Laboratório Nacional de Células Tronco Embrionárias (LaNCE) Programa de Centros de Tecnologia Celular MCT/FINEP/MS/SCTIE/DECIT/BNDES

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1 Laboratório Nacional de Células Tronco Embrionárias (LaNCE) Programa de Centros de Tecnologia Celular MCT/FINEP/MS/SCTIE/DECIT/BNDES Pequenomanualparaageraçãodecélulas troncopluripotentesinduzidas(ips) BrunaPaulsen 1,LeonardoChicaybam 2,MartinBonamino 2,3,StevensRehen 1 1 InstitutodeCiênciasBiomédicasdaUFRJ, 2 InstitutoNacionaldoCâncer, 3 Institutodo MilêniodeTerapiaGênica Resultados obtidos com auxílio do Programa de Apoio a Grupos Emergentes de Pesquisa da FAPERJ Para gerar células tronco pluripotentes induzidas (ips), utiliza se geralmente vetoresretrovirais.aproduçãodessesvetoreséfeitaatravésdatransfecçãodecélulas empacotadoras (293T), pela técnica de precipitação com fosfato de cálcio, com plasmídeoscontendoasequênciadoenvelope(vsv),proteínasestruturais(gag POL) egenedeinteresse(pmxs). Antes de começar é necessário que tenha tanto a célula a ser transduzida quanto a célula empacotadora em cultura. São necessários aproximadamente 2 milhõesdecélulasempacotadorasporfrascot75,antesdatransfecção,para2diasde produçãodevírus. Dia( )5:Plaquearascélulasempacotadoras(293T)emdensidadede~2x10 6 células porfrascot75.utilizarmeiodmemcom10%sorofetalbovino(sfb). Dia( )4:Atransfecçãodeveráserfeitaaofinaldodia,comodetalhadoabaixo: 1. Trocar o meio de cultura das células empacotadoras 2 horas antes da transfecção(ophécrucialparaosucessodesteprotocolo). 2. Prepare,emambienteestéril,oprecipitadocontendocálcio fosfato(1mlpor frasco T75). Diferentes soluções devem ser feitas para cada uma das construções(pmx Oct3/4,Sox2,Klf4ec Myc)aseremutilizadas.

2 GAG POL 10µg VSV 6µg pmx 20ug CaCl 2 50µL (HBS) 500µL H 2 O paraavolumaraté1ml *HEPESBufferedSaline(2xHBSfor500mL) NaCl 8g KCl 0.38g Na2HPO4 0.1g Hepes 5g Glucose 1g ph7.05 *2,5MCaCl2 *águabi destilada Atenção: a)tantoohbs,quantoah 2 Odevemestaràtemperaturaambiente; b)ohbsdevesero últimoreagenteaseracrescentado.éimportante que a solução seja homogeneizada enquanto o tampão é lentamente adicionado. 3. Deixarasoluçãocomoprecipitadodescansandopor~30minutos. 4. Pingar 1mL da solução em cada frasco T75 e incubar overnight em estufa a 37 C,5%deCO 2. Dia( )3:Trocaromeiodascélulastransfectadasdepreferênciapelamanhã. Dia( ) 2: Recolher a primeira leva de vírus e transduzir as células alvo pela primeira vez: 1. Recolher o meio dos frascos T75 com as células empacotadoras e repor com meiofresco. 2. Centrifugaromeioa2000rpmpor6minutos. 3. Filtrar o meio (filtro 0,22µm) e distribuir em tubos especiais para ultracentrífuga. 4. Concentrarosvírusemultracentrífuga(BeckmanrotorSW4OTi)a19.800rpm por1horae20minutos.

3 5. Tirar todo o sobrenadante com bastante cuidado e suspender em baixos volumes. Obs. O vírus pode ser utilizado diretamente para a transdução ou congelado em alíquotasno 80 C. TRANSDUÇÃO 6. Adicione8µg/mLdepolibreneporpoço.Oidealéqueopoçocomascélulasalvoestejacomconfluênciade60a80%. 7. Façaumamisturadepartesiguaiscontendoos4vírusconcentradosecoloque nospoçoscomascélulas alvo. Atenção: A qualidade e o título dos vírus são de extrema importância para o sucessodareprogramaçãodascélulas.oidealéqueseverifiqueotítulo dovírusantesdefazeratransduçãoou,pelomenos,quesetenhauma idéiadatitulaçãogeralmenteobtida.seissoforpossível,utilizarmoide 5 para cada uma das construções. Se não for possível, sugerimos que sejam testadas pelo menos 2 concentrações diferentes de vírus nas células alvo. 8. Centrifugarasplacaspor45minutosa1800rpm. 9. Incubaremestufaa37 C,5%deCO 2. Dia( )1:Recolherasegundalevadevírusetransduzirascélulas alvomaisumavez. Repetirtodooprocedimentododia( )2.Éaconselháveltrocaromeiodascélulas alvo antesdefazernovatransdução. Dia0:Lavarascélulastransduzidas3vezescommeiodecultura,mantendo ascomo meiosemelhanteaoutilizadoanteriormenteàtransdução.incubaremestufaa37 C, 5%deCO 2 por48horas. Dia 1: Descongelar fibroblasto embrionário murino (MEF 2,7x10 4 células/100mm 2 ), sobreplacapreviamentegelatinizada,queseráutilizadacomocélulasuporteparaas célulasreprogramadas.

