PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES OVINOS (In vitro production of sheep embryos)

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1 Ciência Animal, 13(2):79-87, PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES OVINOS (In vitro production of sheep embryos) Juliana Bezerra LIMA VERDE, Davide RONDINA, Vicente José de Figueirêdo FREITAS Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução Faculdade de Veterinária Universidade Estadual do Ceará Av. Paranjana, Fortaleza,CE RESUMO Nos últimos anos, tem ocorrido um crescente interesse nas tecnologias de produção in vitro (PIV) de embriões para uma mais rápida disseminação de germoplasma superior em ovinos, devido a problemas encontrados nos programas de superovulação e transferência de embriões nesta espécie. Embora a eficiência da PIV tenha aumentado, o número de embriões e o desenvolvimento a termo ainda continuam baixos. Este trabalho revisa o progresso obtido na otimização da maturação in vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV) e sistemas de cultivo in vitro (CIV) em ovinos. A aquisição de um maior número de informações sobre a maturação de oócitos e os requerimentos para cultivo nesta espécie torna-se crítico para otimizar a eficiência de técnicas modernas de reprodução. PALAVRAS-CHAVE: Ovino; embrião; produção in vitro. ABSTRACT In the last several years, there has been an increasing interest in in vitro embryo production (IVP) technologies for faster propagation of superior germplasm in sheep because of some problems with superovulation and embryo transfer programs in this species. Although the IVP efficiency has improved, embryo yield and development to term are still low. This paper reviews the progress made in optimizing the in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) systems in sheep. The acquisition of more information on oocyte maturation and culture requirements in this species is critical to optimize the efficiency of advanced reproductive strategies. KEY WORDS: Sheep; embryo; in vitro production. INTRODUÇÃO A indústria de produtos de origem ovina é afetada primariamente pela qualidade e disponibilidade de alimento, pelo manejo dispensado aos animais e pela sua genética. Aliado a estes fatores, destaca-se também a eficiência reprodutiva, que é um ponto crítico em sistemas de produção de carne, pele ou lã. Contudo, no Brasil, esse aspecto é insatisfatório devido às condições desfavoráveis às quais muitos animais são submetidos. Em contrapartida, há uma forte demanda dos produtos de origem ovina pelos mercados interno e externo. Para reduzir a distância entre a demanda e a produção é necessário aumentar os índices reprodutivos e promover o progresso genético na espécie. No entanto, a produção de um grande número de animais de qualidade superior, em um curto espaço de tempo, torna-se de difícil execução através do uso das técnicas reprodutivas convencionais. Técnicas recentes têm possibilitado novas maneiras de acelerar o ganho genético e aumentar o potencial produtivo de ovinos. Dentre essas técnicas, destacam-se a inseminação artificial (IA) e a transferência de embriões (TE). Mais recentemente, a produção in vitro (PIV) de embriões apresentou-se como mais uma alternativa para o aumento do potencial reprodutivo de ovinos (WANG et al., 1998), caprinos (IZQUIERDO et al., 1999) e bovinos (DODE & ADONA, 2001). Deste modo, a maturação (MIV) e fecundação in vitro (FIV) de oócitos recuperados de ovários de abatedouro ou por laparoscopia (animais vivos), seguidos do cultivo in vitro (CIV), são etapas necessárias para produção em larga escala de embriões na espécie ovina. A PIV de embriões ovinos envolve três etapas: maturação de oócitos primários oriundos de grandes folículos antrais, fecundação de oócitos secundários maturos, utilizando sêmen congelado ou fresco, e cultivo dos embriões por mais de uma semana até a formação de blastocistos, que podem ser transferidos para receptoras ou crioperservados para uso futuro (COGNIÉ et al., 2003).

