RELATÓRIO FINAL DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES DE BOVINO E OVINO CONTRATO Nº PBIC/C/AGR/1477/92

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1 RELATÓRIO FINAL (1 de Fevereiro de de Janeiro de 1996) DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES DE BOVINO E OVINO CONTRATO Nº PBIC/C/AGR/1477/92 Instituição Proponente: Estação Zootécnica Nacional - INIA Investigador Responsável: António Eduardo Monteiro Horta Vale de Santarém, 31/01/96

2 FICHA RESUMO 1. INDICAÇÕES GERAIS SOBRE O PROJECTO Nº CONTRATO: JNICT/PBIC/C/AGR/1477/92 TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES DE BOVINO E OVINO 2. ENQUADRAMENTO INSTITUCIONAL INSTITUIÇÃO PROPONENTE NOME: Estação Zootécnica Nacional-INIA MORADA Quinta da Fonte Boa CÓDIGO POSTAL 2000 SANTARÉM LOCALIDADE Vale de Santarém TELEFONE (043) TELEX TELEFAX (043) UNIDADE RESPONSÁVEL PELA EXECUÇÃO NOME: Estação Zootécnica Nacional-INIA MORADA Quinta da Fonte Boa CÓDIGO POSTAL 2000 SANTARÉM LOCALIDADE Vale de Santarém TELEFONE (043) TELEX TELEFAX (043) INSTITUIÇÕES QUE PARTICIPARAM NO PROJECTO NA EXECUÇÃO: ESTAÇÃO ZOOTÉCNICA NACIONAL (EZN) FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA (FMV) NO FINANCIAMENTO: ESTAÇÃO ZOOTÉCNICA NACIONAL 2

3 3. EQUIPA DE INVESTIGAÇÃO INVESTIGADOR RESPONSÁVEL António Eduardo Monteiro Horta EQUIPA DE INVESTIGAÇÃO: NOME FUNÇÃO %TEMPO ENTIDADE António E. M. Horta Inv. responsável 50 EZN Carla Maria F. C. Varanda Ass. Inv. / Técnica FIV 70 EZN Marques Maria da Conceição C. Baptista Ass. Inv. / Técnica FIV 60 EZN Maria Irene A.M. Rios Vasques Ass. Inv./ Endocrinologia 20 EZN Rosa Maria Lino Neto Pereira Ass. Inv. / Técnica FIV 20 EZN António José de Freitas Duarte Bolseiro JNICT 100 FMV Luís Filipe Lopes da Costa Ass. Inv. / Técnica FIV 40 FMV Maria Isabel Silva Santos Técn. Laboratório 50 EZN 3

4 4. RESUMO DO PROJECTO O programa de trabalhos deste projecto teve por objectivo a implementação de técnicas in vitro de produção de embriões de bovino e ovino. A metodologia incluiu o desenvolvimento de: 1)- Técnicas de maturação in vitro de oocitos recolhidos de fêmeas abatidas em matadouro. Os oocitos foram recolhidos a partir de folículos antrais; 2)- Técnicas de capacitação do sémen e fertilização in vitro de oocitos maturados; 3)- Técnicas de cultura de embriões. O projecto submetido previa para o 1º ano de execução a implementação das técnicas de aspiração folicular, lavagem, selecção e maturação dos oocitos recolhidos bem como o aperfeiçoamento e treino da técnica de capacitação espermática e da fertilização in vitro. No 2º ano de execução, dada a grande variação observada nos resultados, especialmente aqueles relativos às taxas de fertilização, a nossa atenção concentrou-se na comparação de sémen de diferentes touros relativamente à sua capacidade de fertilizar in vitro oocitos maturados. Para cada touro foi avaliada a concentração de sémen obtida após o "swim up", tendo-se correlacionado esta concentração com a taxa de fertilização.e com a taxa de sobrevivência dos embriões obtidos. Os resultados mostram a necessidade de se seleccionarem os touros a utilizar na fertilização in vitro dadas as diferenças significativas observadas. Embora a utilização do melhor touro tenha diminuído a variação da taxa de fertilização, continuou a observar-se uma elevada variação nos resultados relativos à taxa de sobrevivência dos embriões. Isto levou à realização de várias alterações no método como a utilização de água produzida por um laboratório de referência, a selecção de touros e controlo da concentração de espermatozóides utilizados na fertilização in vitro, o efeito da remoção da neomicina na associação antibiótica utilizada em todos os meios de cultura (melhoria da qualidade dos embriões) e modificações estratégicas na utilização da cafeína. Estas experiências foram efectuadas no 3º ano de execução do projecto. A produção de embriões de ovino não foi plenamente satisfeita devido à necessidade de concentrarmos a nossa atenção na diminuição da variação das taxas de produção de embriões bovinos. De qualquer forma, o método utilizado para bovinos permitiu o desenvolvimento de embriões de ovino fertilizados in vivo. A transferência dos embriões produzidos foi testada em vacas Charolesas, Holstein e Alentejanas, tendo os primeiros vitelos nascido em Agosto e Setembro de Os melhores resultados foram obtidos na raça Frísia, tendo-se atingido 20% de taxas de parição. Os resultados relativos às taxas de gestação referem-se a embriões produzidos antes das alterações introduzidas no método, esperando-se que venham a melhorar com a transferência de embriões produzidos na ausência dos factores negativos entretanto identificados. 4

5 5. PUBLICAÇÕES Marques, C.C., Baptista, M.C., Pereira, R.M., Vasques, M.I., Lopes da Costa, L.F., Horta, A.E.M. (1995). Influência do sémen de diferentes touros sobre as taxas de fertilização in vitro e desenvolvimento de embriões em co-cultura. Revista Portuguesa de Zootecnia, 2(2):

