4- Cobrir o strip com 3 ml de DryStrip Cover Fluid para evitar evaporação e cristalização de uréia.

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1 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL PRIMEIRA DIMENSÃO (SISTEMA ETTAN IPGphor / GE Healthcare) CUP LOADING (com aplicação no anodo (+) = funciona melhor para a maioria das amostras, especialmente proteínas básicas. Para quantidades maiores de proteína (> 200 µg) a precipitação no cup pode ser um problema) Rehidratação do strip: 1- No Reswelling Tray limpo, seco e nivelado, pipetar 350 µl de solução de reidratação (adicionar na hora 7 mg de DTT para cada 2,5 ml de solução). 2- Retirar o strip (18 cm) do freezer e puxar lentamente o plástico de proteção do gel a partir da extremidade ácida (+), evitando danos à extremidade básica, que costuma ser mais frágil. 3- Com o lado do gel voltado para baixo, espalhar o volume de solução ao longo da calha de reidratação (centralmente ao espaço a ser ocupado pelo strip), com movimentos suaves do strip para frente e para trás até que todo o gel fique em contato com a solução. O lado ácido do gel (+) deve estar posicionado ao lado dos números marcados no Reswelling Tray. 4- Cobrir o strip com 3 ml de DryStrip Cover Fluid para evitar evaporação e cristalização de uréia. 5- Tampar o Reswelling Tray e deixar reidratar por 12 horas à temperatura ambiente. 6- O strip reidratado pode ser guardado congelado a 70 C ou utilizado imediatamente. Aplicação da amostra: 1- Após reidratação nivelada do strip, retirá-lo do Reswelling Tray e lavá-lo mergulhando rapidamente o mesmo em uma proveta de 100 ml com água MQ. 2- Deixar escorrer o excesso de água e colocar o strip sobre um papel de filtro com o lado do gel virado para cima. 3- Molhar um pedaço de papel de filtro com água MQ, secar o excesso de líquido com um papel higiênico e usá-lo para fazer uma espécie de blotting sobre o strip (objetivo é garantir que todos os strips tenham a mesma quantidade de água). 4- Posicionar o strip, com lado do gel voltado para cima, no sarcófago especial para cup loading, alinhando-o entre as barriguinhas do mesmo. Atenção para o posicionamento do strip em relação à região dos eletrodos do sarcófago. Trabalhar rapidamente a partir deste momento para que não haja cristalização da uréia. 5- Molhar pequenos pedaços de papel de filtro grosso (filter pads com 0,5 mm de espessura) com água destilada (não usar água MQ! Precisamos de íons!). Secar o excesso de água, posicionar os papéis sobre as extremidades de cada strip e colocar os eletrodos sobre os papéis (nunca posicionar os eletrodos diretamente sobre o gel). 6- Posicionar o cup no anodo (+)(funciona melhor na maior parte dos casos), perto do eletrodo correspondente. Para checar vazamento deste reservatório, preencher todo o sarcófago com 5 ml de DryStrip Cover Fluid e observar entrada de óleo no cup.

2 7- Aplicar amostra no cup ( µl - concentração protéica máxima de 10 mg/ml) após centrifugação a xg por 10 minutos. A amostra deve ter sido dissolvida na solução de reidratação modificada, contendo 9,5 M de uréia (facilita entrada das proteínas no gel) e ditiotreitol (de 20 a 100mM). 8- Adicionar 20 µl de DryStrip Cover Fluid sobre a amostra (evita evaporação e cristalização da uréia). 9- Posicionar o sarcófago sobre o equipamento IPGphor (deve estar a 20 C) e depois fechá-lo. Fechar a tampa do IPGphor. 10- Os pedacinhos de papel devem ser trocados pela primeira vez assim que a focalização atingir Volts (após 3 h e 30 min) e depois a cada 3 horas (não esquecer de molhá-los com água destilada e retirar o excesso de líquido antes de posicioná-los sobre o gel). 11- As condições elétricas utilizadas são as recomendadas pela Dra. Angelika Görg ( : Para strips de 18 cm: Focalização a 20 C 50 µa / strip Programa: 200 Volts por 1 hora 500 Volts por 1 hora por 1 hora a Volts em 30 minutos Volts por : 3 horas* / 3-10 L e NL (7 unidades de ph) 4 horas* / 4-7 (3 unidades de ph) 8 horas* / 4-5 (1 unidade de ph) *Tempos otimizados para focalização de quantidades analíticas de material (até 100 µg). Para corridas preparativas, repetir os mesmos passos iniciais e aumentar em 50% o passo de focalização a Volts. 12- Após a focalização, o strip pode guardado congelado a 70 C para ser submetido à segunda dimensão posteriormente. 13- O sarcófago deverá ficar de molho em sabão neutro overnight e depois lavado com escovinha (não pode ser autoclavado). Solução de reidratação do strip (estocar alíquotas de 500 µl a 20 C) Concentração final Quantidade Uréia (PM 60,06) 8 M 12 g CHAPS 2 % 0,5 g Azul de bromofenol 0,002 % 50 µl de solução estoque a 1% Água MQ Completar para 25 ml *Ditiotreitol e IPG Buffer deverão ser adicionados na hora. DTT pode ser utilizado na faixa de 20 a 100mM e IPG Buffer, de mesmo intervalo de ph do strip a ser utilizado, na faixa de 0,5 a 2% (v/v). Solução para solubilizar a amostra (estocar alíquotas de 250 µl a 20 C) Concentração final Quantidade Uréia (PM 60,06) 9,5 M 14,3 g CHAPS 2 % 0,5 g Azul de bromofenol 0,002 % 50 µl de solução estoque a 1% Água MQ Completar para 25 ml *Ditiotreitol e IPG Buffer deverão ser adicionados na hora. DTT pode ser utilizado na faixa de 20 a 100mM e IPG Buffer, de mesmo intervalo de ph do strip a ser utilizado, na faixa de 0,5 a 2% (v/v).

