EFEITO DO MÉTODO DE COLHEITA SOBRE A TAXA DE RECUPERAÇÃO E A QUALIDADE OOCITÁRIA EM OVINOS DO NORDESTE BRASILEIRO

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1 Ciência Animal 20(2):97-102, 2010 EFEITO DO MÉTODO DE COLHEITA SOBRE A TAXA DE RECUPERAÇÃO E A QUALIDADE OOCITÁRIA EM OVINOS DO NORDESTE BRASILEIRO (Effect of harvesting method on recovery rate and oocyte quality in sheep of northeastern Brazil) Agostinho Soares de ALCÂNTARA NETO *, Juliana Vieira LUZ, Maria Luciana Lira de ANDRADE, Vicente José de Figueirêdo FREITAS Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução/Faculdade de Veterinária/UNiversidade Estadual do Ceará RESUMO A produção in vitro (PIV) de embriões vem despertando o interesse devido ao seu potencial para uso em programas de melhoramento genético em diversas espécies. Sabendo-se que a obtenção eficiente de oócitos de boa qualidade é uma etapa importante para o sucesso da PIV, este trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de colheita oocitária em ovelhas criadas no Nordeste do Brasil. Para tanto, ovários (n = 62) de ovelhas sem padrão racial definido (SPRD) foram colhidos em abatedouro e transportados para o laboratório em solução salina acrescida de antibióticos. Estes ovários foram submetidos à punção folicular pelos sistemas de bomba de vácuo ou seringa, ambos acoplados a uma agulha 19G. O meio de colheita foi o TCM199 tamponado com HEPES e suplementado com gentamicina e heparina. Após a punção folicular, os complexos cumulus-oócito (CCOs) colhidos foram visualizados em estereomicroscópio e classificados quanto a sua qualidade. As comparações foram realizadas através do teste t de Student ou χ 2, quando conveniente. O método de punção folicular com bomba de vácuo foi superior (P < 0,05), em relação à seringa, tanto no que se refere à taxa de recuperação oocitária (69,4% vs 27,5%) quanto ao número de oócitos de qualidade colhidos por ovário (2,0 ± 0,1 vs 0,3 ± 0,1). Em conclusão, o método de punção folicular por bomba de vácuo mostrou-se ser o mais eficiente para a recuperação de estruturas viáveis, e, portanto recomenda-se o uso do mesmo em programas de PIV de embriões da espécie ovina. PALAVRAS-CHAVE: Ovino; Ovário; Colheita oocitária; PIV de embriões. ABSTRACT The in vitro embryo production (IVP) has been awakening the interest due to its potential in genetic improvement programs in many species. Knowing that the recovery of good quality oocytes is a crucial step for the IVP success, the aim of this work is to compare two aspiration methods in ewes reared in northeastern Brazil. The ovary of undefined breed ewes (n = 62) was obtained from slaughterhouse and transported to the laboratory in saline solution with antibiotics. The ovaries were submitted to follicular punction with an aspiration pump or syringe, both linked to a 19G needle. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were harvested in TCM199 with HEPES, supplemented with heparin and gentamicin. After the follicular punction, the COCs were visualized in a stereomicroscope and classified according their quality. The results were analyzed with t-student and χ 2 tests. The follicular punction method with an aspiration pump was better (P < 0,05) than the * Enderço para correspondência Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução Faculdade de Veterinária/ UECE Av. Dedé Brasil, 1700, Fortaleza-CE, netosa@gmail.com Ciência Animal 20(2):97-102,