6 RELATÓRIO DE EXECUÇÃO MATERIAL 6

7 A - MÉTODOS E TÉCNICAS INICIAIS 1. Aspiração Folicular e Cultura de Oocitos (maturação oocitária) Os ovários de vacas e novilhas, foram colhidos nos matadouros de Lisboa (PEC) e Santarém (Santacarnes) e transportados para o laboratório de fertilização in vitro (EZN) num termos contendo uma solução salina fosfatada e tamponizada (PBS) a 37ºC. O intervalo de tempo entre a colheita dos ovários e o seu processamento no laboratório não excede as 2 horas. A solução fosfatada é suplementada com albumina sérica bovina (BSA) e antibiótico (sulfato de kanamicina). Esta solução deve ser preparada no prazo máximo de três dias anteriores à sua utilização. No laboratório, os ovários são lavados de duas a três vezes em PBS e colocados em banho-maria a 37ºC. Os folículos não atrésicos de 2 a 6 mm ( ), reconhecidos à superfície do ovário pela sua aparência (brilhante, tensa, fina vascularização), são aspirados com agulha 19G ( ) e seringa de 10 ml. O líquido folicular obtido é colectado para tubos de fundo cónico, esterilizados, contendo já o líquido de lavagem (W 1 : Meio 199 suplementado com sais de Earle, 5% de soro de vaca em cio ou de macho castrado e antibióticos - penicilina, estreptomicina e neomicina) estabilizado previamente na incubadora a 39ºC em atmosfera de CO2 a 5% e humidade saturada durante 1 hora. Os folículos atrésicos, escuros e cinzentos, não devem ser aspirados, assim como aqueles de superior a 8 mm. Após a aspiração de todos os folículos, o sobrenadante do líquido folicular é desprezado e o resíduo vertido para várias placas de Petri de 50 mm de e diluído com líquido de lavagem (W 1 ). Apenas são seleccionados à lupa os oocitos: 1. com citoplasma uniforme (não granulado), 2. envolvidos com 3-4 camadas de células do cumulus oophurus, 3. com células da granulosa não dispersas. Os oocitos seleccionados são transferidos com a ajuda de uma pipeta para placas de Petri contendo o líquido de lavagem (W 1 ) e, se necessário, novamente transferidos para outra placa com o mesmo meio. Finalmente são colocados em placas de Petri com 2 ml de meio de cultura de oocitos (CM ooc. = TCM 199 suplementado com sais de Earle, 10% de soro de vaca em cio ou de macho castrado e antibióticos). A este meio adicionam-se algumas células da granulosa frescas, resultantes da aspiração dos folículos. A osmolaridade dos meios pode variar entre 256 e 300 mosm, observando-se um completo bloqueio ao desenvolvimento in vitro dos embriões bovinos quando atinge os 356 mosm. 2. Preparação do Sémen (capacitação in vitro) e Fertilização in vitro dos Oocitos a) Meios Utilizados e sua Constituição - Meio de lavagem dos oocitos maturados (W 2 : mosm; ph 7,3-7,4): 7

8 NaCl + KCl + NaHCO3 + NaH2PO4 2H2O + Na-Lactato + MgCl2 6H2O + CaCl2 2H2O + HEPES + Fenol-Red + Na-Piruvato + BSA (Bovine Serum Albumin) + Glicose + Antibióticos (Penicilina + estreptomicina + neomicina). A neomicina foi posteriormente suprimida. - Meio de fertilização (FERT: 300 mosm; ph 7,8): NaCl + KCl + NaHCO3 + NaH2PO4 2H2O + Na-Lactato + MgCl2 6H2O + CaCl2 2H2O + HEPES + Fenol-Red + Na-Piruvato + BSA (Bovine Serum Albumin) + Glicose + Heparina + Antibióticos + Cafeína + PHE (penicilamina, hipotaurina e epinefrina em solução salina a 9% de NaCl). A cafeína foi posteriormente retirada deste meio, passando a utilizar-se no meio CAP. - Meio de capacitação espermática (CAP: 296 mosm; ph 7,3-7,4): NaCl + KCl + NaHCO3 + NaH2PO4 2H2O + Na-Lactato + MgCl2 6H2O + HEPES + Na-Piruvato + BSA (Bovine Serum Albumin) + Glicose b) Preparação das placas de Petri para a fertilização 1. Os meios de lavagem (W 2 ) dos oocitos e de swim-up são colocados em estufa de CO2 pelo menos durante 1 hora antes da sua utilização; 2. Colocam-se 12 gotas de meio de fertilização (40 µl) submersas em 8 ml de óleo mineral, em placas de Petri ; 3. As placas preparadas são colocadas na estufa de CO2 até serem utilizadas. c) Preparação do sémen (capacitação) e fertillização in vitro 1. Colocação de 1,2 ml de meio de capacitação em tubos de ensaio esterilizados, com uma seringa de 1ml de capacidade; 2. Descongelação do sémen contido em mini-palhinhas de Cassou em água a 38ºC durante segundos (1 palhinha de sémen para cerca de 200 oocitos); 3. Verte-se o sémen descongelado para um tubo de ensaio vazio e esterilizado; 4. A quantidade de sémen disponível é repartida em partes iguais nos tubos que contêm o meio swim-up, sendo depositado lentamente apoiando a agulha no fundo do tubo sem borbulhar; 5. Os tubos contendo o sémen e o meio de swim-up são incubados em atmosfera da CO2 a 39ºC durante 60 minutos, para permitir a subida dos espermatozóides para a superfície do meio (swim-up); 6. Enquanto se realiza o swim-up procede-se à observação, lavagem e selecção dos oocitos previamente incubados; 7. A selecção é feita de acordo com a aparência morfológica dos oocitos (o citoplasma deve ser uniforme e não granulado, estar circundado por 3-4 camadas de células do cumulus, e devem apresentar-se expandidos); 8. Após a lavagem (remoção das células granulosas excedentárias) e selecção, colocam- -se 10 oocitos em cada uma das gotas do meio de fertilização anteriormente preparadas; 8