3 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL PRIMEIRA DIMENSÃO (SISTEMA ETTAN IPGphor / GE Healthcare) SAMPLE IN-GEL REHYDRATION (Não é recomendado para amostras contendo proteínas de alto peso molecular, muito básicas e/ou hidrofóbicas. Utilizado principalmente quando se tem volumes maiores de amostra e/ou muita quantidade de proteína). Rehidratação do strip: 1- No centro do sarcófago de cerâmica (strip holder) limpo, seco e nivelado, pipetar 350 µl de solução de reidratação já contendo a amostra (adicionar na hora 7 mg de DTT para cada 2,5 ml de solução) 2- Retirar o strip (18 cm) do freezer e puxar lentamente o plástico de proteção do gel a partir da extremidade ácida (+), evitando danos à extremidade básica, que costuma ser mais frágil. 3- Com o lado do gel voltado para baixo, espalhar o volume de solução ao longo da calha de reidratação com movimentos suaves do strip para frente e para trás até que todo o gel fique em contato com a solução. O lado ácido do gel (+) deve estar posicionado no lado pontudo do sarcófago. É importante que não haja bolhas entre a solução e o gel. 4- Cobrir o strip com 3 ml de DryStrip Cover Fluid para evitar evaporação e cristalização de uréia. 5- Tampar o sarcófago e deixar reidratar por 12 horas no IPGPhor, a 30 Volts constantes (ajuda entrada de proteínas de maior massa molecular/ dessaliniza a amostra). 6- As condições elétricas utilizadas são as recomendadas pela Dra. Angelika Görg ( Para strips de 18 cm: Focalização a 20 C 50 µa / strip Programa: 30 Volts por 12 horas 200 Volts por 1 hora 500 Volts por 1 hora por 1 hora a Volts em 30 minutos Volts por : 3 horas* / 3-10 L e NL (7 unidades de ph) 4 horas* / 4-7 (3 unidades de ph) 8 horas* / 4-5 (1 unidade de ph) *Tempos otimizados para focalização de quantidades analíticas de material (até 100 µg). Para corridas preparativas, repetir os mesmos passos iniciais e aumentar em 50% o passo de focalização a Volts. Obs.: Eventualmente, se a amostra contiver muito sal ou se quisermos reduzir a precipitação nos eletrodos (géis com intervalos de ph pequenos), podemos colocar pedaços de papel de filtro umedecidos com água DESTILADA (filter pads) entre os eletrodos e o gel, uma hora antes do final da focalização a Volts.

4 7- Após a focalização, o strip pode ser guardado congelado a 70 C para ser submetido à segunda dimensão posteriormente. 8- O sarcófago deverá ficar de molho em sabão neutro overnight e, depois de lavado, deverá ser autoclavado. As tampas transparentes deverão ficar de molho na água sanitária 50% (v/v) ou em 1% de hipoclorito de sódio e depois lavadas (não podem ser autoclavadas). Solução de reidratação (estocar alíquotas de 500 µl a 20 C) Concentração final Quantidade Uréia (PM 60,06) 8 M 12 g CHAPS 2 % 0,5 g Azul de bromofenol 0,002 % 50 µl de solução estoque a 1% Água MQ Completar para 25 ml *Ditiotreitol e IPG Buffer deverão ser adicionados na hora. DTT pode ser utilizado na faixa de 20 a 100mM e IPG Buffer, de mesmo intervalo de ph do strip a ser utilizado, na faixa de 0,5 a 2% (v/v).

