PROCOLO PARA DETERMINAÇÃO DE AMÔNIO NA ÁGUA DO MAR
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- Micaela Silva Sabrosa
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1 Objetivo PROCOLO PARA DETERMINAÇÃO DE AMÔNIO NA ÁGUA DO MAR Avaliar a concentração de N-NH 4+, na forma de íon, por técnica colorimétrica, utilizando-se espectrofotômetro. A análise é feita através de adaptações de metodologia de Grasshoff et al. (1983) e Lana et al. (2006). Para o N-NH 4 + em águas costeiras não poluídas e no oceano, as concentrações, geralmente, são inferiores a 1 μm (Aminot & Chaussepied, 1983). Day et al. (1987) citam 5 μm como um valor normal em estuários não poluídos. As concentrações de amônio no entorno da Reserva do Arvoredo variam de 0,5 a 6 µm. Princípio do método O nitrogênio amoniacal da amostra reage com o hipoclorito de sódio, em meio alcalino (ph entre 10,8 a 11,5) para formar a monocloramina.a monocloramina reage com o fenol, na presença de um excesso de hipoclorito e também do nitroprussiato de sódio (catalisador), formando o azul de indofenol, cuja absorção máxima é a 630 nm. A fim de evitar a precipitação, nesse meio alcalino, dos íons alcalinos terrosos (Ca, Si, Ba, Mg) da água, adicionar citrato trissódico (complexante), evitando a interferência quanto a turbidez, que poderia ser causada pela precipitação destes íons (Solorzano, 1969). Interferente e precisão do método Sulfetos: quando em concentrações maiores que 2mg/L, interferem devido ao aparecimento de uma cor verde. Neste caso, pode-se diluir a amostra antes de dosá-la. Salinidade: interfere porque o efeito tampão da água do mar modifica, ou seja, diminui o ph da reação de formação do composto colorido. Este efeito deve ser corrigido pelo uso do Fator de Correção do Efeito Salino. ATENÇÃO! -OS REAGENTES UTILIZADOS PARA ESTA ANÁLISE, FENOL E DTT, SÃO EXTREMAMENTE NOCIVOS, PODENDO CAUSAR CÂNCER! -As análises devem ser feitas utilizando máscara de proteção com filtro ativado, luvas e jaleco, com as janelas do laboratório abertas. Toda análise deve ser feita dentro de capela com exaustor sempre ligado! - A análise deve ser feita utilizando-se água destilada de qualidade para lavagem das vidrarias a serem utilizadas, e água Milli-q para a preparação dos reagentes, curva e branco. A água deve ser destilada no momento do uso, e armazenada em galão lavado com ácido clorídrico 10%; - Devido a fácil contaminação, tudo deve ser feito dentro da capela, sendo que esta deve ser limpa com água destilada e álcool antes do início dos procedimentos analíticos; - Toda vidraria deve ser colocada em ácido clorídrico 10%, também preparado com água destilada de qualidade e deve ser feito novo e usado exclusivamente para vidraria de amônio. A mesma só deve ser retirada no momento da análise e enxaguada no momento do uso com água destilada sem fonte de contaminação; - Devido à toxicidade dos reagentes utilizados para esta análise, como fenol e DTT, a pipeta automática a ser utilizada para aferir os volumes destes reagentes, deve estar identificada e somente utilizada para esta análise.
2 Materiais necessários 1.1. Equipamentos a serem utilizados Agitador magnético com aquecedor Espectrofotômetro HITACHI 2900 Balança Estufa Capela exaustora Dessecador com sílica gel 1.2. Vidraria e materiais diversos a serem utilizados Espátula de inox Seringas (3) uma para fenol e outra para DTT, que devem ser usados apenas para estes reagentes, que, por serem muito tóxicos, podem contaminar as pipetas, além de uma seringa pequena para água destilada, a fim de aferir os meniscos Béquers pequenos (10 ml) Béquer 50 ml Béquer 100ml Béquer 200 ml Proveta 100 ml Balão de 100 ml Balão de 1 L 4 frascos de vidro escuro (âmbar) Proveta 5 ml Balão de 500 ml Tubos de ensaio para microvolumes (triplicata) para amostras e curva Proveta 50 ml Bastão de vidro 1.3. Reagentes Preparo dos reagentes necessários: a. Solução Padrão Estoque de Amônio (SE): μm N-NH4 + Por ser a etapa mais demorada, deve-se começar pela solução padrão. - Secar em estufa a 100 ºC durante uma hora uma pequena quantidade de cloreto de amônio, que deve ser colocado em um béquer pequeno bem seco, com auxílio de espátula de inox. - Esfriar em dessecador. - Com auxílio de mais um béquer pequeno (10 ml) e a espátula de inox, pesar na balança exatamente 0,0535 g. - Diluir com aproximadamente 50 ml de água milli-q com ajuda do bastão de vidro, cuidando para lavar o bastão dentro da solução, para evitar perda de reagente, assim como o béquer usado para pesar o sal; - Transferir a solução para um balão de 100 ml e aferir o menisco com água milli-q; - Transferir para um vidro âmbar, mantendo na geladeira ao abrigo da luz; Esta solução é estável por dois a três meses no refrigerador.