2 Ciência Animal, 13(2):79-87, Esta revisão tem por objetivo abordar o progresso obtido nas pesquisas que vêm sendo realizadas na área de PIV de embriões ovinos, bem como apresentar protocolos já definidos para esta finalidade. Colheita dos oócitos O número de oócitos de boa qualidade colhidos de um ovário é um ponto importante na PIV de embriões. Os oócitos destinados à FIV podem ser colhidos de uma das seguintes fontes: ovidutos logo após a ovulação, folículos maturos antes da ovulação ou de folículos imaturos ou atrésicos presentes em animais mortos (abatedouro) ou vivos (WANI, 2002). Em geral, a maior parte dos oócitos utilizados para a PIV de animais domésticos é oriunda de abatedouros. Após a colheita, os ovários podem ser levados ao laboratório em solução salina a 0,9% contendo 100 UI de penicilina G-potássica e 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (WANG et al., 1998) ou em solução salina fosfatada de Dulbecco a o C (PUGH et al., 1991), a 20 o C ((SLAVIK et al., 1992) ou a temperatura ambiente (WANI et al., 2000), sem nenhum prejuízo à maturação dos oócitos. O intervalo entre a colheita dos ovários e a obtenção dos oócitos, sem efeitos deletérios, varia de uma a duas horas (PUGH et al., 1991), três a quatro horas (WANI et al., 1999) ou até cinco horas (WANG et al., 1998). Estes ovários são seccionados e liberam grandes quantidades de oócitos primários (AGRAWAL et al., 1995). A idade do animal não possui qualquer efeito no número e na qualidade dos oócitos colhidos (WANI et al., 1999) ou na taxa de maturação e fecundação (O'BRIAN et al., 1997). Contudo, as taxas de blastocistos obtidas utilizando-se oócitos oriundos de ovelhas adultas são significativamente superiores quando comparadas às recém-púberes, não havendo porém diferenças nas taxas de gestação (O'BRIAN et al., 1997). A utilização de doadoras jovens tem efeito considerável por acelerar o ganho genético e diminuir o intervalo entre gerações. Apesar da utilização de oócitos de abatedouros apresentar custo mais baixo para um programa de PIV, esta prática não assegura a procedência genética dos embriões produzidos. Oócitos maturados in vivo podem ser obtidos por técnicas cirúrgicas (NAQVI & GULYANI, 1999) ou por laparoscopia (KÜHHOLZER et al., 1997). Estes métodos são de elevado custo e o número de oócitos recuperados por ovário é menor. No entanto, uma vantagem é que o animal submetido à colheita é de origem conhecida e pode ser utilizado por várias vezes sem problemas de aderência. A técnica de ovum pick-up (OPU) combinada com a MIV e FIV é um método de colheita de oócitos por laparoscopia ou ultra-sonografia que não depende de tratamento hormonal, devido à presença de folículos de diferentes tamanhos no ovário em qualquer momento do ciclo. Nos últimos anos diferentes sondas de aspiração folicular e diferentes pressões de vácuo têm sido utilizadas com o intuito de manter a integridade das células do cumulus (KÜHHOLZER et al., 1997; ALBERIO et al., 2002) (Fig. 1). A laparoscopia é pouco invasiva, quando comparada à laparotomia, e mais rápida, reduzindo o estresse do animal. A OPU por laparoscopia foi primeiramente descrita por SNYDER & DUKELOW (1974), que aspiraram 21 folículos e recuperaram seis oócitos. Vinte anos depois, BALDASSARE et al. (1994) realizaram laparoscopias em 46 ovelhas superovuladas com uma recuperação oocitária de 82%. A habilidade para se identificar oócitos capazes de produzir um elevado número de estruturas fecundadas, antes da FIV, é um fator importante para programas de PIV. Os oócitos de maior diâmetro produzem altas taxas de mórulas e blastocistos (ARLOTTO et al., 1992). A maioria dos pesquisadores trabalham selecionando oócitos de acordo com os critérios propostos por LEIBFRIED & FIRST (1979) para a espécie bovina, que classificaram essas estruturas em: a) Excelente (classe I): cumulus e corona radiata completos e citoplasma homogêneo; b) Bom (classe II): mais de duas camadas de células do cumulus; c) Regular (classe III): uma camada de células do cumulus ou cumulus incompleto; d) Ruim (classe IV): sem células do cumulus e/ou oócito degenerado. Em ovinos, resultados obtidos utilizando a técnica de recuperação oocitária por OPU foram descritos por TERVIT (1996). Quando a mesma é realizada 24 horas após o final do tratamento gonadotrófico, uma média de seis oócitos por ovelha são selecionados para FIV, resultando em 1,1 blastocisto (BALDASSARE et al., 1996). KÜHHOLZER et al., 1997 obtiveram uma taxa de colheita de oócitos de 67,9% quando utilizaram a OPU para recuperação

