EDIVAN SILVO DE OLIVEIRA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

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1 0 EDIVAN SILVO DE OLIVEIRA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO CAMPO GRANDE - MS 2011

2 1 I EDIVAN SILVO DE OLIVEIRA REPRODUÇÃO DE BOVINOS Trabalho apresentado para cumprimento de Avaliação do curso de especialização Lato sensu em Clinica médica e reprodução de eqüinos e bovinos- UNIGRAN. CAMPO GRANDE - MS 2011

3 II 2 SUMÁRIO Página RESUMO... III LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS... IV LISTA DE FIGURAS... V LISTA DE TABELAS... VI 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Programa de transferência de embrião em tempo fixo (TETF) Avaliações de doadoras Avaliações de receptoras Produção in vitro de embriões (PIVE) Controle e sincronização do ciclo estral das receptoras Transferências de embriões Identificação do sexo fetal CONSIDERAÇÕES FINAIS... VII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... VIII

4 3 III RESUMO A pecuária de corte brasileira passou por intensas transformações nos últimos anos, que determinam uma crescente demanda por animais geneticamente superiores, acarretando assim um grande interesse dos produtores pelas biotecnologias da reprodução. A TETF é uma biotecnologia que vem sendo cada vez mais empregada em propriedades da região, por ser uma técnica que contribui com a produção de animais geneticamente superiores. Juntamente com a inseminação artificial e transferência de embriões, a fecundação in vitro é uma técnica responsável pela rápida progressão do rebanho. As variações nos índices de fertilidade na técnica devem-se aos diferentes protocolos utilizados.o diagnóstico de gestação era realizado através do uso da ultrassonografia, em média de quatro semanas após a TETF e a identificação do sexo fetal por ultrassonografia era feito por volta dos 60 dias. Palavras-chave: Fertilização in vitro, reprodução de bovinos, sincronização de estro, TETF.

5 4 IV LISTA ABREVIATURAS E SÍMBOLOS %... Porcentagem... Marca registrada ºC... Graus Celsius BE... Benzoato de estradiol CIV... Cultivo in vitro CL Corpo lúteo ecg... Gonadotrofina coriônica eqüina ECP... Cipionato de estradiol FIV... Fertilização in vitro FSH... Hormônio folículo estimulante h... Horas hcg... Gonadotrofina coriônica humana IA... Inseminação artificial IM... Intra-muscular LH... Hormônio luteinizante MIV... Maturação in vitro ml... Mililitros mm... Milímetros Nº... Número n... Número OPU... Ovum pick up- punção e aspiração folicular guiada por ultrassom transvaginal PIV... Produção in vitro P 4... Progesterona PGF2α... Prostaglandina F2α TE... Transferência de embrião TETF... Transferência de embrião em tempo fixo

6 V 5 LISTA DE FIGURAS Página Figura 01 - Cisto folicular Figura 02 - Ovário superovulado e corpo lúteo cavitário Figura 03 - Receptora apta para programa de TETF Figura 04 - Protocolo I de sincronização de receptoras para TETF Figura 05 - Protocolo II de sincronização de receptoras para TETF Figura 06 - Ovário com presença de corpo lúteo Figura 07 - Identificação do sexo fetal, macho (esquerda) e fêmea (direita)... 33