3 a. Solução tampão de citrato trissódico (R2) Por ser o reagente mais demorado de preparar, deve-se começar pelo R2. - Pesar em béqueres de 10 ml 48 g de citrato trissódico (Na 3C 6H 5O 7.2H 2O) e 0,08 g de NaOH em balança analítica. - Diluir cada reagente em 50 ml de água milli-q, com auxílio de bastão de vidro. - Juntar as duas soluções em béquer de 200 ml, lavando-os para não restar reagente na parede dos béqueres (totaliza 120 ml de solução). - Aquecer com auxílio do agitador magnético com aquecedor, deixando ferver até redução de volume para 100 ml. - Armazenar em frasco âmbar. Este reagente deve ser preparado no dia da análise ou no dia anterior. b. Solução de fenol- nitruprussiato (R1) - Pesar 3,8 g de fenol (C 6H 5OH) em béquer de 50 ml na balança analítica. - Diluir em 10 ml de álcool etílico 95%, com auxílio de bastão de vidro. - Em um béquer de 100 ml, dissolver 0,04 g de nitruprussiato de sódio (Na 2 Fe(CN) 5 NO. 2H 2O) em 60 ml de água deionizada, também com bastão de vidro. - Após bem dissolvidas cada solução, misturar as duas e elevar o volume a 100 ml com auxílio de balão volumétrico com água milli-q. - Guardar em frasco âmbar. Reagente suficiente para análise de 80 amostras (com a curva). Este reagente deve ser preparado no dia da análise ou no dia anterior. c. Solução alcalina oxidante (R3) (Deve ser refeito a cada dia de análise!) - Pesar 0,2 g de ácido dicloroisocianuro (DTT), chamado de Trione (C 3Cl 2N 3NaO 3.2H 2O) e 1,6g de NaOH, ambos em béqueres de 10 ml, na balança analítica. - Dissolver cada um com 40 ml de água milli-q - Juntar ambas soluções e completar para 100 ml em balão volumétrico. - Reservar em frasco âmbar. Reagente suficiente para análise de 80 amostras (com a curva). Este reagente deve ser preparado no dia da análise ou no dia anterior. Teste: Fazer o teste de reagentes para certificar que está funcionando. Este teste é grosseiro, somente a calibração irá indicar se está no padrão de qualidade exigido. Misturando-se os reagentes e a solução padrão de amônio, deve ser produzida solução de cor azul expressiva.
4 Figura 22. Coloração azul dos reagentes. 2. Padrões para calibração 2.1. Solução Trabalho de Amônio (ST): 100μM NH Diluir a Solução Estoque, retirando 1ml dessa solução, com auxílio de pipeta automática de precisão. - Aferir a 100 ml com água milli-q, em balão volumétrico. - Homogeneizar o balão 10X. A Solução Trabalho deverá ser renovada a cada bateria de análise. Só conserva-se por algumas horas Soluções diluídas - Acondicionar a Solução Trabalho para um béquer de 10 ml já ambientado; - Trocar a ponteira da pipeta e ambientar 3X com a Solução Trabalho; - Preparar 3 balões volumétricos de 100 ml, cada um deve estar identificado com a concentração final das soluções que serão preparadas: 1 um, 2uM e 4 um; - Ambientar 3 X com água destilada e completar até a metade com água destilada; - Fazer as seguintes diluições no momento do uso, usando os balões de 100 ml: Tabela 1. Soluções diluídas para curva de análise de amônio. Solução diluída Concentração (µm) Volume Solução Volume final (ml) Intermediária (ml) Além destas soluções, deve ser preparado o branco, utilizando-se apenas água milli-q. OBS: Estas soluções permitirá calibrar toda a análise e testar a qualidade dos reagentes.
5 3. Procedimento analítico - Quando a análise apresentar uma boa calibração e valores de referência roda-se as amostras. - Separar os tubos de ensaio em ordem crescente de numeração; - Organizar as amostras em ordem crescente de numeração, manter sempre a ordem para facilitar no planilhamento dos dados; - Transferir 3 ml das soluções e amostras (previamente homogeneizadas) para os tubos de ensaio identificados, com auxílio de pipeta volumétrica, a ponteira deve ser ambientada previamente, - Lembrar de rodar uma amostra da solução de concentração conhecida Merk, que servirá também para se ter certeza de que o método está bem calibrado. - Anotar em caderno o número do tubo de ensaio em que a amostra foi acondicionada. - Lembrar-se de sempre passar água destilada na ponteira por 3 x entre uma amostra e outra, além da ambientação com a amostra! - Após preparar todas as amostras nos tubos de ensaio, em triplicata, preparar para a reação de análise: a. Ambientar a pipeta com reagentes, lembrando-se de usar ponteiras diferentes para cada reagente; b. Adicionar 200 µl de R1, tampar e agitar para misturar soluções; c. Adicionar 100 µl R2, tampar e agitar invertendo (3X) para misturar soluções; d. Adicionar 200 µl do R3, homogeneizar. - Anotar a hora que colocar o primeiro reagente. - Deixar reagir por no mínimo 6 horas à temperatura ambiente e no máximo por 30 horas. * Aconselha-se fazer a leitura no dia seguinte. Pode-se preparar reagentes e fazer a curva em um dia, lê-se a curva no dia seguinte, e se estiver boa prepara-se a reação das amostras, e lê-se as amostras no dia posterior. - Fazer a leitura da absorbância a 630 nm de comprimento de onda no espectrofotômetro. - Salvar os dados. Referências Bibliográficas (Metodologia) Methods of seawater analysis / ed. by Klaus Grasshoff... With contributions by Leif Anderson; Constant van den Berg. - 3., completely rev. and extended ed. - Weinheim; New York; Chiester; Brisbane; Singapore; Toronto: Wiley-VCH, Avaliação ambiental de estuários brasileiros: diretrizes metodológicas/organizadores. Paulo da Cunha Lana... [et al.]. Rio de Janeiro : Museu Nacional, p., 28 cm (Série Livros, 22). Projeto RECOS Uso e Apropriação de Recursos Costeiros, Grupo Temático Biodiversidade e Qualidade Ambiental.
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