3 Ciência Animal, 13(2):79-87, oocitária. Já ALBERIO et al. (2002), utilizando a mesma técnica, obtiveram uma taxa de colheita de 33,6%. Figura 1: Colheita de oócitos através de ovum pick-up (OPU), guiada por ultra-sonografia, em pequenos ruminantes (Adaptado de GRAFF et al., 1999). Maturação in vitro A aquisição da competência de desenvolvimento do oócito ocorre continuamente ao longo da foliculogênese e a influência do tamanho e da atresia folicular na competência do desenvolvimento foram revistos por MERMILLOD et al. (1999). Contudo, dada a heterogeneidade natural dos oócitos imaturos utilizados para PIV, a maturação oocitária pode ser influenciada, dentre outros fatores, pelos componentes do meio e as várias condições de cultivo (COGNIÉ et al., 2003). Durante o período de maturação, muitas mudanças na organização do citoplasma são observadas, tais como um contínuo aumento do estoque lipídico, redução do complexo de Golgi, rearranjo das motocôndrias e alinhamento dos grânulos corticais ao longo do oolema. O aumento do estoque lipídico está provavelmente relacionado com o pool energético para o oócito suportar o desenvolvimento após a fecundação até o estádio de blastocisto (MERMILLOD et al., 1999). Diferentes fontes de gonadotrofinas exógenas, tais como FSH e LH (COGNIÉ et al., 1991), hmg (WANI et al., 2000), ecg (MUZARMADIEV et al., 1983) ou hcg e estradiol (SHORGAN et al., 1990), são utilizadas no meio de maturação de oócitos ovinos. No entanto, a adição de hormônios ainda é uma controvérsia, pois alguns trabalhos não encontraram diferenças significativas no número de oócitos que chegaram à metáfase II ou oócitos que formaram blastocistos na presença ou ausência de gonadotrofinas exógenas (O'BRIAN et al., 1994). O meio TCM-199 suplementado com FSH e 17β-estradiol (100 ng/ml) induziu um aumento significativo na produção de blastocistos (GULER et al., 2000). O possível envolvimento do 17β-estradiol na maturação oocitária citoplasmática é explicado pelo fato de que seu uso inadequado exacerbou anormalidades na clivagem de embriões, causando falhas na formação de blastocistos (OUSSAID et al., 1999). Também foi relatada a utilização de soro fetal bovino (WANG et al., 1998; BYRNE et al., 2000), soro de ovelha em estro (NAQVI et al., 2001), fluido folicular humano, fluido de grandes e pequenos folículos de ovelhas (ZHU et al., 1999), bem como heparina (PTAK et al., 1999) nos protocolos de MIV. A relação entre o uso de glutationa e a competência no desenvolvimento de oócitos bovinos foi confirmada em oócitos ovinos maturados na presença de cisteamina como precursor da glutationa (DE MATOS et al., 1999). Para MIV em ovinos, o fluido folicular recuperado de grandes folículos ( > 4 mm) pode ser utilizado como suplemento do meio de maturação à base de TCM-199 com 100 ng de ofsh

4 Ciência Animal, 13(2):79-87, e seu efeito positivo é alcançado quando o fluido é oriundo de folículos não atrésicos ou de folículos estimulados por gonadotrofinas (COGNIÉ et al., 1995). A presença de FSH ou do fator de crescimento epidermal (EGF) no meio de maturação estimulou a retomada da meiose e aumentou as taxas de clivagem após FIV (BYRNE et al., 2000). Sabe-se também que o fluido folicular possui efeito adicional na ação do FSH e do EGF no desenvolvimento de oócitos, indicando a presença de moléculas reguladoras (COGNIÉ et al., 2003). A presença de células do cumulus parece ter importância no desenvolvimento e maturação de oócitos ovinos. Durante a maturação do oócito, estas células apresentam um papel regulatório que pode ser observado durante o processo de clivagem (WANI, 2002). GULER et al. (2000) observaram uma taxa de maturação oocitária completa (condensação da cromatina em metáfase II) de 59% quando utilizaram TCM-199 como meio de maturação. Deste percentual, foram obtidas taxas de clivagem de 46 e 69%, sem e com a suplementação de FSH, respectivamente. Os autores chegaram a uma produção de 12% de blastocistos. ALBERIO et al. (2002) obtiveram taxas de maturação oocitária, clivagem e produção de blastocistos de 84,8%, 72,2% e 22,5%, respectivamente, quando utilizaram TCM- 199 como meio de maturação, além da adição do soro de ovelha em estro no meio de