7 6 1. INTRODUÇÃO A pecuária de corte brasileira passou por intensas transformações nos últimos anos, que determinam uma crescente demanda por animais geneticamente superiores, acarretando assim um grande interesse dos produtores pelas biotecnologias da reprodução. Dentre essas biotécnicas procuradas para aumentar o ganho genético do rebanho estão a inseminação artificial (IA), transferência de embriões (TE) e a produção in vitro de embriões (PIV). Com a IA é possível disseminar o material genético de machos superiores, já na PIV e TE é permitido que as fêmeas também contribuam com o melhoramento genético do rebanho. A transferência de embriões tem como objetivo maximizar o número de descendentes de vacas geneticamente superiores, essas denominadas doadoras de embrião, no qual este embrião antes de implantado no útero é transferido para outra vaca, denominada receptora de embrião, que irá completar a concepção e gestação. A Produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotecnologia reprodutiva utilizada na produção de animais geneticamente superiores, impedindo o descarte de fêmeas geneticamente privilegiadas que possuem alguma alteração adquirida que impeçam a reprodução de ocorrer de forma natural (GONÇALVES, 2008). No mercado de embriões oriundos da FIV, o Brasil é responsável por cerca de 85% do total mundial. Após um período de intenso crescimento, no período de 2002 a 2006, a FIV apresentou uma tendência de estabilização no ano de As raças zebuínas respondem pela maioria absoluta dos embriões produzidos no Brasil, com 94,0% do total (SBTE, 2008).

8 7 2.REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Programa de transferência de embriões em tempo fixo (TETF) Avaliações de doadoras Para dar inicio ao programa de TETF primeiramente é necessário que se faça uma seleção zootécnica da doadora de ovócitos. A OPU associada à PIV foi introduzida com o objetivo de aumentar a capacidade da fêmea de produzir ovócitos férteis, aumentando conseqüentemente o número de descendentes por ano (GONÇALVES et al., 2001). É importante que esta seleção seja criteriosa para que haja o ganho genético nos descendentes, que é o grande objetivo da PIV. Depois de selecionadas as matrizes doadoras pela seleção zootécnica, são realizados avaliações clínicas e ginecológicas, evitando assim o a inclusão de animais com a condição clínica comprometida, seja de ordem geral (alterações no sistema locomotor, digestivo, circulatório e urinário) ou especifica do trato genital (alterações no útero, ovários e ovidutos) no programa de TE (GONÇALVES et al., 2008). Sendo observado o desempenho reprodutivo, regularidade do ciclo estral, histórico do sistema reprodutivo (MENDES, 2005), idade, números de tratamentos recebidos e históricos sanitário. Para avaliação destes critérios são utilizados a palpação retal, ultra-sonografia, avaliação visual e histórico do animal. São descartadas fêmeas que apresentavam índices negativos em programas anteriores e fêmeas com problemas reprodutivos (figura 01).

9 8 Figura 01 - Cisto folicular (problema reprodutivo). No exame ginecológico feito por palpação retal e ultrassonografia transretal avalia-se a consistência e tamanho dos ovários e do útero. São avaliadas ainda a presença e a quantidade de folículos nos ovários e a presença e tamanho do corpo lúteo (figura 02). Figura 02 - Ovário superovulado e Corpo lúteo cavitário respectivamente.

10 9 Na avaliação clínica são observado a condição corporal, que em uma escala de 1 a 5, o ideal seria entre 3 e 4, o balanço energético positivo é importante para maximizar os resultados de superovulação (MENDES,2005) e feita a avaliação sanitária das doadoras. Fazendo programas de assistência à reprodução de forma preventiva e regular no rebanho é possível uma escolha de melhores doadoras e assim alcançar um aumento na eficiência da TE (GONÇALVES, et al.,2008). As fêmeas que apresentam uma população de folículos nos ovários são então selecionadas para o programa de OPU-FIV (ovum pick up fecundação in vitro) Avaliações de receptoras Segundo Gonçalves et al., (2008) as receptoras constituem uma parte fundamental de um programa de TE pois necessitam conceber e levar a gestação a termo. Para a seleção de receptora é fundamental que alguns critérios sejam adotados, como habilidade materna, tamanho em relação raça do embrião, histórico reprodutivo, regularidade dos ciclos, condição corporal e histórico sanitário. São avaliados através do exame clínico geral a condição corporal, idade, a identificação individual dos animais e o manejo sanitário do rebanho, como vacinas preventivas de doenças que afetam o trato reprodutivo (leptospirose, diarréia viral bovina, rinotraqueite infecciosa bovina, brucelose).