5 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL SEGUNDA DIMENSÃO (SISTEMA ETTAN DALTSix / GE Healthcare) Montagem dos géis (25,5 x 20,5 cm): 1- Checar se a bancada para montagem dos géis está nivelada. Vidros e espaçadores devem estar limpos e secos. 2- No gel caster, montar os sanduíches de gel da seguinte forma (para 6 géis de 1 mm / ordem de trás para frente) EMPURRAR TODO O SANDUÍCHE PARA A ESQUERDA: 5 espaçadores grossos 3 espaçadores finos 6 conjuntos de vidros com espaçadores finos entre eles (vidro com espaçador de 1 mm/vidro liso/espaçador fino) 2 espaçadores finos Tampa do gel caster Obs.: A altura dos sanduíches deve ficar cerca de 0,5 cm acima do gel caster. As bordas arredondadas dos espaçadores devem estar voltadas para cima. Os vidros com espaçadores devem ficar com o lado onde os espaçadores não chegam até o fim do vidro voltado para cima. Gel de poliacrilamida: receitas segundo Laemmli, U.K. Nature 227, (1970)(no final deste protocolo). (as soluções devem ser guardadas na geladeira/ Persulfato de amônio a 10 % pode ser aliquotado e congelado/ TEMED deve ser saturado com nitrogênio após a utilização). 3- Encher o gel caster com a mistura de gel de acrilamida até cerca de 1 cm abaixo do vidro menor. Este processo deve ser feito LENTAMENTE, com a ajuda de um funil, para evitar formação de bolhas e redemoinhos no gel. 4- Colocar 1 ml de butanol saturado com água sobre cada sanduíche. A polimerização deve ocorrer entre minutos. Após cerca de 40 minutos, devemos abrir o gel caster e lavar bem os sanduíches de gel com água MQ para retirar completamente o butanol. 5- Cobrir o gel com tampão de corrida 1X concentrado e guardar à temperatura ambiente até o dia seguinte com a parte de baixo do gel imersa em um recipiente com tampão de corrida 1X concentrado (eventualmente, pode-se preparar o gel na sexta-feira para correr na segunda). 6- Preparar 1 L de tampão de corrida 2X concentrado para o compartimento superior da cuba de eletroforese e cerca de 5 L de tampão 1X concentrado para o compartimento inferior. Equilíbrio dos strips: 1- Retirar os strips do congelador e incubar com 10 ml de tampão de equilíbrio com SDS, contendo 100 mg de DTT, com agitação, por 15 minutos. 2- Escorrer o tampão com DTT e adicionar mais 10 ml de tampão de equilíbrio com SDS, contendo 400 mg de iodoacetamida. Incubar por mais 15 minutos, com agitação. 3- Rinsar rapidamente o strip em tampão de corrida Tris-glicina 1X concentrado (em proveta de 100 ml) e deixar escorrer o excesso de líquido em papel de filtro.

6 4- Com o sanduiche de gel deitado sobre a bancada, posicionar o strip sobre o vidro maior (gel virado para cima) 5- Colocar o sanduíche de gel na estante vertical e posicionar o strip em ângulo de 30 sobre o gel de poliacrilamida, com o lado ácido apontado para cima, no lado esquerdo do gel. 6- À esquerda do strip, posicionar um pedaço de papel de filtro fino (1 cm de comprimento por 0,5 cm de altura) contendo uma mistura v/v de peso molecular (GE Healthcare) e agarose 1% em água. Os volumes da mistura utilizados são 8 µl para coloração por Coomassie e 3,5 µl para revelação por prata. 7- Pipetar rapidamente cerca de 3 ml de agarose 0,5% com azul de bromofenol a 80 C ao longo do strip, a partir do lado direito do gel. Esta operação deve ser feita em dupla. À medida que uma pessoa pipeta a agarose, a outra empurra o strip da direita para a esquerda com uma espátula até apoiá-lo completamente sobre o gel da segunda dimensão. Desta forma, evita-se a presença de bolhas entre o strip e o gel de poliacrilamida (Não pipetar a agarose diretamente sobre o papel com o peso molecular). Montagem dos géis na cuba de eletroforese: 1- Encher a cuba de eletroforese com tampão de corrida 1X concentrado até a marca LBC start fill line (aproximadmente 4 L). Ligar a bomba de circulação da cuba na tomada e ligar banho a 15 C (temperatura na cuba será de aproximadamente 30 C) (NUNCA LIGAR A CUBA NA TOMADA SEM LÍQUIDO DENTRO PARA NÃO QUEIMAR A BOMBA DE CIRCULAÇÃO DE LÍQUIDO). 2- Pocisionar os sanduíches de gel no compartimento próprio da cuba de eletroforese. Quando usar menos de 6 géis, preencher os espaços vazios com placas de acrílico (blank). 3- Encaixar o compartimento superior da cuba e preencher com tampão de corrida 2X concentrado até o nível entre o mínimo e o máximo (checar se há algum vazamento). 4- Completar o tampão de baixo (1X concentrado) até o nível do tampão de cima. 5- Fechar a cuba e iniciar a corrida com as seguintes condições elétricas: 2,5 W / gel por 30 minutos 100 W total constantes até o final (cerca de 4 horas para 6 géis basta acompanhar a frente de migração do azul de bromofenol). PREPARO DAS SOLUÇÕES: Solução estoque de acrilamida Reagente Concentração final Quantidade (% T) Acrilamida 29,2 % 73 g Bis-acrilamida 0,8 % 2 g Água MQ completar para 250 ml Acrilamida é uma substância altamente tóxica e deve ser manipulada com todo cuidado e usando os equipamentos de proteção individual apropriados (luvas/máscara/óculos). Filtrar a solução e estocar na geladeira por até 1 semana. Tampão Tris-HCl 1,5 M ph 8,8 Reagente Concentração Quantidade final Tris (PM 121,14) 1,5 M 90,85 g HCl titular até ph 8,8 Água MQ completar para 500 ml Filtrar a solução e estocar na geladeira por até 1 mês.