fecundação. Capacitação espermática Para que ocorra a fecundação, torna-se necessário que os espermatozóides a serem utilizados para esta finalidade estejam aptos a ultrapassar a zona pelúcida e penetrar no oócito maturo. O espermatozóide de mamíferos sofre uma série de mudanças bioquímicas e biofísicas antes da fecundação. Essas mudanças são denominadas "capacitação espermática". A capacitação envolve a remoção do material que reveste o espermatozóide, adquirido durante o trânsito epididimário ou por ocasião da exposição ao plasma seminal ou ainda, pela remoção do colesterol, resultando no aumento da permeabilidade da membrana ao cálcio. In vitro, a lavagem do espermatozóide antes da incubação acelera a capacitação. A mudança na motilidade espermática (hipermotilidade) ocorre após sua exposição a um meio fortemente iônico. Isso se reflete no aumento da taxa de motilidade e, conseqüentemente, no aumento do consumo de oxigênio, semelhante ao que ocorre in vivo. Os componentes iônicos do meio influenciam a motilidade espermática, a capacitação, a integridade do acrossoma e a habilidade do espermatozóide em penetrar no oócito. O início desta hiperatividade é acompanhada pela saída de H + intracelular causando um aumento de ph intracelular (PARRISH et al., 1989). Dessa forma, a maioria dos protocolos de FIV em ovinos são realizados em um ph entre 7,4 e 8,0 (WANI, 2002). Proteínas são componentes essenciais ao meio utilizado para a capacitação espermática. A adição de 20% de soro de ovelha em estro ou BSA (4 mg/ml) tem sido preconizada para a capacitação espermática em ovinos (WANI et al., 2000). A heparina, que é um potente ativador da capacitação espermática no touro, não age de forma eficaz na capacitação do espermatozóide ovino quando adicionada ao soro (COGNIÉ & BARIL, 2002). No entanto, NAQVI et al. (2001), utilizando heparina em meio de capacitação para sêmen ovino, obtiveram 65,8% de oócitos fecundados. Já a cafeína deprime as taxas de fecundação quando se utiliza sêmen fresco em ovinos e o seu sinergismo com a heparina afeta negativamente as taxas de clivagem nesta espécie (NAQVI & MADAN, 1997). O sêmen usado em protocolos de FIV pode ser fresco ou congelado/descongelado no momento de sua utilização (MORRIS et al., 2003). Em ambos os processos deve-se realizar a separação dos espermatozóides móveis dos mortos e adicionar o meio de fecundação em quantidade suficiente para que alcance uma concentração desejável, geralmente em torno de 1 x 10 6 espermatozóides/ml (GULER et al., 2000; ALBERIO et al., 2002). Espermatozóides com boa motilidade são separados dos mortos e daqueles com baixa motilidade através da técnicas de swim-up (SLAVIK et al., 1992; WATSON et al., 1994; WANI et al., 2000) ou gradiente de Percoll (COGNIÉ et al., 2003) seguido de centrifugação. Espermatozóides epididimários oriundos de carneiros em abatedouros têm sido utilizados com sucesso, algumas horas após sua morte, para FIV de oócitos ovinos (WANI et al., 2000). O sêmen fresco de ovino foi utilizado com sucesso para FIV após capacitação com cálcio ionóforo A23187 em solução BO (protocolo

5 Ciência Animal, 13(2):79-87, desenvolvido para coelhos por BRACKETT & OLIPHANT, 1975) contendo 0,6% de BSA e cafeína (WANG et al., 1998; ZHU et al., 1999). Fecundação in vitro O sucesso da FIV depende tanto do protocolo de maturação oocitária como da capacitação espermática. O tempo de interação oócito-espermatozóide, o meio utilizado, a temperatura e a concentração espermática possuem importante papel no sucesso desta técnica. Independente do tipo de sêmen utilizado para este fim, geralmente adicionam-se os espermatozóides em meio de fecundação contendo de 10 a 30 oócitos maturos. Este processo na espécie ovina pode durar 6 horas (WANG et al., 1998), 6 a 10 horas (ZHU et al., 1999), 17 horas (MORRIS et al., 2003), 18 horas (GULER et al., 2000), 20 horas (ALBERIO et al., 2002) ou 20 a 24 horas (BYRNE et al., 2000). Para uma melhor avaliação deste processo, estudos são necessários para determinar se, reduzindo o tempo de interação oócito-espermatozóide, ocorre a diminuição dos danos produzidos pelos espermatozóides, melhorando as taxas de implantação após transferência, semelhante ao que ocorre em humanos (GIANAROLI et al., 1996). A temperatura de incubação dos oócitos em conjunto com os espermatozóides podem variar segundo os autores: 37 o C (MORRIS