2 syringe method, as much in the oocyte recovery rate (69,4% vs 27,5%), as in the oocyte quality (2,0 ± 0,1 vs 0,3 ± 0,1). In conclusion, the aspiration pump method showed to be the most efficient for the harvesting of viable oocytes. Therefore the use of this technique is recommended for the IVP of ovine embryos. KEY WORDS: Sheep; Ovary; Oocyte recovery; Embryo IVP. INTRODUÇÃO As modernas técnicas de reprodução assistida contribuem para a multiplicação de animais geneticamente valiosos. Uma destas técnicas é a produção in vitro (PIV) de embriões, a qual apresenta como principais vantagens: produção de embriões por repetidas vezes na mesma doadora (KUHHOLZER et al., 1997; SEVILLANO et al. 1997), uso de animais prépúberes, púberes e prenhes como doadoras (ANEL et al., 1997) e produção de embriões de animais valiosos que morreram ou foram sacrificados (LAZZARI & GALLI, 1993). Um programa de PIV de embriões, em qualquer espécie, depende de vários fatores, sendo um dos mais importantes uma eficiente colheita dos complexos cumulus-oócito (CCOs). Um grande número de oócitos de boa qualidade é necessário porque somente 30% dos oócitos colhidos chegam até ao estádio de blastocisto (BERNARDI et al., 1996; PTAK et al., 1999). Assim, os CCOs devem ser foco de maior investimento a fim de torná-los aptos a se desenvolver até blastocisto em um sistema in vitro (BRUYNZEEL et al., 1997). A PIV de embriões ovinos não é uma biotécnica completamente estabelecida, uma vez que as condições ideais de maturação (MIV), fecundação (FIV), e cultivo in vitro (CIV) ainda não estão precisamente elucidadas (BERNARDI, 2005). Em adição, os diferentes métodos de obtenção dos oócitos a serem utilizados no sistema de PIV de embriões ainda estão em fase de desenvolvimento. Os dois principais fatores que afetam a colheita oocitária, excetuando-se a fêmea 98 Ciência Animal 20(2):97-102, 2010 doadora e o operador que realiza a colheita, são as alterações na dinâmica ovariana e as condições físicas (equipamento, etc) no momento da operação (BOLS et al., 1997). Em ovinos, as informações referentes à dinâmica ovariana foi tema de uma extensa revisão (VAN DER HURK & ZHAO, 2005). No entanto, um dos aspectos físicos da colheita de oócitos que influencia no sucesso da técnica é a pressão de aspiração da bomba de vácuo. Em ovinos pressões de 50 a 150 mmhg já foram utilizadas (BALDASSARRE et al. 1996; PAULA et al., 2005). Embora a seringa ainda seja mundialmente utilizada na aspiração folicular para obtenção de oócitos, existem críticas quanto à falta de padrão da pressão no momento desta aspiração. Diante do exposto, este trabalho teve por objetivo realizar a comparação entre dois métodos de colheita oocitária, aspiração por bomba de vácuo e seringa, visando avaliar a influência dos mesmos sobre a taxa de recuperação e qualidade oocitária em ovelhas criadas no Nordeste do Brasil. MATERIAL E MÉTODOS Ovários e colheita dos oócitos Foram utilizados neste estudo ovários (n = 62) obtidos em abatedouros próximos à Fortaleza, provenientes de ovelhas sem padrão racial definido (SPRD). Os ovários foram transportados ao laboratório em solução de NaCl 0,9% acrescida de 40 mg/ml de Pentabiótico (Fort Dodge, São Paulo, Brasil), à temperatura de 37 a 39ºC durante um intervalo máximo de três horas. No laboratório, os ovários foram