7 Solução para gel de poliacrilamida (suficiente para 6 géis de 1 mm de espessura) Reagente Gel 15 % Gel 12 % Gel 10 % Gel 7,5 % Acrilamida (29,2 : 0,8) 250 ml 200 ml 166,7 ml 125 ml Tris-HCl 1,5 M ph 8,8 [final] 375 mm 125 ml 125 ml 125 ml 125 ml Água MQ 117,7 ml 167,7 ml 201 ml 242,7 ml SDS 10 % [final] 0,1% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml DESAERAR 20 min Persulfato 10 % (p/v) 2,1 ml 2,1 ml 2,1 ml 2,1 ml TEMED 0,21 ml 0,21 ml 0,21 ml 0,21 ml VOLUME TOTAL 500 ml Butanol saturado com água Reagente Quantidade Butanol 33 ml Água MQ 7 ml Combinar os dois em um tubo tipo Falcon de 50 ml e agitar vigorosamente. Deixar decantar e usar a fase superior para cobrir os géis. Deve ser guardado à temperatura ambiente por tempo indeterminado. Tampão de corrida 10 X concentrado Reagentes Concentração final Quantidade Tris (MW 121,14) 250 mm 60,6 g Glicina (MW 75,07) 1,92 M 288,3 g SDS 1 % 20 g Água MQ Completar para 2 L Não acertar o ph deste tampão (deve ficar em cerca de 8,3). Filtrar a solução e estocar na geladeira. Tampão de equilíbrio com SDS Reagentes Concentração final Quantidade Tampão Tris-HCl 1,5 M ph 8,8 50 mm 8,3 ml Uréia (MW 60,06) 6 M 90,09 g Glicerol (87 % v/v) 30 % (v/v) 86,2 ml SDS 2 % 5 g Azul de bromofenol 0,002 % 500 µl de uma solução a 1% Água MQ Completar para 250 ml Filtrar a solução e estocar no freezer alíquotas de 10 ml. DTT e iodoacetamida devem ser adicionados ao tampão de equilíbrio na hora. Solução de agarose para selar o gel Reagente Concentração final Quantidade Tampão de corrida 1 X [ ] 25 mm Tris /192 mm glicina/ 0,1% SDS 100 ml Agarose 0,5 % 0,5 g BFB (solução estoque a 1%) 0,002 % 200 µl Colocar a agarose e o tampão em um Erlenmeyer de 500 ml com agitação e banho-maria. Aquecer até a agarose dissolver completamente (solução fica transparente como água) e só depois adicionar o azul de bromofenol (BFB). Aliquotar em eppendorfs de 2 ml ou estocar em Erlenmeyer de 250 ml na geladeira.

8 TÉCNICAS PARA REVELAÇÃO DO GEL COOMASSIE R-250* 1- Fixar gel overnight em etanol 40 % (ou metanol), ácido acético 10 % em água, sob agitação moderada. 2- Desprezar solução fixadora e repetir passo anterior por 30 min. 3- Desprezar solução fixadora e adicionar Coomassie Blue R-250 0,2 % em etanol 40 % (ou metanol), ácido acético 10 % em água, sob agitação moderada, por 3 h. 4- Descorar em etanol 40 % (ou metanol), ácido acético 10 % em água, sob agitação moderada, por 2-3 horas (fazer 2-3 trocas), parando quando o background ainda estiver razoavelmente azul. 5- Desprezar solução descorante e deixar o gel em água (24-72 horas) para completar descoloração. 6- Guardar o gel em ácido acético a 1% em água. *Gel grande 500 ml de solução por passo COOMASSIE R-250 UTILIZANDO MICROONDAS MINI-GÉIS Colocar o gel em recipiente resistente ao microondas, adicionar aproximadamente 70 ml da solução fixadora ( Etanol 40%; Ácido acético 10% em água) e cobrir (sem fechar) recipiente com sua tampa. Irradiar por 1 min, a 700 W, em microondas da seguinte maneira: 30 s, parar e agitar o vasilhame para distribuir o calor uniformemente, seguidos de mais 30 s de irradiação. Descartar a solução, colocar o mesmo volume de solução corante (Coomassie Blue R-250 0,2 % em etanol 40 %; Ácido acético 10 % em água) e irradiar conforme acima descrito. Descartar solução, colocar solução descorante (mesma formulação que solução fixadora) e seguir técnica de irradiação novamente. Para aquisição da imagem será necessário terminar de descorar, por mais alguns minutos, sob agitação constante e à temperatura ambiente. O toque final de descoloração deve ser feito em água.