11 10 Na avaliação ginecológica, feita por palpação retal e ultrassonografia, são avaliados os ovários, útero e a ciclicidade das fêmeas. Quando novilhas são avaliadas para o programa, é feita a avaliação do trato reprodutivo, sendo introduzidas ao programa somente aquelas fêmeas que já apresentavam corpo lúteo, que é um indicativo de ciclicidade e quando não apresenta alguma anomalia, como útero infantil. As novilhas e as fêmeas primíparas e pluríparas que apresentam ciclo estral regular, que tenham parido, no mínimo, há 60 dias, o puerpério tenha decorrido normalmente e estejam livres de doenças ou anomalias do trato reprodutivo podem ser selecionadas como receptoras de embrião. O tamanho da receptora deve ser compatível com o da raça do embrião transferido, garantindo assim um parto normal sem necessidade de auxilio obstétrico. E que tenha uma produção de leite suficiente para amamentar e permitir que sua cria se desenvolva normalmente (GONÇALVES et al.,2008). A seleção final de uma fêmea como receptora de embrião somente deve ocorrer no dia da transferência em função, principalmente, dos sintomas de estro evidenciados após a sincronização e da avaliação do corpo lúteo cíclico (GONÇALVES et al.,2008). Para obtenção de melhores resultados, grande parte das propriedades utiliza receptoras de cruzamento entre raças européias e zebuínas, conforme figura 03. Desta forma os animais selecionados têm docilidade, habilidade materna e precocidade. Os animais que são aprovados em todos estes quesitos são então aceitos para o programa de TETF, sincronizados e recebem o embrião.

12 11 Figura 03 - receptora apta para o programa de TETF Produção in vitro de embriões (PIVE) É uma biotécnica utilizada, alternativamente para acelerar a produção de animais geneticamente superiores e impedir, pela aspiração in vivo de folículos guiada por ultrassonografia, especialmente em bovinos, o descarte precoce em fêmeas geneticamente privilegiadas, portadoras de alterações adquiridas que impedem que a reprodução ocorra de forma natural ou até mesmo pela transferência de embriões (CONSTANT et al., 2009) A produção in vitro (PIV) de embriões envolve as etapas de coleta de oócitos, maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV), bem como o cultivo in vitro (CIV) de zigotos e estruturas embrionárias (CONSTANT et al., 2009).

13 12 A aspiração folicular (ovum pick up) para obtenção dos ovócitos para serem utilizados na técnica pode ser de punção de ovário in vivo, com auxilio de um ultrassom e um transdutor acoplado a uma guia de aspiração, realização da aspiração mediante introdução de uma agulha no interior de folículos ovarianos e então são coletados os ovócitos. Realização então da lavagem a procura dos ovócitos, e em seguida são enviados para o laboratório responsável. No laboratório esses ovócitos são classificados de acordo com a quantidade de células do cumulus oophurus e a quantidade intracelular, nesta etapa eram classificados em, grau I (cumulus compacto, contendo mais de três camadas de células e citoplasma da célula homogêneo); grau II (cumulus compacto, parcialmente presente ao redor do oócito, com menos de três camadas celulares. O citoplasma da célula possui granulações distribuídas de modo heterogêneo); grau III (cumulus presente, mas expandido. O citoplasma apresenta-se contraído, degenerado, fragmentado ou apresentando vacúolos); desnudo (o citoplasma possui granulações homogêneas, mas as células do cumulus estão ausentes) e atrésicos ( o citoplasma possui granulações irregulares e células do cumulus enegrecidas em meio de maturação)(gonçalves et al.,2008). Os ovócitos então classificados entre grau I e III são colocados em um meio de maturação e colocados em uma placa de cultivo com meio de maturação e posteriormente levados para uma estufa por 22 a 24 horas. Este processo é denominado Maturação in vitro (MIV) Após esta maturação faz-se a fecundação, no qual é utilizado sêmen bovino descongelado e diluído adequadamente, é colocado junto aos gametas femininos, para ser fecundado denominado fertilização in vitro (Figueiró et al.,2004).