et al., 2003), 38,5 o C (GULER et al., 2000) e 39,5 o C (COGNIÉ et al., 2003). No entanto, todos esses autores utilizaram uma atmosfera de 5% de CO 2. SLAVIK et al. (1992) descreveram a utilização de TCM-199 enriquecido com heparina como meio de fecundação para oócitos ovinos. WALKER et al. (1994) concluíram que a utilização de fluido sintético de oviduto (SOF) adicionado de 2% de soro de ovelha em estro é um modelo adequado para um sistema de FIV em ovinos. Outros autores utilizaram o TCM- 199 como meio de fecundação, modificando para 5% a concentração do soro de ovelha em estro (WANG et al., 1998) ou para 1% (NAQVI et al., 1999). COGNIÉ et al. (2003) utilizaram o meio SOF adicionado de 10% de soro de ovelha e 0,5 µg/ml de heparina. A solução BO acrescida de 5 mg/ml de BSA também foi utilizada na FIV de ovinos, promovendo uma taxa de fecundação de 90% (ZHU et al., 1999). Outros meios já foram propostos com esta finalidade: TCM-199 (SLAVIK et al., 1992), Ham F-10 e Ham F- 12 (WANI, 2002) e Tyrode (WATSON et al., 1994). Os presumíveis zigotos podem ser avaliados 24 (ALBERIO et al., 2002) a 45 horas (WANG et al., 1998) após a FIV. CROZET (1986) observou uma alta incidência de polispermia (27%) em embriões ovinos fecundados in vitro. Cultivo in vitro de embriões O aprimoramento das condições de cultivo para embriões de ovinos é necessário para melhorar sua viabilidade após a manipulação. Isso permite que os embriões sejam devidamente avaliados antes de serem transferidos para receptoras. Embriões ovinos são normalmente cultivados em meios suplementados com soro de ovelha (MURZAMADIEV et al., 1983), BSA (GARDNER et al., 1994), soro humano (WALKER et al., 1992) ou soro fetal bovino (WANI, 2002). Alguns laboratórios utilizam meio SOF suplementado com 5 a 10% de soro fetal bovino por dois a três dias após a fecundação para promover uma alta viabilidade embrionária após a transferência (COGNIÉ, 1999). A glicose em meio de cultivo é benéfica para o desenvolvimento in vitro do embrião. Contudo, zigotos ovinos tem se desenvolvido em meio contendo lactato e/ou piruvato sem glicose (WALKER et al., 1992). O meio SOF modificado, suplementado com 20% de soro humano, foi mais efetivo no desenvolvimento de blastocistos ovinos quando do uso de baixas concentrações de glicose: 1,5 mm vs 2,3 mm (THOMPSON et al., 1992). ZHU et al. (1999) utilizaram para o cultivo de embriões ovinos o TCM-199 com piruvato de sódio e soro fetal bovino. Nessas condições, foi obtida uma taxa de 64,8% de blastocistos. A adição de aminoácidos específicos no meio de cultivo facilita o desenvolvimento embrionário. Contudo, o efeito benéfico decresce com a duração do cultivo, já que a utilização dos aminoácidos pelo embriões produz níveis elevados de amônia, que por sua vez inibem o desenvolvimento de blastocistos e suas clivagens (GARDNER et al., 1994).

6 Ciência Animal, 13(2):79-87, O cultivo dos embriões pode ser realizado em atmosfera de 5% de CO 2 (NAITANA et al., 1996; WANG et al., 1998) ou com utilização de mistura de gases: 5% de CO 2, 5% de O 2 e 90% de N 2 (BYRNE et al., 2000; GULER et al., 2000; COGNIÉ et al., 2003; MORRIS et al., 2003); sendo o segundo protocolo o mais indicado. Usualmente, cerca de 50% do meio de cultivo é trocado a cada dois dias e a adição de soro fetal bovino às gotas com os embriões é realizada após 24 horas do início do cultivo (BYRNE et al., 2000; GULER et al., 2000). O cultivo de embriões em grupos, quando comparado com o individual, resulta no aumento da formação de blastocistos, mostrando que os embriões ovinos devem produzir fatores que estimulam a clivagem in vitro (GARDNER et al., 1994). Alguns sistemas de cultivo ainda utilizam a metodologia proposta por BRINSTER (1963) com gotas de meio sob óleo de parafina em placas. O óleo possui a dupla função de evitar a desidratação e a entrada de microorganismos. Também foi demonstrado que embriões cultivados em microgotas de meio sob óleo de parafina clivam mais facilmente que aqueles cultivados em meio sem óleo (WALKER et al., 1992). Os prováveis contaminantes tóxicos do óleo são eliminados através de gradativas passagens em solução salina. A eficiência do cultivo de embriões ovinos nos estádios iniciais até oito células pode ser incrementada pelo co-cultivo destes embriões em presença de monocamadas de células do oviduto (GANDOLFI & MOOR, 1987) ou vesículas