÃO A diferente velocidade de desenvolvimento entre os sexos, apesar de resultar em uma maior proporção de machos entre os embriões mais desenvolvidos, não necessariamente resulta em desvio na proporção macho:fêmea no número total dos embriões PIV bovinos (CARVALHO et al., 1996; BREDBACKA e BREDBACKA, 1996 a,b; XU et al., 1992) e ovinos (BERNARDI e DELOUIS, 1996). Constatamos em nosso estudo que entre os blastocistos expandidos PIV havia mais embriões fêmeas. Embora, o metabolismo total da glicose seja o dobro em embriões bovinos Universitári@ - Revista Científica do Unisalesiano Lins SP, ano 7, n.14, jan-jun de 2016 Edição Especial 846

7 machos, fato este que pode estar relacionado com o desenvolvimento mais rápido dos embriões machos (RHEINGANTZ et al., 2004), levando a maior incidência de machos entre os blastocistos expandidos, estes resultados não podem ser usados para inferir o sexo dos embriões PIV, de forma não invasiva, já que há trabalhos controversos. Por exemplo, alguns estudos mostram que os embriões machos desenvolvem-se mais rápidos in vitro do que os embriões fêmeas nos bovinos (Avery et al., 1992, Xu et al, 1992;. Lonergan et al., 1999), enquanto outros não mostraram diferenças na estudando a mesma espécie (Holm et al., 1998), ou de porcino (Kaminski et al., 1996). Estes resultados conflitantes podem ser devido a heterogeneidade na cinética do embrião e subsequentes dificuldades do embrião ao ser cultivado in vitro, em condições ótimas, ou variabilidade de acordo com o doador de sêmen (ALOMAR et al., 2008). CONSIDERAÇÕES FINAIS Estes resultados foram baseados o uso do sêmen de um touro, podendo ser dada sequência ao estudo com o uso de sêmen de outros touros, a fim de fazer uma análise comparativa. Ainda assim, pode-se concluir que o uso do estágio de desenvolvimento embrionário como método não invasivo para sexagem de embriões PIV não é uma técnica confiável em bovinos. Portanto, para atividades em que a fêmea ou macho são determinantes, é recomendável o uso de sêmen sexado. REFERÊNCIAS ALOMAR, M.; TASIAUX, H.; REMACLE, S.; GEORGE, F.; PAUL, D.; DONNAY, I. Kinetics of fertilization and development, and sex ratio of bovine embryos produced using the semen of different bulls. Anim Reprod Sci, v. 107, p , AVERY, B.; JORGENSEN, C.B.; MADISON, V.; GREVE, T. Morphological development and sex of bovine in vitro-fertilized embryos. Mol Reprod Dev, v. 32, p , AVERY, B.; BAK, A.; SCHMIDT, M. Differential cleavage rates and sex Universitári@ - Revista Científica do Unisalesiano Lins SP, ano 7, n.14, jan-jun de 2016 Edição Especial 847

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