14 13 Após 16 a 18 horas, esses prováveis zigotos são lavados em um meio apropriado e colocados em uma placa de Petri contendo um meio de cultura, essa etapa é denominada Cultivo in vitro (CIV). Após 48 horas de realizada a CIV, pode ser realizado o feeding, processo que tem por finalidade substituir o meio de cultura onde estão inseridos os embriões. Este processo é realizado em duas etapas, sendo que a segunda ocorre 48 horas após a primeira. Após sete dias de iniciada a PIV, é feita a avaliação da taxa de produção de embriões em lupa binocular. Neste estágio é comum encontrar as fases de blastocisto, blastocisto inicial, blastocisto expandido, blastocisto eclodido e até mesmo mórulas e embriões degenerados. Com exceção dos dois últimos estágios, os outros podem ser transferidos para uma receptora (GONÇALVES et al.,2008) Controle e sincronização do ciclo estral das receptoras de embrião A sincronização das receptoras é realizada para deixá-las em um estágio do ciclo estral equivalente ao desenvolvimento do embrião. Após a seleção e sincronização das receptoras, no momento da transferência está ainda pode ser descartada do programa caso não esteja nas condições ideais para receber o embrião, seja por ordem reprodutiva, nutricional ou sanitária. A taxa de prenhez nos programas de TETF é fortemente influenciada por essas condições (nutricional, sanitária e reprodutiva) das receptoras de embrião, tornando assim, fundamental que seja feita a avaliação destas no momento da transferência.

15 14 Para que os resultados da inovulação e de prenhez sejam elevados, é necessário a sincronização entre o estágio de desenvolvimento do embrião e o estágio do ciclo estral da receptora (Hafez & Hafez, 2004). Em receptoras, recentes protocolos foram elaborados para controlar o status luteínico e folicular, possibilitando uma eficiente sincronização e permitindo a transferência de embriões sem a necessidade de detecção de estro, denominado de TETF (Bó et al.,2004). No protocolo I, demonstrado na figura 4, as fêmeas recebem o dispositivo intra-vaginal de progesterona (P 4 ), e a aplicação de 2 ml de estrógeno (BE) via intramuscular (IM) no dia 0. No dia 5, recebiam a aplicação de 3 ml de prostaglandina (PGF 2α ) e 2,5 ml de Gonadotrofina coriônica eqüina (ecg), ambas IM. No dia 8, é retirado o dispositivo de progesterona e aplicado 0,3 ml de cipionato de estradiol (E.C.P.) e finalmente no dia 17 é feita a transferência de embrião (TE). Figura 04 - Protocolo I de sincronização de receptoras para TETF. No protocolo II, demonstrado na figura 05, as fêmeas recebem o dispositivo intra-vaginal de progesterona (P 4 ) e a aplicação de 2 ml de estrógeno (BE) via intramuscular no dia 0. No dia 8 é retirado o dispositivo de progesterona, aplicado 3

16 15 ml de prostaglandina ( PGF 2α ), 2 ml de ecg e 0,3 ml de E.C.P., todos via IM. E no dia 17 é feita a transferência de embrião. Figura 05 - Protocolo II de sincronização de receptoras para TETF Transferência de embriões Após as etapas de fecundação in vitro do embrião citada anteriormente, o laboratório envia estes embriões com sete dias de vida para o veterinário responsável pela TE, estes envasados individualmente em palhetas de 0,25 ml cada, em um transportador especifico que mantêm a temperatura média de 36 C. O envasamento na palheta é feito de tal forma que uma coluna central contendo o embrião encontra-se separada das colunas das extremidades por duas colunas de ar. As palhetas devem ser devidamente identificadas para evitar equívocos no momento da transferência (GONÇALVES, et al., 2008). As receptoras selecionadas devem ter manifestado o estro e ovulado sete dias antes da transferência, para que assim estejam em sincronia com o estágio de desenvolvimento do embrião, que foi aspirado 8 dias antes da TE. Com base na estrutura do corpo lúteo (CL) cíclico e outros quesitos já citados, as receptoras então são avaliadas no momento da transferência por palpação retal ou com o auxilio de