trofoblásticas (REXROAD JR & POWELL, 1988). O co-cultivo de embriões ovinos também melhora seu desenvolvimento in vitro (WATSON et al., 1994). A fim de avaliar a eficiência do cultivo in vitro (Fig. 2), é observado o desenvolvimento até o estádio de blastocisto, o que se dá por volta dos seis a oito dias de cultivo (BYRNE et al., 2000). Também pode ser utilizada a contagem das células por embrião, em torno dos sete dias de cultivo, para confirmação do estádio de desenvolvimento, assim como a presença ou ausência da massa celular interna (GULER et al., 2000). A B C Figura 2: Sequência do desenvolvimento embrionário ovino: oócito maturo (A), embrião de oito células (B), blastocisto (C), blastocisto em eclosão (D) (Adaptado de WANG et al., 1998). D Transferência de embriões produzidos in vitro Os trabalhos que envolvem a PIV de embriões ovinos, chegando até a transferência propriamente dita para receptoras previamente preparadas, são relativamente escassos. ZHU et al. (1999) obtiveram uma taxa de fecundação de 90%. O percentual que se desenvolveu até os estádios de mórula e blastocisto foi de 64,8%. Os embriões oriundos do cultivo (n = 61) foram transferidos para 20 receptoras, resultando em uma taxa de gestação de 50%. Onze crias nasceram, resultando em uma taxa de sobrevivência embrionária ao parto de 18% (Fig. 3).

7 Ciência Animal, 13(2):79-87, Percentual Fec Mo/Bl SEG SEP Parâmetro observado Figura 3: Eficiência da produção in vitro de embriões ovinos da fecundação ao parto. Fec (fecundação), Mo/Bl (mórula/blastocisto), SEG (sobrevivência embrionária na gestação), SEP (sobrevivência embrionária ao parto) (Adaptado de ZHU et al., 1999). Considerações finais e perspectivas A PIV de embriões ovinos possui um grande potencial para desenvolver em direção à produção em larga escala e para aplicações em outras biotecnologias da reprodução, tais como a transgênese e a clonagem. No entanto, a etapa de MIV ainda mostra-se como o principal entrave, necessitando de maiores estudos. No Brasil, existem poucos grupos trabalhando com a PIV de embriões ovinos. Esses grupos estão localizados quase que exclusivamente nas regiões Sudeste e Sul. Torna-se também interessante que outros grupos de pesquisa sejam criados na região Nordeste, levando-se em consideração o potencial produtivo e a importância da espécie para essa região. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGRAWAL, K.P.; SHARMA, T.; SEXANA, C.; SHARMA, N. Chronology of first meiotic events of caprine oocytes matured in vitro. Indian Journal of Animal Science 65: , ALBERIO, R.; OLIVERA, J.; ROCHE, A.; ALABART, J.; FOLCH, J. Performance of a modified ovum pick-up system using three different FSH stimulation protocols in ewes. Small Ruminant Research 46: 81-87, ARLOTTO, T.; LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L.; FIRST, N.L. Correlation of oocyte diameter with time of maturation in bovine oocytes. Biology of Reproduction 46: 63, BALDASSARE, H.; DE MATOS, D.G.; FURNUS, C.C.; CASTRO, T.E.; FISCHER, E.I.C. Technique for efficient recovery of sheep oocytes by laparoscopic folliculocentesis. Animal Reproduction Science 35: , BALDASSARE, H.; FURNUS, C.C.; DE MATOS, D.G.; PESSI, H. In vitro production of sheep embryos using laparoscopic folliculocentesis: alternative gonadotrophin treatments for stimulation of oocyte donors. Theriogenology 45: , BRACKETT, B.G.; OLIPHANT, G. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro. Biology of Reproduction 12: , BRINSTER, R.L. A method for in vitro cultivation of mouse ova from two cell to blastocyst. Experimental Cell Research 32: , BYRNE, G.P.; LONERGAN, P.; WADE, M.; DUFFY, P.; DONOVAN, A.; HANRAHAN, J.P.; BOLAND, M.P. Effect of freezing rate of ram spermatozoa on subsequent fertility in vivo and in vitro. Animal Reproduction Science 62: , COGNIÉ, Y. State of art in sheep-goat embryo transfer. Theriogenology 51: , COGNIÉ, Y.; BARIL, G. Le point sur la production et le transfert d'embryons obtenus in vivo et in vitro chez la brebis et la chèvre. Productions Animales 15: , COGNIÉ, Y.; GUÉRIN, Y.; GUYADER, C.; POULIN, N.; CROZET, N. In vitro fertilization of sheep oocytes matured in vivo. Theriogenology 35: , COGNIÉ, Y.; POULIN, N.; PISSELET, C.; MONNIAUX, D. Effect of atresia on the ability of follicular fluid to support cytoplasmic maturation of sheep oocytes in vitro. Theriogenology 43: 188, 1995.