3 Figura 1. Métodos utilizados para a punção folicular em ovários de ovelha: bomba de vácuo ou seringa. lavados com a solução de transporte e mantidos em banho-maria a 37 C. Em seguida, os ovários foram divididos aleatoriamente em dois grupos e submetidos à colheita oocitária pelas técnicas de aspiração com bomba de vácuo ou com seringa (Fig. 1). No primeiro grupo foi utilizada uma bomba de vácuo (Pioneer Pro-Pump, Guilford, EUA), ajustada para uma vazão de 15 ml/min, acoplada a um tubo tipo Falcon de 50 ml contendo meio de colheita e este por sua vez conectado a uma agulha 19G. No segundo grupo foi utilizada uma seringa de 5 ml contendo meio de colheita, também acoplada a uma agulha 19G. Em ambos os métodos foram aspirados apenas os folículos com diâmetro entre dois a seis milímetros. O meio de colheita utilizado consistiu de TCM199 (Nutricell, São Paulo, Brasil) tamponado com 2,38 mg/ml de HEPES (Sigma, Missouri, EUA), suplementado com 40 ìg/ml de gentamicina (Sigma, Missouri, EUA) e 2 UI/ ml de heparina (Hipolabor, São Paulo, Brasil). Classificação e seleção oocitária Após a punção folicular, o meio colhido Ciência Animal 20(2):97-102, 2010 foi transferido para uma placa de Petri (Corning, Nova Iorque, EUA) a fim de realizar a procura dos CCO s sob estereomicroscópio (SMZ-800- Nikon, Kawasaki, Japão) no aumento de 10 a 60. Os CCO s foram avaliados e selecionados de acordo com a presença e disposição das células do cumulus e aparência do ooplasma, segundo a classificação de BALDASSARRE et al. (2003). Brevemente, os CCOs foram avaliados como Grau I (oócito com zona pelúcida intacta, ooplasma homogêneo e circundado completamente por uma ou mais camadas de células do cumulus), Grau II (oócito com zona pelúcida intacta, ooplasma homogêneo e circundado parcialmente uma ou mais camadas de células do cumulus), Grau III (oócito com zona pelúcida intacta, ooplasma homogêneo e sem presença de células do cumulus) ou Grau IV (oócito apresentando zona pelúcida rompida ou ooplasma heterogêneo/retraído). Análise estatística Foram avaliados os parâmetros de taxa de recuperação (n o de CCOs colhidos/n o de 99

4 Tabela 1. Número de oócitos colhidos e taxa de recuperação oocitária (oócitos colhidos/folículos aspirados) após aspiração folicular em ovários ovinos por bomba de vácuo ou seringa. Método Ovários (n) N. folículos aspirados N. oócitos Taxa de recuperação colhidos (%) Bomba a 69,4 a Seringa b 27,5 b Valores com letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente (P < 0,05). folículos puncionados x 100), número médio de CCOs colhidos por ovário e de CCOs nos diferentes graus de qualidade. Para comparação entre as duas técnicas foram utilizados o teste t de Student ou o teste do χ 2, quando conveniente. Considerou-se um nível de significância de 5%. RESULTADOS Os resultados referentes ao número de folículos puncionados, oócitos colhidos e de taxa de recuperação, após a punção folicular por bomba de vácuo ou seringa, estão apresentados na Tab. 1. Tanto no que diz respeito ao número total de estruturas colhidas como à taxa de recuperação, o método de aspiração por bomba de vácuo apresentou-se superior (P < 0,05) quando comparado à aspiração por seringa. Na Tab.2, referente ao número médio de oócitos colhidos por ovário, mais uma vez o método de bomba de vácuo demonstrou diferença significativa (P < 0,05) em relação ao método de seringa. Durante as sessões de colheita foi possível observar todos os graus de qualidade oocitária (Fig. 2). No entanto, como observado na Tab. 2, a qualidade oocitária (CCO s de Grau I e II) foi superior para as estruturas colhidas através de bomba de vácuo ao invés de seringa. DISCUSSÃO No presente estudo foi possível observar que o método de aspiração por bomba de vácuo produziu uma taxa de recuperação oocitária, bem como uma quantidade de oócitos por ovário, superior à seringa. Em um estudo realizado em ovinos por MORTON et al. (2007), o método de colheita por bomba de vácuo mostrou taxas de recuperação similares à seringa (73,1% vs 68,0%). No entanto, vale salientar que nosso trabalho e aquele de MORTON et al (2007) utilizaram