17 16 um ultrassom, para identificação do ovário com a presença deste corpo lúteo (figura 06). Animais sem presença de CL ou com CL inferior a 18 mm são descartados do programa. E aquelas que apresentam CL com tamanho entre 18 mm a 24 mm, ou presença de 2 ou mais são consideradas aptas ao programa. Figura 06 - Ovário com presença de corpo lúteo. Depois de identificado e anotado o lado que se encontrava o CL e o tamanho do mesmo a receptora recebe anestesia epidural com 3 ml de lidocaína, para facilitar a técnica,diminuindo as contrações e movimentação do animal. A palheta contendo o embrião é colocada no inovulador que por sua vez é revestido por uma bainha estéril e em seguida por uma camisa plástica sanitária, evitando assim a contaminação uterina. O embrião então é conduzido até o corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo cíclico por via transcervical. As receptoras após a inovulação recebem um brinco contendo o acasalamento, nome da doadora e nome do touro.

18 17 Dentre as vantagens em relação a PIV estão, produção de maior número de filhos de animais superiores, geração de grande número de embriões, reprodução de animais com problemas reprodutivos adquiridos e com final da vida produtiva, fêmeas pré púberes, gestantes e senis e quantidade da dose sêmen utilizada. Um dos grandes problemas da PIV é em relação a baixa fertilidade de embriões congelados e vitrificados. 2.2 Identificação do sexo fetal A identificação do sexo fetal é uma técnica que geralmente é utilizada em animais de maior valor genético, principalmente oriundos de transferência de embriões que pode ser de grande importância a sexagem fetal precoce. A identificação do sexo fetal é realizada com auxilio do ultrassom com alta precisão através da localização do tubérculo genital em média 60 dias após a transferência de embriões. No 48º dia de prenhez, o tubérculo genital pode ser identificado ao ultrassom entre os membros posteriores, mas em posição ainda indefinida para avaliação dos sexos. Por volta de 55 dias de gestação ocorre a migração do tubérculo genital sendo possível a visualização dos tubérculos genitais masculino ou feminino, definindo-se o sexo do concepto. Na fêmea o tubérculo genital migra em sentido posterior próximo a base da cauda e torna-se o clitóris e o tubérculo genital masculino migra em sentido anterior, ate próximo ao cordão umbilical e torna-se o pênis. O tubérculo genital masculino é encontrado caudalmente ao umbigo, enquanto que o feminino se localiza abaixo da cauda (figura 07). Essa estrutura é identificável por apresentar-se altamente brilhante e ecogênica. A detecção do

19 18 tubérculo genital masculino é bem mais fácil. No caso de fetos fêmeas, quando não se observa o tubérculo masculino, deve-se localizar o feminino, sob a cauda, lembrando que o mesmo geralmente apresenta dois ou três lóbulos, enquanto que a cauda é uma estrutura monolobular (BARUFI e MIZUTA, 2000). Figura 07 - Identificação do sexo fetal, macho (esquerda) e fêmea (direita). Para um diagnóstico preciso o feto é examinado cuidadosamente quanto ao posicionamento do tubérculo, analisando principalmente a região umbilical e caudal, confirmando assim o sexo do concepto. Segundo BARROS & VISINTIN (2001) a apresentação do feto em plano longitudinal latero-lateral facilita o diagnóstico do sexo, neste tipo de imagem tem-se a noção exata do posicionamento do tubérculo genital nos machos, mas nas fêmeas o tubérculo apresenta-se junto às vértebras sacrais e coccígeas, dificultando o diagnóstico. No plano longitudinal dorso-ventral há ampla visão do feto, o que facilita o diagnóstico, favorecendo tanto os machos quanto as fêmeas, as quais mostram o tubérculo genital logo abaixo da cauda. No plano transversal, há maior dificuldade de

20 19 diagnóstico tanto dos machos quanto das fêmeas. O mapeamento do feto é demorado e complicado, pois precisam ser visualizados vários planos para determinar o posicionamento do tubérculo.