9 9. Após o período de swim-up retirar os tubos com o sémen da estufa incubadora e aspirar o sobrenadante com a ajuda de uma micro-pipeta e depositá-lo em tubo de centrífuga; 10. O sobrenadante é centrifugado a 1800 r.p.m. (500 g) durante 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante está pronto para ser utilizado por um período de 3 horas. 11. De acordo com a concentração espermática final obtida, depositam-se 2 a 5 µl de sémen em cada uma das gotas de meio de fertilização contendo os oocitos maturos, de forma a obter uma concentração final de 1 x 10 6 spz/ml; 12. As placas contendo os oocitos e o sémen são incubadas em atmosfera saturada de humidade e 5% de CO2 a 39ºC durante 22 a 24 horas. 3. Co-cultura dos embriões a) Cultura de células da granulosa em monocamada : 1. Os ovários destinados à colheita de células da granulosa (8 a 10 ovários) são transportados a frio (±5ºC) desde o matadouroaté ao laboratório em meio PBS preparado como anteriormente referido; 2. Os folículos são aspirados com W1 a frio e, ao líquido de recolha são retirados os oocitos, após decantação; 3. Após selecção dos oocitos, o líquido de aspiração é colocado em tubo de centrífuga graduado com rebordo, deixando-se decantar ou centrifugar durante 5 minutos a 100 g (±1500 r.p.m.); 4. Após centrifugação retira-se o sobrenadante e completa-se com meio de cultura de oocitos numa diluição de 1:20; 5. Com a ajuda de uma seringa de 1 ml e agulha 19G1 faz-se um macerado; 6. Retiram-se 20 µl do macerado, juntam-se 20 µl de Tripan Blue e observa-se em câmara de Neubauer a viabilidade e a concentração das células; 7. Por diluição, a concentração final é ajustada a 1 x 10 6 células/ml; 8. Colocam-se gotas de 100 µl do preparado anterior em placas de cultura NUNC que são submersas em óleo mineral. As placas são colocadas na estufa a 39ºC em atmosfera com 5% de CO2 e saturação de humidade durante 48 horas. b) Co-cultura de embriões: 1. Após a inseminação (22 a 24 h) transferem-se os oocitos para placas de cultura previamente preparadas com 8 gotas contendo monocamada de células da granulosa refrescadas com meio de cultura de embriões (TCM 199 suplementado com sais de Earle, 10% de soro de vaca em cio e antibióticos); 2. Colocam-se de novo na estufa em atmosfera de CO2 a 39ºC onde permanecem durante 24 horas; 3. Após este prazo é verificada a taxa de clivagem embrionária (2-4 células) e escolhidos os embriões clivados que prosseguirão o seu desenvolvimento em co-cultura até à fase de mórula compacta, de jovem blastocisto ou blastocisto; 9

10 4. Os oocitos não fertilizados são retirados às 48 horas após a inseminação e o meio de cultura é refrescado. O excesso de células da granulosa que por vezes se forma é retirado; 5. Os embriões permanecem em contacto com a monocamada de células da granulosa durante todo o período de cultura (em estufa a 39ºC com atmosfera saturada em humidade e 5% de CO2), fazendo-se o refrescamento do meio de cultura e limpeza das células excedentárias de 2 em 2 dias. 4. Sinopse estatística dos resultados obtidos ao longo do projecto A estatística descritiva apresentada foi coligida de todas as sessões de trabalho desde Janeiro de Inclui a variação inerente aos vários factores influentes na técnica, destinando-se a permitir ter uma ideia global do trabalho desenvolvido. Tabela 1. Número de ovários e de oocitos recolhidos, cultivados, maturados e clivados. Sessões (n) Média d.p. Mínimo Máximo Soma Ovários recolhidos Oocitos recolhidos Oocitos cultivados Oocitos maturados Clivados Embriões Tabela 2. Taxas de oocitos recolhidos por ovário, cultivados, maturados, clivados e de embriões produzidos Sessões (n) Média d.p. Mínimo Máximo Oocitos por ovário Taxa de cultivados Taxa de maturação Taxa de clivagem Taxa de embriões Variação da taxa de maturação oocitária ao longo do projecto. 0.9 Taxa de maturação oocitária Sessões de trabalho entre Jan/94 e Jan/96 10

11 1.1 Variação da taxa de fertilização in vitro ao longo do projecto 0.9 Taxa de fertilização Sessões de trabalho entre Jan/94 e Jan/ Variação da taxa de embriões D7-D8 ao longo do projecto 0.45 Taxa de embriões (D7-D8) Sessões de trabalho entre Jan/94 e Jan/96 11

12 B - ALTERAÇÕES INTRODUZIDAS Estudo 1 (publicado na Revista Portuguesa de Zootecnia, 2(2): ; 1995): Influência do sémen de diferentes touros sobre as taxas de fertilização in vitro e desenvolvimento de embriões em co-cultura. Resumo São apresentados os resultados relativos às taxas de fertilização in vitro (FIV) e desenvolvimento de embriões em co-cultura com células da granulosa em monocamada. Foi estudado o efeito do sémen de 5 touros diferentes sobre aqueles parâmetros. Durante o ano de 1994, realizaram-se 63 sessões a partir de uma população de oocitos aspirados de 2326 ovários bovinos colhidos em matadouro. Em cada sessão de fertilização utilizaram-se pelo menos dois dos touros estudados, tendo-se inseminado oocitos maturados (a partir de oocitos colocados em cultura). O sémen utilizado na fertilização in vitro foi previamente tratado pela técnica do swim-up. A concentração de espermatozóides obtida foi avaliada por densidade óptica. Quer a taxa de fertilização (mínimo: 21,9 ± 8,6%, máximo: 50,8 ± 3,3%%), quer a taxa de sobrevivência embrionária (mínimo: 15,8 ± 4,5%, máximo: 32,6 ± 3,4%) foram influenciadas pelo factor touro. Não existiu correlação entre a taxa de fertilização e a sobrevivência dos embriões (r=0,56; P>0,05). A concentração espermática após o swim-up esteve correlacionada com a taxa de sobrevivência dos embriões (r=0,95; P<0,05), mas não apresentou correlação com a taxa de fertilização (r=0,44; p>0,05). Touros da mesma raça apresentaram diferenças significativas quer para a taxa de fertilização, quer para a taxa de sobrevivência embrionária. Lotes diferentes do mesmo touro apresentaram taxas de fertilização significativamente diferentes Introdução A selecção de touros para a fertilização de oocitos e produção de embriões in vitro reveste-se de grande importância na garantia de rendimentos aceitáveis desta técnica, pois as características do sémen e a qualidade dos oocitos são dois factores determinantes em todo o processo de fertilização in vitro (Lonergan, 1994). Tem sido referida uma elevada variabilidade da taxa de fertilização in vitro associada ao factor touro (Shi et al., 1990), manifestando-se ao nível das percentagens de clivagem (taxa de fertilização) e de embriões que atingem o estadio de blastocito, bem como e da viabilidade dos embriões produzidos (DeJarnette et al., 1992; Sacke et al., 1994). Outros autores referem ainda variações associadas à utilização de diferentes lotes de sémen do mesmo touro e mesmo de diferentes palhinhas do mesmo lote (Otai et al., 1993). Este trabalho teve por objectivo comparar os resultados referentes à FIV e crescimento de embriões em co-cultura entre touros de raças diferentes, utilizados no nosso laboratório durante o ano de Material e métodos 1. Aspiração folicular e maturação dos oocitos Os ovários de bovino foram colhidos no matadouro local de Santarém (Santacarnes), imediatamente após o abate, e transportados para o laboratório de embriologia (EZN) em 12