8 Ciência Animal, 13(2):79-87, COGNIÉ, Y.; BARIL, G.; POULIN, N.; MERMILLOD, P. Current status of embryos technologies in sheep and goat. Theriogenology 59: , CROZET, N. Fine structure of sheep fertilization in vitro. Gamete Research 19: , DE MATOS, D.G.; GASPARINI, B.; FURNUS, C.C.; THOMPSON, J.G. Glutathione synthesis during in vitro maturation of ovine oocytes: effect of cysteamine and β-mercaptoethanol. Theriogenology 51: 368, DODE, M.A.N; ADONA, P.R. Developmental capacity of Bos indicus oocytes after inhibition of meiotic resumption by 6-dimethyllaminopurine. Animal Reproduction Science 65: , 2001). GANDOLFI, F.; MOOR, R.M. Stimulation of early embryonic development in sheep by co-culture with oviductal epithelial cells. Journal of Reproduction and Fertility 81: 23-28, GARDNER, D.K.; LANE, M.; SPITZER, A.; BATT, P.A. Enhanced rates of cleavage and development of sheep zygotes cultured to the blastocyst stage in vitro in the absence of serum and somatic cells: amino acids, vitamins and culturing embryos in groups stimulate development. Biology of Reproduction 50: , GIANAROLI, M.C.; MAGLI, M.C.; FERRARETTI, A.P.; FIORENTINO, A.; TOSTI, E.; PANZELLA, S. Reducing the time of sperm-oocyte interaction in human in vitro fertilization improves the implantation rate. Human Reproduction 11: , GRAFF, K.J.; MEINTJES, M.; DYER, V.W.; PAUL, J.B.; DENNISTON, R.S.; ZIOMEK, C.; GODKE, R.A. Transveginal ultrasound-guided oocyte retrieval following FSH stimulation of domestic goats. Theriogenology 51: , GULER, A.; POULIN, N.; MERMILLOD, P.; TERQUI, M.; COGNIÉ, Y. Effect of growth factors, EGF and IGF-I and estradiol on in vitro maturation of sheep oocytes. Theriogenology 54: , IZQUIERDO, D.; VILLAMEDIANA, P.; PARAMIO, M.T. Effect of culture media on embryo development from pubertal goat IVM-IVF oocytes. Theriogenology 52: , KÜHHOLZER, B.; MULLER, S.; TREUER, A.; SEREGI, J.; BESENFELDER, U.; BREM, G. Repeated endoscopic ovum pick-up in hormonally untreated ewes: a new technique. Theriogenology 48: , LEIBFRIED, L.; FIRST, N.L. Characteristics of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. Journal of Animal Science 48: 76-86, MERMILLOD, P.; OUSSAID, B.; COGNIÉ, Y. Aspects of follicular and oocyte maturation that affect the developmental potential of embryos. Journal of Reproduction and Fertility 54: , MORRIS, L.H.A.; RANDALL, A.E.; KING, W.A.; JOHNSON, W.H.; BUCKRELL, B.C. The contribuition of the male to ovine embryogenesis in an in vitro embryo production system. Animal Reproduction Science 75: 9-26, MUZARMADIEV, A.M.; DOMBROVISKI, N.; ISABEKOV, B.S.; DZHIENBAEVA, R.S. Effect of sheep serum obtained at different stages of estrous cycle on the maturation of oocytes in intact follicles. Biologicheskaya 4: 67-70, NAITANA, S.; LOI, P.; LEDDA, S.; CAPPAI, P.; DATTENA, M.; BOGLIOLO, L.; LEONI, G. Effect of biopsy and vitrification on in vitro survival of ovine embryos at different stages of development. Theriogenology 46 NAQVI, S.M.K.; GULYANI, R. Ovarian response and embryo recovery to different superovulatory regimens in Rambouillet ewes under semi-arid conditions. Small Ruminant Research 34: , NAQVI, S.M.K; MADAN, M.L. Influence of caffeine on heparin treated spermatozoa for in vitro fertilization of in vitro matured ovine oocytes. Indian Journal of Animal Science 12: 65-67, NAQVI, S.M.K.; ANIL JOSHI, G.K.; MITAL, J.P. Developmental and application of ovine