9 COOMASSIE COLOIDAL (G-250)* - (Rabilloud and Charmont, 2000) 1- Fixar gel 3 x 30 min em etanol (ou metanol) 30 %, ácido fosfórico 2 % (v/v) em água, sob agitação moderada. 2- Lavar 3 x 20 min em ácido fosfórico 2 % (v/v) em água, sob agitação moderada. 3- Desprezar solução e adicionar solução contendo ácido fosfórico 2 % (v/v), etanol (ou metanol) 18 %, sulfato de amônio 15 % em água, sob agitação moderada por 30min. 4- Adicionar ao gel 5 ml (1% do volume) de uma solução contendo 20 g de Coomassie Blue G-250 por litro (de água). Deixar corar de 24 a 72 horas sob agitação moderada. 5- Se necessário, remover o background com água. *Gel grande 500mL solução por passo COMENTÁRIOS SOBRE O PREPARO DE SOLUÇÕES 1 O ácido fosfórico estoque utilizado apresenta 85% de concentração. 2 Para preparar 1 litro de solução fixadora, pese 150g de sulfato de amônio em um becker de 1L, adicione 700mL de água MilliQ e submeta à agitação magnética até completa solubilização do sal. Filtre com membrana de 0,45um e transfira filtrado para proveta de 1L. Adicione 20mL de ácido fosfórico estoque, misture e adicione 180mL de etanol absoluto. Complete com água até 1L e misture. 3 A solução de Coomassie Blue G-250 é preparada pela dissolução de 2g de corante em 100mL de água quente sob agitação. A dissolução estará completa em 30min. Deixe a solução esfriar, adicione 0,2g/L de azida sódica para preservação. Armazene à temperatura ambiente. Rabilloud, T., Charmont, S., Detection of proteins on two-dimensional electrophoresis gels. In: Rabilloud, T. (Ed.) Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophresis and Identification Methods. Springer, New York, pp

10 COOMASSIE COLOIDAL (G-250)* - (Neuhoff et al., 1988) 1 - Fixar gel por 1h em ácido tricloroacético a 12% (m/v), sob agitação moderada (teoricamente poderia-se começar do passo 3); 2 - Lavar 2 x 30min com água, sob agitação moderada; 3 - Adicionar solução de revelação e deixar sob agitação moderada de 24-72h; 4 - Lavar rapidamente com metanol 25% (v/v) em água; 5 - O gel pode ser guardado em caixa bem selada em sulfato de amônio a 25% (m/v) em água na câmara fria. *Gel grande 500mL solução por passo COMENTÁRIOS SOBRE O PREPARO DE SOLUÇÕES 1 - A soluçaõ de revelação é composta por Coomassie Blue G-250 a 0,08% (m/v), sulfato de amônio a 8% (m/v), ácido fosfórico 1,6% (m/v - não é v/v!!), metanol a 20% em água. Para 1L de solução, pese 80g de sulfato de amônio em um becker de 1L e adicione 700 ml de água. Dissolva com agitador magnético e filtre a solução com filtro de 0,45um. Transfira para um becker limpo e adicione 11mL de ácido fosfórico, 0,8g de C.Blue G-250 e 200mL de metanol. Dissolva e transfira para uma proveta de 1L e complete com água. Lembre que o ácido fosfórico tem d=1,687g/ml e sua concentração geralmente é de 85%. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W., Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie brilliant blue G-250 and R-250. Electrophoresis 9 (6),

11 COOMASSIE COLOIDAL (G-250)* - "Blue silver" - (Candiano et al., 2004) 1 - Adicionar solução de revelação e deixar sob agitação moderada de 24-72h; 2 - O gel pode ser guardado em caixa bem selada na câmara fria. *Gel grande 500mL solução por passo COMENTÁRIOS SOBRE O PREPARO DE SOLUÇÕES 1 - A soluçaõ de revelação é composta por Coomassie Blue G-250 a 0,12% (m/v), sulfato de amônio a 10% (m/v), ácido fosfórico a 10% (? m/v ou v/v?), metanol a 20% em água. Para 1L de solução, pese 100g de sulfato de amônio em um becker de 1L e adicione 700 ml de água. Dissolva com agitador magnético e filtre a solução com filtro de 0,45um. Transfira para um becker limpo e adicione?50 ou 100? ml de ácido fosfórico e 1,2g de C.Blue G-250. Dissolva, adicione 200mL de metanol, transfira para uma proveta de 1L e complete com água. Lembre que o ácido fosfórico tem d=1,687g/ml e sua concentração geralmente é de 85%. Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G.M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Righetti, P.G., Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 25 (9),