21 VII 20 CONSIDERAÇÕES FINAIS O desenvolvimento de biotecnologias que permitem transferência de embriões e fertilização in vitro em bovinos possibilita o aumento dos índices reprodutivos em fêmeas bovinas e também permite o melhor aproveitamento de fêmeas com elevados padrões zootécnicos. Com uso da transferência de embrião e da FIV (fecundação in vitro) é possível proporcionar o desenvolvimento de animais superiores e com a ultrassonografia, diagnosticar as gestações cada vez mais cedo, além de possibilitar o acompanhamento da gestação e dos órgãos internos dos animais. Outras técnicas, como a de sexagem, permitem que o proprietário tenha acesso ao sexo do animal, o que lhe possibilita vendê-lo antes mesmo do nascimento. É uma técnica de fácil aplicação, no entanto requerem cuidados e critérios, como de seleção das doadoras, das receptoras, principalmente durante o processo de S.O.V. de implantação dos embriões coletados.

22 21 VIII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARROS, B. J. P.; VISINTIN, J. A. Controle ultrassonográfico de gestações, de mortalidades embrionárias e fetais e do sexo de fetos bovinos zebuínos. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, São Paulo, v. 38, n.2, BARUFI, F.; MIZUTA, K. Aplicações clínicas de ultrassonografia reprodutiva bovina Disponível em: <http://www.beefpoint.com.br>. Acesso em março de BARUSELLI P. S.; BÓ G. A.; REIS, E. L; MARQUES, M. O. Inseminação artificial em tempo fixo em bovinos de corte. Departamento de reprodução animal FMVZ-USP. 1ºsimpósito internacional de reprodução animal aplicada, p. 1-11, BÓ, G. A.; MORENO D.; CUTAIA L. et al. Manipulação hormonal do ciclo estral em doadoras e receptoras de embrião bovino. Acta Scientiae Veterinariae, v. 32, p.1-22, CONSTANT, C. H. O.; PUPULIM, A. G. R.; AGOSTINHO, B. H.; EMANUELLI, I. P.; RIGOLON, L. P.Produção in vitro de embriões bovinos em cultura individual e emgrupo. VI Encontro Internacional de Produção Científica Cesumar, 5p, FIGUEIRÓ, G. M.; LEIVAS, F. G.; RAUBER, L. P.; SÁ FILHO, M. F.; TEICHMANN, C. E.; MEZALLIRA, A.; RUBIN, M. I. B.; SILVA, C. A. M. Produção in vitro de embriões bovinos com soro de égua ou de vaca em estro com ou sem adição de LH/FSH. Ciência rural, Santa Maria, v.34, n.2, p , mar-abr,2004. GONÇALVES, P. B. D.; OLIVEIRA, M. A. L.; MEZZALIRA, A.; MONTAGNER, M. M.; VISITIN, J. A.; COSTA, L. F. S. Produção in vitro de embriões. In: GONÇALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal. 2ª ed. São Paulo: Livraria Roca, 2008, p GONÇALVES, P. B. D.; BARRETA, M. H.; SIQUEIRA, L. C.; ANTONIAZZI, A.Q. Produção in vitro de embriões bovinos. Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p , abril, 2008 HAFEZ, E. S. E; JAINUDEEN M. R; ROSNINA Y. Hormônios, fatores de crescimento e Reprodução. In: HAFEZ, E. S. E; HAFEZ, B. Reprodução Animal. 7ª ed. Barueri: Ed Manole, 2004, p

23 22 MENDES JÚNIOR, J. O. Transferência de embriões e fertilização in vitro. Viçosa- MG, CPT, p VIANA, J. H. M. Mudanças e tendências no mercado de embriões bovinos no Brasil. SBTE- Sociedade Brasileira de tecnologia de embrião, 2008.

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