13 solução salina fosfatada e tamponada (PBS) a 37º C. O intervalo de tempo entre a recolha dos ovários e o seu processamento no laboratório não excedeu, em média, duas horas. No laboratório, os ovários são lavados duas a três vezes em PBS e colocados em banho-maria a 37º C. Procede-se então à aspiração do líquido folicular a partir dos folículos não atrésicos de 2 a 6 mm de diâmetro. A recolha e selecção dos complexos cumulus - oocito é feita à lupa em meio de lavagem próprio. Os oocitos são seguidamente colocados em cultura durante 24 horas em atmosfera saturada de humidade com 5% de CO 2 a 39º C. O meio de cultura dos oocitos é constituído por TCM-199 suplementado com 10% de soro de vaca em cio (OCS) e antibiótico. Após a cultura, os oocitos são libertados das células do cumulus-oophorus através de passagens sucessivas em meio próprio com pipeta fina e colocados em gotas de 40 µl de meio de fertilização (meio Tyrodes modificado, suplementado com heparina e cafeína). A este meio serão adicionados os espermatozóides (spz) depois de sofrerem um processo de de lavagem e selecção (swim-up e centrifugação). 2. Capacitação e fertilização O sémen é preparado segundo a técnica de Lu et al. (1987), em meio Tyrodes sem Ca 2+. Após a descongelação, realizada a 37-38ºC durante segundos, o sémen é colocado em tubos de vidro onde se encontra o meio de capacitação, indo a incubar em atmosfera de 5% de CO 2 a 39º C durante cerca de 60 minutos. Após o swim-up, retira-se o sobrenadante (contendo os spz que conseguiram subir no meio) para tubos de fundo cónico e procede-se à sua centrifugação a 1800 r.p.m. durante 10 minutos. O eluato concentrado com spz é distribuído (cerca de 4 µl por gota) pelas gotas de meio contendo os oocitos maturados para permitir a fertilização. A concentração final de spz obtida é avaliada por fotometria em que a densidade óptica é convertida em concentração espermática, utilizando uma equação ajustada anteriormente por contagens sucessivas ao microscópio (em hematocitómetro de Neubauer), utilizando os valores médios (5 leituras) de 9 pontos representando as concentrações esperadas (Y = a. X b, R 2 =0,987; Figura 1). Figura 1 - Equação standard utilizada para determinar a concentração de espermatozóides após o swim-up a partir dos valores da densidade óptica obtidos por fotometria (spz/ml = ,6. X 1, ). Spz/ml x ,5 1 0,5 0 0,02 0,03 0,05 0,1 0,2 0,3 0,5 1 Densidade Óptica Vinte e duas a vinte e quatro horas após a fertilização e nas condições de incubação já descritas, os oocitos inseminados são transferidos para placas de cultura com monocamada de 13

14 células da granulosa e, 24 horas depois, calcula-se a taxa de fertilização pela contagem dos embriões clivados (2-4 células). Os oocitos fertilizados continuam em co-cultura até à fase de mórula compacta ou jovem blastocito (8 dias de idade). Os resultados apresentados dizem respeito a uma população inicial de oocitos aspirados de 2326 ovários de várias raças bovinas. Foram inseminados oocitos a partir de colocados em cultura, traduzindo-se numa taxa de maturação média de 78 ± 11% (média ± dp). Estes oocitos foram fertilizados com o sémen dos seguintes touros: Chic, Vinícola e Fritz da raça Charolesa, Calipso (Frísia) e Esmo (Alentejana). O touro Chic não entra na comparação dos resultados relativos ao desenvolvimento embrionário visto que nas 4 sessões de fertilização em que entrou não conseguiu apresentar amostragem suficiente para tratamento estatístico ulterior. Para dois lotes de sémen do touro Calipso realizou-se a comparação relativamente à taxa de fertilização (Lote1: n=17, congelado a 26/11/90; Lote2: n=27, congelado a 22/7/91). A taxa de fertilização (oocitos fertilizados/oocitos maturados), concentração de spz, e taxa de sobrevivência dos embriões em cultura (embriões viáveis com 8 dias de idade/embriões clivados), reflectem as médias de diferentes sessões para cada touro. Em cada sessão de fertilização utilizou-se o sémen de, pelo menos, dois dos 5 touros comparados. As médias obtidas foram comparadas por análise de variância e teste das menores diferenças significativas (LSD) (Statgraphics, 1986). Os desvios às médias apresentados no texto representam o erro padrão interno. As correlações apresentadas foram calculadas pelo método de Pearson (Statgraphics, 1986). Resultados Na tabela 1 apresentam-se os resultados relativos à taxa de fertilização in vitro obtidos com cinco touros diferentes num total de 135 sessões de trabalho. Houve diferenças significativas entre os touros estudados (P<0,0049), registando-se coeficientes de variação das médias muito elevados (35-79%). A taxa de fertilização mais elevada foi a conseguida pelo touro de raça Alentejana Esmo (50,8 ± 3,3%) e a mais baixa do touro Chic de raça Charolesa (21,9 ± 8,6%). Dois dos três touros de raça Charolesa mostraram diferenças significativas entre si (21,9 ± 8,6% vs 49,4 ± 3,8%, respectivamente para os touros Chic e Fritz). Tabela 1 - Taxas de fertilização obidas com sémen de diferentes touros (Análise de variância e LSD das médias). Touro (n) Média EP interno Coef. Var. LSD das médias (95%) Chic 4 0,2191 a 0,0860 0,79 0,0756 0,3626 Vinicola 9 0,3512 ab 0,0793 0,68 0,2556 0,4469 Calipso 67 0,3855 a 0,0262 0,56 0,3505 0,4206 Fritz 20 0,4941 bc 0,0384 0,35 0,4299 0,5582 Esmo 35 0,5080 c 0,0335 0,39 0,4595 0,5565 Total 135 0,4262 0,0177 0,50 0,4015 0,4509 Médias com sobrescritos diferentes apresentam diferenças significativas (P<0,0049) 14