12 COOMASSIE COLOIDAL (R-250)* - (Wang et al., 2007) 1 - Adicionar solução fixadora (ácido acético 10% (v/v), metanol 10%, etanol 40% em água) e agitar moderadamente por 1h; 2 - Desprezar solução anterior e adicionar solução de sensibilização (ácido acético 1% (v/v), sulfato de amônio 10% (m/v) em água). Agitar mod. por 2 h; 3 - Desprezar sol. anterior e adicionar solução de coloração [ácido acético 5% (v/v), etanol 45%, Coomassie R-250 0,125% (m/v)]. Agitar por 8 a 16h; 4 - Desprezar sol. anterior e adicionar sol. de descoloração 01 (ácido acético 5% (v/v), etanol 40% em água). Agitar por 1h, checando se está descorando demais; 5 - Desprezar sol. anterior e adicionar sol. de descoloração 02 (ácido acético 3% (v/v), etanol 30% em água). Agitar até não haver mais background e transferir para ácido acético 5% (v/v) em água. *Gel grande 1000mL solução por passo COMENTÁRIOS SOBRE O PREPARO DE SOLUÇÕES 1 - A solução estoque de Coomassie Blue R-250 é preparada pela dissolução, a 37ºC sob agitação overnight, de 20g de corante em 1 L de etanol 95% (ou absoluto). Deixe a solução esfriar e filtre em papel Whatmann. Armazene à temperatura ambiente. 2 - Para preparar 1L da solução de coloração, adicione 400mL de água seguidos de 50 ml de ácido acético, 450mL de etanol, 62,5mL de sol. estoque de Coomassie R-250 e complete com água até 1L. Misture bem. Wang, X., Li, X., Li, Y., A modified Coomassie Brilliant Blue staining method at nanogram sensitivity compatible with proteomic analysis. Biotechnol Lett 29 (10),

13 IMIDAZOL-ZN* 1- Incubar gel em carbonato de sódio 1 % em água, sob agitação moderada por 5min. 2- Desprezar solução e adicionar solução de imidazol 0,2 M contendo SDS 0,1 % em água e incubar sob agitação moderada por 15 min. 3- Lavar gel por 10 s com água sob agitação moderada. 4- Transferir gel para acetato de zinco 0,2 M em água, sob agitação moderada, por 60 s. O gel ficará branco e opaco neste estágio. 5- Lavar com água (5 x 2 min e 3 x 15 min, pelo menos). 6- Guardar o gel em ácido acético a 1% em água. *Gel grande 500mL solução por passo

14 IMPREGNAÇÃO POR PRATA (Amersham c/ modificação) 1- Fixar gel overnight em etanol (ou metanol) 40 %, ácido acético 10 % em água, sob agitação moderada. 2- Repetir passo anterior por 30 min. 3- Desprezar solução anterior e sensibilizar por 30 min, sob agitação moderada, em etanol 30%, glutaraldeído (25 % p/v) 0,5 %(v/v)**, tiossulfato de sódio 0,2 %(p/v), acetato de sódio anidro 7% (p/v) ou triidratado 12% (p/v) em água. 4- Lavar 3 x 5 min com água Milli-Q ; Mini-géis: 3 x 1 min. 5- Adicionar nitrato de prata 0,25 % (p/v), formaldeído (37 % p/v)** 0,04 % (v/v) por 20min, sob agitação moderada. 6- Lavar 2 x 1 min com água Milli-Q ; Mini-géis: 2 x 20 s. 7- Revelar em carbonato de sódio 2,5 % (p/v), formaldeído (37 % p/v) 0,02 % (v/v), tiossulfato de sódio 0,001 % (p/v) em água, por 2 a 5 min, agitando na mão. 8- Descartar solução anterior e adicionar solução de EDTA-Na2.2H2O 1,5 % (p/v) em água, por 10min, sob agitação moderada. 9- Lavar 3 x 5 min com água. 10- Guardar o gel em ácido acético a 1 % em água. *Gel grande 500 ml solução por passo **Omitir em caso de futura análise por espectrometria de massas OBS. Glutaraldeído e formaldeído devem ser adicionados imediatamente antes do uso.