seringas de volume diferente, o que pode acarretar em diferentes pressões de aspiração. Em nosso estudo, foi observada uma superioridade significativa do método de bomba Tabela 2. Média (± e.p.) de folículos, oócitos e CCO s de boa qualidade colhidos por ovário após aspiração folicular em ovários ovinos por bomba de vácuo ou seringa. Método Nº de estrutura/ovário folículos Oócitos CCOs de grau I e II Bomba 3,8 ± 0,4 a 2,6 ± 0,3 a 2,0 ± 0,1 a Seringa 3,4 ± 0,5 a 0,9 ± 0,3 b 0,3 ± 0,1 b Valores com letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente (P < 0,05). 100 Ciência Animal 20(2):97-102, 2010

5 Figura 2. CCOs colhidos após punção folicular em ovários ovinos e apresentando grau de qualidade I (A), II (B), III (C) e IV (D). Aumento de 400X. de vácuo, quando comparado à seringa, no que se refere à colheita de oócitos de boa qualidade. Resultado semelhante foi observado por MORTON et al. (2007), os quais colheram em média (± d.p.) 2,0 ± 0,4 oócitos de boa qualidade (graus I e II) por ovário, enquanto pelo uso da seringa foram recuperados 1,5 ± 0,2 oócitos por ovário. A qualidade oocitária é um parâmetro importante para o sucesso da MIV e posterior FIV e está diretamente relacionada com a quantidade e a disposição de células do cumulus circundando o oócito (SHIRAZI et al., 2005). Essas células somáticas regulam o desenvolvimento oocitário, pois, através das junções gap, funcionam como moduladores do efeito de diversos hormônios, como o FSH e o LH (LI et al., 2000; SHIMADA et al., 2001). Além disso, as células do cumulus secretam uma série de substâncias regulatórias que estimulam a maturação oocitária (LI et al., 2000). Assim, colher o maior número possível de estruturas de qualidade implica em um melhor funcionamento do sistema de PIV de embriões. A baixa quantidade de oócitos colhidos por ovário em nosso experimento, esta diretamente relacionada à pequena quantidade de folículos visíveis em cada ovário. Em diferentes publicações com pequenos ruminantes são citados números superiores (ISLAM et al., 2007; MORTON et al., 2007). Essa pequena quantidade de folículos encontrados em cada ovário deve- se a baixa qualidade nutricional e sanitária do rebanho de ovelhas SPRD no Nordeste do Brasil. Em conclusão, dentre os métodos de colheita oocitária testados, a bomba de vácuo mostrou-se ser o mais eficiente, pois produziu uma maior quantidade de oócitos e com melhor qualidade, sendo assim o mesmo é indicado para uso em programas de PIV de embriões ovinos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEL, L.; SEVILLANO, C.; ALVAREZ, M.; ANEL, E.; BOIXO, J.C.; OLMEDO, J.; DE PAZ, P.; DE LA FUENTE, J. Oocyte recovery rate in repeated laparoscopic follicle aspiration (LFA) in lambs. In: Gametes: Development and Function, 1, 1998, Milan. Anais Roma, 1998, v. 1, p BALDASSARRE, H.; FURNUS, C.C.; de MATOS, D.G.; PESSI, H. In vitro production of sheep embryos using laparoscopic folliculocentesis: alternative gonadotrophin treatments for stimulation of oocyte donors. Theriogenology, v. 45, p , BALDASSARRE, H.; WANG, B.; KAFIDI, N.; GAUTHIER, M.; NEVEU, N.; LAPOINT, J.; SNEEK, L.; LEDUC, M.; DUGUAY, F.; ZHOU, J.F.; LAZARIS, A.; KARATZAS, C.N. Production of transgenic goats by pronuclear microinjection of in vitro produced zygotes derived from oocytes recovered by laparoscopy. Theriogenology, v. 59, p , BERNARDI, M.L.; FLECHON, J.E.; DELOUIS, C. Influence of culture system and oxygen tension on the development of ovine zygotes matured and fertilized in vitro. Journal of Reproduction and Ciência Animal 20(2):97-102,

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