15 Observaram-se diferenças significativas entre dois lotes de sémen do mesmo touro (Calipso) relativamente à taxa de fertilização (lote1: 46,9 ± 3,8% vs lote2: 31,7 ± 3,8%; P<0,01). A concentração espermática média obtida depois da capacitação foi idêntica entre os touros Vinícola, Calipso e Esmo ( spz/ml, spz/ml e spz/ml, respectivamente; P>0,05; Tabela 2 e Figura 2). O touro Fritz apresentou uma concentração espermática média, após a capacitação, significativamente superior à dos restantes touros ( spz/ml; P<0,03). Não houve correlação significativa entre a concentração espermática e a taxa de fertilização in vitro (r=0,44; P>0,05). Figura 2 - Concentração de spz avaliada por densidade óptica, após o swim-up. 0.3 b 0.25 ANOVA: P<0,0295 (média ± LSD 95%) Densidade óptica a a a spz/ml spz/ml spz/ml spz/ml Frísio Charolês Charolês Alentejano Calipso Fritz Vinícola Esmo Tabela 2 - Concentração de spz (densidade óptica) após o swim-up (Análise de variância e LSD das médias). Touro (n) Média EP interno Coef. Var. LSD das médias (95%) Calipso 35 0,1497 a 0,0238 0,94 0,1183 0,1812 Esmo 25 0,1169 a 0,0291 1,25 0,0797 0,1542 Fritz 18 0,2330 b 0,0281 0,51 0,1891 0,2768 Vinicola 9 0,1096 a 0,0202 0,55 0,0476 0,1717 Total 87 0,1534 0,0142 0,89 0,1334 0,1733 Médias com sobrescritos diferentes apresentam diferenças significativas (P<0,0295) As taxas de sobrevivência dos embriões em co-cultura relativamente a cada um dos grupos estudados, entre as 48 horas e os 8 dias pós-fertilização, são apresentadas na Tabela 3. 15

16 Tabela 3 - Taxa de sobrevivência dos embriões em co-cultura entre as 48h e os 8 dias de vida, após fertilização com sémen de diferentes touros (Análise de variância e LSD das médias). Touro (n) Média EP interno Coef. Var. LSD das médias (95%) Calipso 58 0,1643 a 0,0242 1,12 0,1349 0,1936 Esmo 33 0,1707 a 0,0191 0,64 0,1318 0,2096 Fritz 22 0,3262 b 0,0346 0,50 0,2785 0,3739 Vinicola 9 0,1585 a 0,0449 0,85 0,0839 0,2330 Total 122 0,1948 0,0145 0,87 0,1745 0,2150 Médias com sobrescritos diferentes apresentam diferenças significativas (P<0,0007) Os embriões fertilizados pelo touro Fritz apresentaram uma taxa de sobrevivência significativamente superior à dos outros três animais (0,32 vs 0,16, 0,17 e 0,16, respectivamente com os touros Calipso, Esmo e Vinícola; P<0,0007). Verificou-se existir uma correlação positiva e significativa entre a concentração espermática após a capacitação e a taxa de sobrevivência dos embriões (r=0,95; P<0,05), em que os embriões fertilizados pelos espermatozóides oriundos de touros com menores concentrações espermáticas após a capacitação, apresentaram menor capacidade de sobrevivência entre a clivagem e os 8 dias de idade. Não houve correlação significativa entre a taxa de fertilização e a taxa de sobrevivência dos embriões (r=0,56; P>0,05) Discussão e conclusões Os resultados apresentados, tal como os de outros autores (Hillery et al., 1990; Shi et al., 1990; Bárándi et al., 1993; Saacke et al., 1994), confirmam que o factor touro se reveste de importância determinante quer ao nível da capacidade de fertilização (número de embriões clivados), quer ao nível da capacidade de crescimento dos embriões clivados até à fase de mórula ou jovem blastocito. Alguns autores referem a existência de variações atribuídas à utilização de diferentes lotes do mesmo touro (Otoi et al., 1993; Lonergan, 1994). Neste trabalho, este aspecto foi confirmado num dos touros em que se utilizaram dois lotes diferentes. Neste trabalho como em anteriores (Lonergan, 1994), verificou-se que não existe correlação entre a taxa de fertilização e a taxa de sobrevivência dos embriões. Não se detectou neste trabalho nenhuma relação entre a concentração dos espermatozóides e a taxa de fertilização sugerindo que as concentrações espermáticas obtidas no final do processo de swim-up não constituíram factor limitante à fertilização in vitro. Ling e Lu (1990), utilizando diferentes concentrações de sémen, verificaram que a partir de uma concentração espermática superior a 1,6x10 6 spz/ml a taxa de fertilização diminui. No nosso trabalho nunca se obtiveram concentrações tão elevadas após o swim-up. No entanto, a taxa de desenvolvimento dos embriões fecundados até à fase de mórula/jovem blastocito esteve positiva e significativamente correlacionada com a concentração espermática obtida após o swim-up. Em estudos de fertilização in vivo através da inseminação artificial de vacas superovuladas, DeJarnette et al. (1992) verificaram que quanto maior for o número de espermatozóides acessórios competindo simultaneamente para a fertilização dos oocitos, maior é a taxa de viabilidade e qualidade dos embriões obtidos. Estes autores verificaram igualmente que aumentando a concentração espermática, aumenta o número de 16

17 espermatozóides acessórios, o que sendo transposto para a fertilização in vitro explicaria os resultados obtidos neste trabalho. Bibliografia BÁRÁNDI, Z.S., SOLTI, L., CSEH, S., VARGA, Z.S., MACHATY, Z. e VAJTA, G., Comparison of the in vitro fertilizing ability of sperm from endangered Hungarian Grey bulls. Anim. Reprod. Sci. 31: DeJARNETTE, J.M., SAACKE, R.G., BAME, J. e VOGLER, C.J., Accessory sperm: Their importance to fertility and embryo quality and attempts to alter their numbers in artificial inseminated cattle. J. Anim. Sci., 70: HILLERY, F.L., PARRISH, J.J. e FIRST, N.L., Bull specific effect on fertilization and embryonic development in vitro. Theriogenology, 33: 249 LING, Z.J. e LU, K.H., Frequency of cleavage and development of in vitro bovine oocytes fertilized in different numbers in drops with different sperm concentrations. Theriogenology 33: 275. LONERGAN, P., The application of in vitro fertilization techniques to the prediction of bull fertility, Reprod. Dom. Anim. 29: LU, K.H., GORDON, I., CHEN, H.B. e McGORVEN, H., In vitro culture of early bovine embryos derived from in vitro fertilization of follicular oocytes matured in vitro. In: Proc. 3rd Scientific Meeting European Embryo Transfer Association (Lyon): 70. OTOI, T., TACHIKAWA, S., KONDO, S. e SUZUKI, T., Effects of different lots of semen from de same bull on in vitro development of bovine oocytes fertilized in vitro. Theriogenology, 39: SAACKE, R.G., NADIR, S. e NEBEL, R.L., Relationship of semen quality to sperm transport, fertility and embryo quality in ruminants. Theriogenology, 41: SHI, D.S., LU, K.H. e GORDON I., Effects of bulls on fertlization on bovine oocytes and their subsequent development in vitro. Theriogenology, 3: 324 STATGRAPHICS, In: User's Guide. Statistical Graphics System, Ed. by Statistical Graphics Corporation, Copyright 1986 STSC. Inc., ISBN