15 DIGESTÃO TRÍPTICA EM GEL DE POLIACRILAMIDA (COOMASSIE / PRATA) Observações: 1- Neste experimento, é fundamental a LIMPEZA do ambiente e o CUIDADO na manipulação das amostras. A contaminação por queratina é um problema relativamente comum e deve ser evitada. Para tanto, é FUNDAMENTAL o uso de luvas, preferencialmente sem talco e trocadas com freqüência, jalecos de mangas compridas, máscara e touca (para quem tem cabelos compridos). 2- Todos os reagentes devem ser preparados frescos com sais/solventes da melhor qualidade possível. 3- Usar eppendorfs de 500 µl lavados com metanol, água, metanol. Procedimento: 1- Cortar a banda do gel e dividir em pedaços menores (1 mm 2 ). Desprezar qualquer excesso de acrilamida. Preferencialmente, usar bisturis n o 15, de forma a macerar o pedaço de gel dentro do próprio eppendorf de 500 µl. Recomenda-se cortar pelo menos um pedaço de acrilamida de cada gel para servir de controle negativo do experimento. Também é conveniente fazer um controle positivo (BSA do padrão de PM, por exemplo). Se o gel tiver sido corado por impregnação por prata, pule para o passo 3, começando pela adição de acetonitrila. Eventualmente, siga o protocolo descrito na referência 1, para remoção da prata, antes de pular para o passo 3; 2- Descorar os pedaços de gel em solução de acetonitrila 50%/bicarbonato de amônio 25 mm ph 8,0. Fazer 3 x lavagens de 15 min, com 200 µl de cada vez, agitando os pedaços de gel no vortex. Estas lavagens servem para retirar corante e SDS. É FUNDAMENTAL que os géis fiquem completamente transparentes, uma vez que a presença de Coomassie (e SDS) pode interferir com a digestão enzimática. Preferencialmente, deve-se trocar de ponteira entre as diferentes amostras. Eventualmente, esse passo de descoloração pode ter que ser feito overnight para que haja descoloração efetiva; 3- Remover o descorante e desidratar o gel com 200 µl de acetonitrila, por 5 min. Repetir este procedimento 1 x caso os pedaços de gel não fiquem opacos. Remover a acetonitrila e secar completamente os géis no Speed Vac por cerca de 15 minutos; 4- Para géis 2D, pular para o item Para géis 1D, reduzir os pedaços de gel em 100 µl de DTT 65 mm, por 30 min, à 56 C. Remover a solução de DTT; Solução de DTT: 10 mg de DTT/mL de bicarbonato de amônio 100 mm ph 8,0 (0,158g bicarbonato/20 ml)(fw DTT : 154 g/mol)(não titular!) 6- Alquilar com 100 µl de iodoacetamida 200 mm, por 30 min, à temperatura ambiente, no escuro. Remover a solução de iodoacetamida; Solução de iodoacetamida: 37 mg de iodoacetamida/ml de bicarbonato de amônio 100 mm ph 8,0 (0,158g bicarbonato/20 ml)(fw iodoacetamida : 185 g/mol)(não titular!) 7- Lavar os pedaços de gel com 200 µl de bicarbonato de amônio 100 mm, por 10 min. Remover lavado; 8- Desidratar os pedaços de gel com 200 µl de acetonitrila (5 min); 9- Remover a acetonitrila e reidratar o gel com 200 µl de bicarbonato de amônio 100 mm, por 10 min. Remover bicarbonato; 10- Desidratar os pedaços de gel com 200 µl de acetonitrila;

16 11- Remover acetonitrila e adicionar mais uma alíquota de 200 µl de acetonitrila. Remover acetonitrila; 12- Secar géis por 15 min no Speed Vac. 13- Preparar a tripsina (usar preferencialmente tripsina Promega cat. # V511). Dissolver 20 µg em 100 µl de ácido acético 50 mm (solução estoque 200 ng/µl). Diluir a solução estoque 10 x com bicarbonato de amônio 40 mm (concentração final 20 ng/µl). Fazer estas soluções sempre no gelo! 14- Adicionar 15 µl da solução de tripsina diluída de forma a cobrir os pedaços de gel. Manter os pedaços no gelo por 45 min para que a tripsina penetre no gel sem que se inicie a digestão. Remover todo o excesso de tripsina e adicionar 20 µl de bicarbonato de amônio 40 mm. Deixar overnight a 37 C (16-24 h); 15- Sonicar no ultrassom por 10 min, 20 s no vórtex e remover os 20 µl da solução acima para um tubo limpo de 500 µl. Ao gel restante adicionar 30 µl de ácido fórmico 5% / acetonitrila 50%, vórtex por 20 s, 15 min em repouso a T.A., 2 min no ultrassom, 20 s no vórtex. Remover a solução com os peptídeos e juntar aos 20 µl anteriores. Repetir o passo acima, 30 s xg e combinar todos os extratos no mesmo tubo. 16- Concentrar as amostras até cerca de 5 µl. Jamais deixe secar completamente! 17- Guardar peptídeos no freezer para posterior análise por espectrometria de massas. Referências: 1. Gharahdaghi, F., Weinberg, C. R., Meagher, D. A., Imai, B. S. & Mische, S. M. (1999) Mass spectrometric identification of proteins from silver-stained polyacrylamide gel: a method for the removal of silver ions to enhance sensitivity. Electrophoresis 20, Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. e Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels. Analytical Chemistry 68, Apostila do curso de MALDI-TOF MS da Applied Biosystems. 4. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J.V., Mann, M., In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc 1 (6),

17 Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz PROTOCOLO DE DERIVATIZAÇÃO QUÍMICA DO N-TERMINAL COM 4-SULFOFENIL ISOTIOCIANATO (SPITC) 1. Observações: A reação deve ser feita em ph 8,6 (importante!!!). Para isto, deve-se fazer uma pequena modificação no protocolo de digestão tríptica em gel de poliacrilamida (Coomassie / Prata) mostrado na aula prática do curso. Modificação (a partir do passo 15) do protocolo: 15 - Ao término da digestão, resfriar os tubos até alcançarem a temperatura ambiente e centrifugar rapidamente para baixar todo o líquido condensado nas paredes do tubo. Adicionar 15uL de bicarbonato de amônio 50mM ph 8,0. Sonicar por ultrassom por 10 minutos e coletar a solução para posterior reação de derivatização com SPITC. Guardar os tubos com os pedaços de gel para submetê-los ao descrito no passo Concentrar uma alíquota (5-10µL) do material coletado no passo 15 até cerca de 0,5 µl. Jamais deixe secar completamente! 17 - Fazer uma segunda extração com 30 µl de ácido fórmico 5% / acetonitrila 50%, por 30 min. Remover a solução com os peptídeos e guardar em novo tubo Guardar peptídeos que não serão utilizados imediatamente a -20 ºC para posterior análise por espectrometria de massas Ao material obtido no passo 16, adicionar 9 µl da solução de SPITC (10 mg/ml SPITC em NaHCO 3 20mM ph 8,6) Incubar por 1h a 56 ºC Adicionar 1 µl de TFA 5% (v/v) em água para terminar a reação Para posterior análise no MALDI-TOF/TOF precisa-se previamente concentrar e retirar sais das amostras. Isto pode ser feito de duas maneiras: ZipTip C 18 ; Micro-colunas empacotadas in situ com resina POROS R2. Referências 1. Wang D, Kalb SR, Cotter RJ. Rapid Commun. Mass Spectrom. (2004), 18: 96.