4 Gelatinização: a) Adicione volume suficiente de gelatina 0,2% para cobrir o fundodopoço. b) Aspire o excesso e espere secar um pouco. Faça isso imediatamenteantesdeplaquearascélulas. Dia2:InativaroMEF,descongeladonodia1,commitomicinaC(10µg/mL)por3horas. Emseguida,lavar3vezescommeioMEFedeixarnaestufaa37 C,5%deCO 2. MeioMEF DMEM/F12 SFB 10% Glutamina L 2mM Gentamicina 50µg/mL β mercaptoetanol 50µM A partir desse dia, cultivar as células em meio ES e 1mM de Ácido Valpróico (VPA).Éimportantequesetroqueomeiotodososdias. MeiomES(murinas) MeiohES(humanas) DMEM/F12 KnockoutSerumReplacement 15% 20% Aminoácidosnão essenciais 100µM 100µM Glutamina L 2mM 4mM Gentamicina 50µg/mL 50µg/mL β mercaptoetanol 50µM 100µM LIF 1000U/mL 0 FGFb 0 8ng/mL Dia3:Passarascélulashumanas(1:2)eascélulasmurinas(1:3)paraorecipientecom MEFinativadonodia2: a) Retirartodoomeiodopoço; b) IncubarcomTrypLE TM a37 Cpor,aproximadamente,5minutosem umvolumesuficienteparacobriramonocamadadecélulas; c) Verificarqueascélulasestãosoltasdopoço; d) DiluiraTrypLE TM comquantidadeigualdemeio; e) Centrifugara1500rpmpor5minutos; f) RetirartodoosobrenadanteeressuspenderascélulascommeioES;

5 g) Passar(1:3)paraospoçosdesejados. ManterascélulasemmeioESe1mMdeVPA. Atenção: Alternativamente, células murinas podem ser passadas para poços previamente gelatinizados (utilizar Gelatina 0,2%) ao invés dos MEFs. Observamos com a transdução de fibroblastos murinos que o aparecimento de colônias plaqueadas em gelatina ocorre antes do aparecimentodasmesmassobreosmefs. Dia 5: Indícios do processo de reprogramação podem ser observados com o aparecimentodepequenosagregados,semelhantesacolônias. Dia9:FimdotratamentocomVPA1mM. Apartirdodia9,cadaprocedimentoaserseguidodependeráempartedoobservador, poiscadatipocelularcresceráeseestabelecerádeumamaneiradiferente.portanto, descrevemosabaixoalgunsdosprocedimentosequandoelesdevemseriniciados: I) Passagem das células: Quando as células atingirem a confluência antes das colônias de ips aparecerem 1. Passarascélulas(1:3),comodescritonodia3. II) Seleção das colônias: QuandoascolôniasdeiPSaparecerem 1. Antesdeselecionarascolônias,tenhaMEFsplaqueadoseinativadosemplaca de 24 poços. O ideal é que, posteriormente, se passe uma colônia para cada poço de forma a facilitar a separação dos clones de ips das falsas ips (costumamaparecerantes). 2. Selecionarclones. Seleçãodecolônias: a) Quando há a disponibilidade de uma lupa dentro do fluxo sem o risco de contaminar a cultura, identificar as colônias comajudadesta.quandonãohouverdisponibilidade,como

6 auxílio de um microscópio, marcar a placa sob cada colônia comumacanetadepontafina. b) Dentrodofluxo,utilizarumapipetaautomática(entre10µLe 200µL) para aspirar as colônias. Apoiar a ponteira sobre a marcaçãofeitaepuxartodoovolume. c) O volume aspirado pode ser passado diretamente para um novopoço,semhavernessecasodissociaçãodacolônia.isso não evitará que ela diferencie se já estiver muito grande e compacta. Portanto, quando o objetivo for a expansão das colônias,transferirovolumeaspiradoparaumpoçodeuma placade96poços,ressuspenderessevolumealgumasvezes para dissociar a colônia e, então, passar para o poço desejado. Atenção: a) Depois de selecionar as colônias, transferi las para placas com MEF inativadoenãomaiscultivarsobrepoçosgelatinizados. b) A partir dessa etapa, as células murinas podem ser passadas com TrypLE TM,aoinvésdepassagemmanual,comodescritoacima.Omesmo nãoéindicadoparaascélulashumanas. Depoisdederivadas,ascélulasiPSdevemsertratadascomoESgenuínasemrelação aomododepassagem,congelamentoecaracterização(morfologia,imunocitoquímica, capacidadedediferenciação,formaçãodeteratomasetc). IMPORTANTE: Observamos que cada tipo celular requer cuidados específicos após a transdução,oquedificultaadefiniçãodeumprotocoloúnicoquecontempletodosos tipos celulares de interesse para a geração de células ips. Indicamos, portanto, que pequenas alterações devam ser realizadas de acordo com a experiência do pesquisador.