18 Estudo 2: Efeito da presença de neomicina na constituição dos meios de cultura sobre o desenvolvimento de embriões bovinos cultivados in vitro. Introdução: Na constituição dos meios de cultura dos embriões utilizou-se inicialmente uma associação antibiótica contendo penicilina estreptomicina e neomicina do laboratório SIGMA. De acordo com o fabricante esta associação foi testada na cultura de células in vitro. Na bibliografia consultada, não se encontrou nenhuma referência à inclusão de neomicina nos protocolos de cultura de embriões. Este estudo teve por objectivo testar o efeito da presença de neomicina nos meios de cultura sobre a produção de embriões bovinos. Material e métodos Foram utilizadas duas associações de antibióticos nos meios de maturação e fertilização dos oocitos, bem como nos meios de co-cultura de embriões. No grupo I utilizouse uma associação contendo penicilina (100 UI/ml) e estreptomicina (100 µg/ml) e no grupo II à mesma associação foi adicionada a neomicina (200 µg/ml). A experiência decorreu durante 3 meses em 11 sessões de cultura. Os oocitos foram aspirados de folículos de vacas abatidas em matadouro. Após maturação in vitro, eles foram seleccionados e divididos entre os dois grupos para serem submetidos a fertilização in vitro (grupo I = 771 e grupo II = 622 oocitos maturados). Para a fertilização foi utilizado o sémen do mesmo touro após descongelação e tratado pela técnica do "swim-up" anteriormente descrita. A clivagem foi detectada 48 horas depois do início da incubação. Os embriões foram classificados entre o dia 7 e 10 de cultura, de acordo com os seguintes estadios de desenvolvimento: mórula (M), jovem blastocito (JBL), blastocito (BL), blastocito expandido (BLE) e blastocito extrusado (EXT). O grau de qualidade dos embriões obtidos em dia 8, independentemente do estadio de desenvolvimento foi igualmente considerada, utilizando uma pontuação escalada de 1 a 4 em que ao valor mais baixo correspondem embriões de melhor qualidade. Os resultados entre os diferentes grupos foram comparados estatisticamente pelo método de qui-quadrado. Resultados: Os resultados expressos nas Figuras 1-4 mostram claramente que para períodos de cultura idênticos, os embriões do grupo I (sem neomicina) apresentam um crescimento mais acelerado. Neste grupo os embriões atingem estadios mais avançados e mais cedo do que no grupo II (maiores percentagens relativas de blastocitos (+23%) que jovens blastocitos (- 30%)ao 7º dia, de extrusados (+17%) que de blastocitos (-11%) ao 9º dia e de blastocitos expandidos (+15%) que de blastocitos (-10%) ao 10º dia). Tabela 1. Influência da neomicina na taxa de fertilização Grupo Oocitos maturados (n) Oocitos Clivados Não Clivados Taxa de fertilização Sem neomicina Com neomicina Significância (χ 2 ) P>

19 Figuras 1-4. Distribuição de embriões em diferentes estadios de desenvolvimento entre o 7º e 10º dias de cultura (conjunto de 11 réplicas). M (mórula); JBL (jovem blastocito); BL (blastocito); BLE (blastocito expandido); EXT (blastocito extrusado). Fig. 1. Distribuição da produção de embriões ao 7º dia de cultura P<0.006 Sem neomicina Com neomicina % P< M JBL BL BLE EXT Dia 7 Grupo/estadio M JBL BL BLE Total (n) I (sem neomicina) II (com neomicina) Significância (I vs II) P>0.05 P P 0.02 P> Fig. 2. Distribuição da produção de embriões ao 8º dia de cultura Sem neomicina Com neomicina % M JBL BL BLE EXT Dia 8 Grupo/estadio BL BLE EXT Total (n) I (sem neomicina) II (com neomicina) Significância (I vs II) P>0.05 P>0.05 P>

20 Fig. 3. Distribuição da produção de embriões ao 9º dia de cultura Sem neomicina Com neomicina % P<0.03 P< M JBL BL BLE EXT Dia 9 Grupo/estadio BL BLE EXT Total (n) I (sem neomicina) II (com neomicina) Significância (I vs II) P 0.03 P>0.05 P Fig. 4. Distribuição da produção de embriões ao 10º dia de cultura. % P<0.05 Sem neomicina Com neomicina 20 P< M JBL BL BLE EXT Dia 10 Grupo/estadio BL BLE EXT Total (n) I (sem neomicina) II (com neomicina) Significância (I vs II) P 0.05 P 0.05 P> Na Figura 5, verifica-se que no 8º dia de cultura há significativamente mais blastocitos de grau 3 e menos de grau 4 no grupo I do que no grupo II, reflectindo uma melhoria de 20

21 qualidade no estadio de blastocito quando os embriões são cultivados na ausência de neomicina (mais 20% de blastocitos de grau 3 e menos 18% de grau 4). Figura 5. Efeito da neomicina sobre a qualidade dos embriões em estadio de blastocito ao 8º dia de cultura (quanto menor o grau, melhor a qualidade) Sem neomicina Com neomicina P=0.018 P=0.026 Blastocitos (%) P> Grau de qualidade Grau Grupos (11 réplicas) Total I (sem neomicina) n % n II (com neomicina) % Significância (I vs II) P>0.05 P>0.05 P P Conclusões Os resultados apresentados mostram que a inclusão de neomicina na associação antibiótica utilizada nos meios de cultura de embriões, afecta negativamente o crescimento e a qualidade dos embriões obtidos. Este efeito pode ser estar relacionado com o conhecido mecanismo de acção da neomicina em inibir a síntese proteica. As diferenças observadas são elevadas e a alteração do protocolo inicial (que contemplava neomicina) poderá contribuir para uma aumento significativo da qualidade dos embriões até agora observada. 21