18 EMPACOTAMENTO DE MICRO-COLUNAS 1. Solvente A: 0,1 % (v/v) TFA; Solvente B: 5 mg/ml DHB (Ácido 2,5-dihidroxibenzóico) ou 4HCCA (Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico) em Acetontrila 50% / TFA 0,1% (v/v). 1. Bloquear a ponta do GELoader tip com disco de material C 8 para evitar perda da resina mas deixando fluir livremente líquidos através do tip. 2. Pesar quantidade (alguns microgramas) suficiente de resina Poros R2 para preparar uma coluna de cerca de 5 mm de altura. Empacotar a resina com acetonitrila a 100%, aspirando e dispensando líquido, utlizando pipeta automática acoplada ao tip. Aplicar acetonitrila em abundância até a resina ficar bem empacotada. Retirar o excesso de acetonitrila. 3. Equilibrar a coluna com 20 µl de Solvente A. 4. Adicionar a amostra, previamente acidificada. 5. Lavar coluna com 20µL de Solvente A. 6. Eluir, diretamente na placa de análise do MALDI-TOF/TOF, usando 1 µl do Solvente B. Referências 1. Larsen MR, Cordwell SJ, Roepstorff P Proteomics (2002), 2:1277.

19 TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO PRECIPITAÇÃO COM TCA E LAVAGEM COM ACETONA (Ref. 1 e 2) 100 µl de amostra + 28 µl de TCA 50 % (v/v) em água > Vórtex por 10 s > Gelo por 2 h ou overnight > g por 30 min na câmara fria > Remover sobrenadante > 500 µl de acetona 90 % gelada por 15 min > g por 30 min na câmara fria > Remover sobrenadante > Repetir lavagem com acetona 90 % > Deixar o precipitado secar à temperatura ambiente. PRECIPITAÇÃO COM ACETONA (Ref. 1) 100 µl de amostra µl de acetona gelada > Vórtex por 10 s > Gelo overnight > g por 30min na câmara fria > Remover sobrenadante > Deixar o precipitado secar à temperatura ambiente. PRECIPITAÇÃO COM METANOL-CLOROFÓRMIO-ÁGUA (Ref. 3) 100 µl de amostra µl de metanol > Vórtex por 10 s > g por 10 s > 100 µl de clorofórmio > Vórtex por 10 s > g por 10 s > 300 µl de água > Vórtex por 20 s > g por 1min > Descartar fase superior cuidadosamente > 300 µl de metanol > Vórtex por 20 s > g por 2 min > Descartar sobrenadante > Secar o precipitado com fluxo de nitrogênio. PRECIPITAÇÃO COM SULFATO DE AMÔNIO (Ref. 1) 100 µl de amostra + 60 mg de (NH 4 ) 2 SO 4 > Vórtex, suavemente, por 10 min > Gelo por 2 h > g por 30 min na câmara fria > Remover sobrenadante > 500 µl de acetona gelada por 15 min > g por 30 min na câmara fria > Remover sobrenadante > Repetir lavagem com acetona > Deixar o precipitado secar à temperatura ambiente. Referências 1. Jiang, L.; He, L. and Fountoulakis, M. (2004) Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A, 1023: Protocolo de Precipitação de proteínas com ácido tricloroacético do Laboratório de Toxinologia. 3. Wessel, D. and Flügge, U.I. (1984) A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry, 138:

20 Tabela 1 - Massas dos aminoácidos. Monoisotópica Média Alanina (A) Arginina (R) Asparagina (N) Ácido aspártico (D) Cisteína (C) Ácido glutâmico (E) Glutamina (Q) Glicina (G) Histidina (H) Isoleucina (I) Leucina (L) Lisina (K) Metionina (M) Fenilalanina (F) Prolina (P) Serina (S) Treonina (T) Triptofano (W) Tirosina (Y) Valina (V)

21 Tabela 2 Outras massas relevantes. Monoisotópica Média Alquilação Carbamilação Carboximetil cisteína (Cys_CM) Carboxiamidometil cisteína (Cys_CAM) Piridil-etil cisteína (Cys_PE) Propionamida cisteína (Cys_PAM) Metionina sulfóxido (MSO) Homoserina lactona (HSL) H H O H 2 O