reproductive technologies: an Indian experience. Small Ruminant Research 39: , O'BRIAN, J.K.; CATT, S.L.; IRELAND, K.A.; MAXWELL, W.M.C.; EVANS, G. In vitro and in vivo developmental capacity of oocytes from pubertal and adult sheep. Theriogenology 47: , OUSSAID, B.; MARIANA, J.C.; POULIN, N.; FONTAINE, J.; LONERGAN, P.; BECKERS, J.F. Reduction of the developmental competence of sheep oocytes by inhibition of LH pulses during the follicular phase with GnRH antagonist. Journal of Reproduction and Fertility 117: 71-77, PARRISH, J.J.; SUSKO-PARRISH, J.L.; FIRST, N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular ph. Biology of Reproduction 41: , PTAK, G.; DATTENA, M. LOI, P.; TISCHNER, M.; CAPPAI, P. Ovum pick-up in sheep: efficiency of in vitro embryo production, vitrification and birth of offspring. Theriogenology 52: , PUGH, P.A.; FUKUI, Y.; TERVIT, H.R.; THOMPSON, J.G. Developmental ability of in vitro matured sheep oocytes collected during the non breeding season and fertilized in vitro with frozen ram semen. Theriogenology 36: , SHORGAN, B.; SUOLIAN, Z.; XIAOXIAN, X.; YEFEI, P.; HONGWU, C.; XIHE, L.; QINGLAN, H.; QIN, S. In vitro development of ovine oocytes matured and fertilized in vitro and lambing after embryo transfer. Japanese Animal Reproduction 36: 4, 1990.

9 Ciência Animal, 13(2):79-87, REXROAD JR, C.E..; POWELL, A.M. Co-culture of ovine egges with oviductal cells and trophoblastic vesicles. Theriogenology 29: , SLAVIK, T.; FULKA, J.; GOLL, I. Pregnancy rate after the transfer of sheep embryos originated from randomly chosen oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenology 38: , SNYDER, D.A.; DUKELOW, R. Laparoscopic studies of ovulation, pregnancy diagnosis and follicle aspiration in sheep. Theriogenology 2: , TERVIT, H. Laparoscopy/laparotomy oocyte recovery and juvenile breeding. Animal Reproduction Science 42: , THOMPSON, J.G.; PUGH, P.A.; TERVIT, H.R.; BERG, T.L. In vitro production of domestic animal embryos: advances made at Ruakura, New Zealand. Australasian Biotechnology 5: , WALKER, S.K.; HEARD, T.M.; SEAMARK, R.F. In vitro culture of sheep embryos without co-culture: success and perspectives. Theriogenology 37: , WALKER, S.K.; HILL, J.L.; BEL, C.A.; WARNES, D.M. Improving the rate of production of sheep embryos using in vitro maturation and fertilization. Theriogenology 41: 330, WANG, S.; LIU, Y.; HOLYOAK, G.R.; EVANS, R.C.; BUNCH, T.D. A protocol for in vitro maturation and fertilization of sheep oocytes. Small Ruminant Research 29:83-88, WANI, N.A. In vitro maturation and in vitro fertilization of sheep oocytes. Small Ruminant Research 44: 89-95, WANI, N.A.; WANI, G.M.; KHAN, M.Z.; SIQUIDI, M.A. Efect of different factors on the recovery of oocytes for IMV-IVF procedures in sheep. Small Ruminant Research 34: 71-76, WANI, N.A.; WANI, G.M.; KHAN, M.Z.; SALAHUDIN, S. Effect of oocyte harvesting technique on in vitro maturation and in vitro fertilization in sheep. Small Ruminant Research 36: 63-67, WATSON, A.J.; WATSON, P.H.; WARNES, D.; WALKER, S.K.; ARMSTRONG, D.T.; SEAMARK, R.F. Preimplantation development of in vitro matured and in vitro fertilized ovine zygotes: comparison between co-cultured on oviductal epithelial cell monolayers and culture under low oxygen atmosphere. Biology of Reproduction 50: , ZHU, Y.; GUO, Y.; NI, H. Progress in biotechnology of small ruminants in China. Small Ruminant Research 34: , 1999.