22 Estudo 3: Influência da cafeína sobre as taxas de fertilização, de blastocitos em D7-D8 e embriões extrusados até ao 10º dia de cultura. Introdução A técnica desenvolvida inicialmente para a FIV e baseada nos traballhos de Wang (1991) contemplava a adição de cafeína e heparina no meio utilizado durante a inseminação e a FIV dos oocitos (FERT). Neste trabalho procurou-se saber se a adição de cafeína ao meio CAP (durante o swim-up) iria alterar significativamente as taxas de fertilização e desenvolvimento embrionário in vitro. Material e métodos O meio designado por CAP foi utilizado durante a incubação e swim-up dos espermatozóides e foi previamente definido no capítulo das técnicas iniciais. O meio designado por FERT (definido anteriormente no mesmo capítulo) foi utilizado durante o processo de inseminação e FIV. Estes meios foram alterados com o objectivo de se comparar o efeito da cafeína durante o swim-up (adição ao meio CAP) e durante a FIV (adição ao meio FERT). Grupos: Grupo com cafeína no meio FERT: Meio CAP sem cafeína + Meio FERT com cafeína (485,5 µg/ml). Grupo sem cafeína no meio FERT: Meio CAP com cafeína (485,5 µg/ml) + Meio FERT sem cafeína Estudos: Taxa de fertilização (oocitos clivados às 48 horas / oocitos inseminados) Taxa de blastocitos aos 7 e 8 dias de cultura (blastocitos / clivados) Taxa de embriões extrusados até D10 (embriões extrusados / blastocitos D7-D8) Os resultados foram obtidos dum conjunto de cinco sessões de FIV e co-cultura de embriões a partir de uma população inicial de 491 oocitos maturados. Resultados Taxa de fertilização às 48 horas (total de 5 repetições). Oocitos maturados (n) Oocitos clivados Não clivados Taxa de fertilização sem cafeína no FERT % com cafeína no FERT % Significância (χ 2 ) χ 2 =0.111; P>0.05 Taxa de produção de embriões (total de 5 repetições). Clivados (n) Blastocitos em D7-D8 Não desenvolvidos % de blastocitos sem cafeína no FERT % com cafeína no FERT % Significância (χ 2 ) χ 2 =3.02; P=

23 Embriões extrusados (total de 5 repetições). Blastocitos (n) Extrusados até D10 Não extrusados % de extrusados sem cafeína no FERT % com cafeína no FERT % Total Significância (χ 2 ) χ 2 =3.51; P=0.062 Os resultados evidenciam que relativamente à taxa de fertilização é indiferente adicionar a cafeína ao meio CAP ou ao meio FERT (P>0.05). Relativamente ao desenvolvimento embrionário até ao 8º dia de cultura, a ausência de cafeína no meio FERT mostra uma tendência para aumentar a percentagem de blastocitos (P=0.08). Em relação aos embriões extrusados até ao 10º dia, observa-se uma tendência para um aumento da percentagem daqueles embriões no grupo recebendo cafeína no meio FERT (P=0.06). Conclusões: Este trabalho conclui pela inexistência de diferenças significativas entre a adição de cafeína durante o processo de swim-up (meio CAP) ou durante a FIV (meio FERT), relativamente à taxa de fertilização. Em relação à taxa de desenvolvimento embrionário houve uma tendência para o grupo que não recebeu cafeína no meio FERT apresentar uma taxa superior de embriões ao 7º-8º dia de cultura. De acordo com Imoedemhe et al. (1992) a cafeína possui efeitos adversos sobre a capacidade de fertilização in vitro e sobre o desenvolvimento embrionário quando utilizada em doses superiores às necessárias para induzirem a reacção acrossómica. É difícil de compreender uma relação de causa-efeito entre a presença de cafeína no meio FERT e uma maior percentagem de embriões extrusados ao 10º dia de cultura, embora tenha havido essa tendência nos resultados. Ao utilizarmos cafeína no meio FERT estamos a expôr os oocitos e espermatozóides à sua presença por um período muito prolongado (22 horas até ao seguinte refrescamento dos meios) podendo afectar o desenvolvimento embrionário, como parece ser confirmado pelos resultados, embora tendencialmente. Como nenhum dos precedimentos apresentou efeitos adversos significativos sobre os parâmetros estudados, passou-se a adoptar a adição de cafeína ao meio CAP durante o processo de swim-up. Bibliografia Wang, W. (1991). Factors affecting metabolic requirements and in vitro culture of bovine embryos. Ph. D. Thesis, University College Dublin. Imoedemhe, D.A.G., Sigue, A.B., Pacpaco, E.A. and Olazo (1992). The effect of caffeine on the ability of spermatozoa to fertilize mature human oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 9:

24 Estudo 4 Estudos in vivo: Nascimento dos primeiros vitelos produzidos por técnicas de fertilização totalmente in vitro desenvolvidas em Portugal. Introdução Os primeiros nascimentos em Portugal de vitelos originados através da transferência de embriões produzidos totalmente in vitro ocorreram entre Março de 1991 e Fevereiro de Os embriões então utilizados foram importados da Irlanda no âmbito de um projecto europeu de colaboração entre a EZN e o laboratório da ovamass Ltd (Horta et al., 1993). Com este projecto apoiado pela JNICT foi possível, a partir de 1993 iniciar a produção de embriões bovinos utilizando técnicas totalmente in vitro (maturação de oocitos, fertilização e cultura de embriões). A partir de então, foi possível testar a viabilidade dos embriões produzidos na EZN após a sua transferência para vacas receptoras. Material e métodos Os embriões foram produzidos segundo as técnicas já descritas neste relatório. As vacas receptoras pertenceram a 3 raças: Charolesa (n=75), Alentejana (n=61), Frísia (n=30). A transferência foi realizada aos sete dias após a detecção do cio, que no caso das fêmeas Alentejanas foi induzido após tratamento progestagénico associado com prostaglandina F2 alfa. Em 11 vacas receptoras da raça Frísea foi realizada uma inseminação artificial no cio que precedeu a transferência dos embriões. Os embriões foram depositados por via transcervical no corno ipsilateral ao corpo lúteo. Parte dos embriões foram criopreservados em azoto líquido e a transferência realizada após descongelação. Na raça Charolesa houve um grupo de animais que recebeu embriões FIV importados da Irlanda após terem sido submetidos a inseminação artificial (IA). Os embriões da EZN utilizados neste grupo foram dos primeiros a serem produzidos após a implementação da técnica. Os embriões foram congelados de acordo com o seguinte protocolo: 1. Selecção e classificação dos embriões a transferir ou congelar (em fase de mórula compacta ou blastocito); 2. Os embriões seleccionados são transferidos para um meio constituído por PBS enriquecido com 15% de FCS e transferidos de novo para um 2º meio de PBS + 15% de FCS + 5% de glicerol. Aqui permanecem 10 minutos sendo de seguida transferidos para um 3º meio idêntico ao anterior mas enriquecido com 10% de glicerol; 3. Após 10 minutos realiza-se a aspiração de um ou mais embriões para palhinhas de Cassou ficando os mesmos acondicionados numa gota central separada por duas bolhas de ar do meio em contacto com as extremidades da palhinha; 4. Imersão das palhinhas a congelar no líquido (metanol) contido na cuba do aparelho de congelação (Bio-Cool III); 5. Congelação programada em três rampas: dos 10ºC a -7ºC à razão de 2ºC/min (aqui é realizado o seeding); dos -7ºC aos -30º à razão de 0.3ºC/min; dos -30ºC aos -35ºC à razão de 0.1ºC/min. Após 15 min. de estabilização a -35ºC, as palhinhas são introduzidas directamente em azoto líquido (-196ºC) onde permanecem até à descongelação. 24

25 A descongelação dos embriões foi efectuada do seguinte modo: - Depois de retiradas do contentor de azoto líquido, as palhinhas a descongelar são mantidas na atmosfera do laboratório durante 10 segundos. Em seguida, são mergulhadas em água a 37ºC durante 30 segundos. Os embriões são transferidos então para um meio de PBS com 15% de FCS, enriquecido com 0,25 M de sucrose e 5% de glicerol, onde permanecem durante 5 minutos. Em seguida transferem-se para uma 2ª placa de Petri contendo PBS + 15% de FCS + 0,25 M de sucrose onde permanecem durante 5 minutos. Finda esta etapa, que permitiu a descongelação e reidratação celular (efeito da sucrose), os embriões são lavados em dois meios de PBS + 15% de FCS durante 10 minutos em cada banho, estando prontos para serem classificados e seleccionados. - Os embriões seleccionados são aspirados para palhinhas de Cassou em meio de PBS + 15% de FCS devidamente identificadas e colocadas na vertical em termos a 22ºC. Estão assim prontos para serem transportados para o campo e transferidos para as vacas escolhidas como receptoras. Resultados Tabela 1 - Transferência para vacas Charolesas Grupo Transferidas DG21 DG60 Parto Gemelares IA (81,5%) 21 (77,8%) 21 (77,8%) 2 (9,5%) IA+TE * (64,0%) 13 (52,0%) 13 (52,0%) 8 (61,5%) 2 TE ** 23 5 (21,8%) 0 0 Total * Embriões produzidos na Irlanda, descongelados pelo método "one-step-thawing" ** Embriões EZN (6 frescos e 17 descongelados) Tabela 2. Resultados das transferências efectuadas para vacas de raça Alentejana. Embriões Embriões Total Frescos descongelados Vacas transferidas (n) Partos 5 (13.5%) 1 (4.2%) 6 (9.8%) Tabela 3. Resultados das transferências efectuadas para vacas de raça Frísia. Embriões Embriões Total Frescos descongelados Vacas transferidas (n) Partos 3 (20%) 3 (20%) 6 (20%) * de 11 vacas Frísias recebendo simultâneamente uma inseminação artificial no dia do cio houve 2 que pariram gémeos (transferidas com embriões frescos). Os resultados apresentados evidenciam que os embriões produzidos pela metodologia desenvolvida na EZN apresentam taxas de sobrevivência após transferência mais reduzidas do que os embriões produzidos pela mesma metodologia noutro laboratório. As melhores 25

26 taxas de gestação e parto foram obtidas no núcleo de vacas frísias da EZN (20%). A fraca taxa de gestação e parto em vacas de raça Alentejana (9.8%) é parcialmente explicada pela positividade ao vírus IBR que, como se sabe, é uma infecção que aumenta a mortalidade embrionária durante a gestação (nenhuma das vacas diagnosticadas IBR+ ficou gestante). Todos estes resultados são anteriores às modificações já introduzidas no método, pelo que é de esperar que melhores taxas de gestação venham actualmente a ser conseguidas, especialmente com os embriões produzidos sem neomicina na constituição dos meios de cultura. Bibliografia Horta, A.E.M., Marques, C.C., Vasques, M.I., Leitão, R.M., Vaz Portugal, A. (1993). Indução de gestações gemelares em vacas de carne por transferência de embriões produzidos in vitro. Proceedings do 5º SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE REPRODUÇÃO ANIMAL, Luso, Portugal, II Vol., pp

27 C - OUTRAS ACÇÕES DESENVOLVIDAS NO ÂMBITO DO PROJECTO: 1. Cooperação com outras Instituições - Paralelamente à implementação das técnicas de produção in vitro de embriões bovinos no Departamento de Reprodução Animal da EZN, foi dado todo o apoio à Faculdade de Medicina Veterinária tendo permitido desenvolver a mesma tecnologia naquela Instituição universitária. Além da participação dos elementos daquela Instituição directamente envolvidos no projecto, o núcleo da EZN facultou um estágio ao Dr. Mário Quaresma, integrado neste momento na equipa de investigação da FMV na área da reprodução. No sentido de aproveitar a metodologia já desenvolvida e avançar em práticas de injecção espermática intracitoplasmática, foi facultado um estágio à Dra. Teresa Almeida Santos da Faculdade de Medicina de Coimbra, durante o ano de O responsável pelo projecto estabeleceu contactos com o Dr. Patrice Humblot e a Dra. Marquant LeGuienne da UNCEIA, tendo conseguido que dois elementos que integraram a equipa de investigação deste projecto, a Dra. Carla Marques (EZN) e o Dr. Luís Costa (FMV), visitassem o laboratório de FIV daquele laboratório francês no sentido de recolher informações sobre as metodologias utilizadas. Além do laboratório da UNCEIA, foi permitido que os nossos investigadores visitassem o laboratório de FIV e clonagem do INRA em Paris. Os ensinamentos colhidos durante este estágio de uma semana permitirão corrigir alguns aspectos particulares da técnica actualmente executada em Portugal (alternativas às células de suporte actualmente utilizadas na cocultura dos embriões). - Como foi referido em relatórios anteriores contámos com a colaboração do Dr. Wuling Wang da Universidade de Agricultura de Guangxi que, embora através de outros projectos, acessorou parcialmente este projecto em duas ocasiões (em 1993 em 1995). Este investigador chinês teve um papel importante na implementação da técnica na EZN ao utilizar os conhecimentos adquiridos durante a sua tese de doutoramento orientada pelo Prof Ke Huan Lu, pioneiro no desenvolvimento desta técnica nos bovinos. 2. Participação em Congressos - Os primeiros resultados deste projecto foram apresentados no V Congresso de Zootecnia, realizado em Hangra do Heroísmo - Açores de 31/5/95 a 5/6/95. A este Congresso deslocaram-se o Investigador responsável e a Engª Maria da Conceição Baptista. 27