Vias de Biossíntese de Antibióticos

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1 Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS Vias de Biossíntese de Antibióticos Fernanda Luiza de Souza Sebastianes Profa. Dra. Aline Aparecida Pizzirani-Kleiner Departamento de Genética Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: Piracicaba - São Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) / 4125 / Fax: (0xx19)

2 Sumário Histórico Mecanismo de ação dos antibióticos Vias de biossíntese de antibióticos Resistência Microbiana Obtenção de novos antibióticos

3 História dos antibióticos Cientistas da segunda metade do século XIX (Tyndal, Lister, Huxley, Duchesne e Vuillemin) já observavam o fenômeno denominado por antibiose, o qual era resultado dos agentes antimicrobianos. Em 1860 Joseph Lister estudou o efeito inibitório de substâncias químicas sobre as bactérias. Fenol Esteriliza instrumentos cirúrgicos taxas de mortalidade associadas àcirurgias Pasteur e Joubert em 1877 reconheceram o potencial clínicos dos produtos microbianos como agentes terapêuticos Bacillus antracis Crescia em urina estéril Morte com a adição de bactérias junto com ele na mesma urina (Greenwood, 1997)

4 História dos antibióticos 1928 Alexander Fleming descobriu a penicilina Saint Mary s Hospital de Londres Colônias de Staphylococcus vizinhas do fungo Penicillium apresentavam-se translúcidas (lise celular). Agente antibacteriano penicilina Alexander Fleming Nobel Medicina 1945 Penicillium chrysogenum Cresceu Penicillium em meio líquido e verificou que uma substância antimicrobiana era secretada no meio. Contaminante inibia o crescimento de Staphylococcus mesmo diluído 800 vezes. (Bentley, 2005 )

5 História dos antibióticos No final da década de 1930, no auge da segunda guerra mundial, o elevado número de pacientes infectados exigia a descoberta de substâncias efetivas para o tratamento de infecções bacterianas. Chain & Florey em 1940 analisaram o efeito antibacteriano da penicilina. Penicilina Primeiro antibiótico usado para o tratamento de infecções em humanos 1941 início do uso clínico da penicilina (estreptococos e pneumococo). 13 anos da descoberta ao uso prático. (Gomez & Lopez, 2006)

6 História dos antibióticos Em 1889 o nome antibiótico foi criado por Vuillemim e, posteriormente, em 1942 foi redefinido por Waksman. Antibiótico: é um composto químico derivado de microrganismos (bactérias, fungos) que têm a capacidade de inibir o crescimento, inclusive chegando a destruir outros microrganismos em soluções diluídas antibacteriano, antifúngico e antitumoral Selman Abraham Waksman e colaboradores isolaram a estreptomicina de uma cepa Streptomyces, a primeira droga efetiva contra o bacilo da tuberculose. Prêmio Nobel de Medicina (1952) (Greenwood, 1997)

7 Microrganismos Microrganismos apresentam dois tipos de metabolismo: Primário: ativo durante todo o ciclo de vida Secundário: rotas biossintéticas longas e complexas derivadas do metabolismo primário Produção de Antibiótico Os produtos naturais isolados de actinomicetos e fungos têm sido a principal fonte da maioria dos antibióticos comercializados. Seminário Pós Biossíntese Graduação de antibióticos Vias de em Biossíntese microrganismos de Antibióticos

8 Microrganismos produtores Mais de 8000 antibióticos foram identificados 200 novos antibióticos a cada ano Atualmente existem 90 antibióticos utilizados na prática clínica. Antibióticos são produzidos principalmente por bactérias ou fungos: Antibióticos produzidos por fungos (principalmente pelos gêneros Penicillium e Cephalosporium) Ex.: penicilina, cefalosporina, griseofulvina. Gênero Streptomyces produz 70% dos antibióticos do mercado (Peláez, 2006)

9 História dos antibióticos Nome Penicilina Tirotricina Griseofulvina Estreptomicina Bacitracina Cloranfenicol Polimixina Framicetina Clortetraciclina Cefalosporina C, N e P Neomicina Oxitetraciclina Nistatina Eritromicina Espiramicina Vancomicina Kanamicina Lincomicina Gentamicina Tobramicina (Greenwood, 1997) Data da descoberta Microrganismo Penicillium notatum 1939 Bacillus brevis 1939 / 1945 Penicilium griseofulvum 1944 Streptomyces griseus 1945 Bacillus lincheniformis 1947 Streptomyces venezuelae 1947 Bacillus polymyxa Streptomyces lavendulae 1948 Streptomyces aureofaciens 1948 Cephalosporium sp 1949 Streptomyces fradiae 1950 Streptomyces rimosus 1950 Streptomyces noursei 1952 Streptomyces erithreus 1954 Streptomyces ambofaciens 1956 Streptomyces orientalis 1957 Streptomyces kanamyceticus 1962 Streptomyces lincolnensis 1963 Micromonospora purpurea 1968 Streptomyces tenebraeus

10 Produção de antibióticos Esquema básico de um processo fermentativo para produção comercial de um antibiótico: 1. Preparação do inóculo; 2. Inoculação em meio de fermentação; 3. Incubação em condições de fermentação controladas e aeração forçada com ar esterilizado; 4. Remoção do micélio por centrifugação e/ou filtração; 5. Extração e purificação do antibiótico.

11 Pesquisa Porcentagem de empresas envolvidas com a pesquisa de metabólitos de interesse industrial no Brasil

12 Produção de antibióticos A cada ano são produzidos toneladas de antibióticos, o que corresponde a US$ 5 bilhões em vendas destinadas à: medicina agricultura terapêutica animal Seminário Pós Biossíntese Graduação de antibióticos Vias de em Biossíntese microrganismos de Antibióticos

13 Mecanismo de ação dos antibióticos Inibidores da síntese da parede celular microbiana Interferem na síntese de nucleotídeos Ex.: Penicilina, Cefalosporina, Vancomicina Inibição da síntese de proteínas Ex.: Sulfonamidas Trimetropina Interferem com a membrana celular bacteriana Ex.: Eritromicina Rifampicina Estreptomicina Ex.: Polimixina B Colistina

14 Vias de biossíntese de antibióticos Peptídeos não ribossomais e policetídeos são as principais classes de antibióticos que apresentam ampla diversidade estrutural e funcional. Eles são sintetizados respectivamente por enzimas multifuncionais chamadas de peptídeo sintetase não ribossomal (NRPS) e policetídeo sintetase (PKS). Estas enzimas apresentam similaridade na estrutura modular dos domínios catalíticos e no mecanismo de montagem linear. Peptídeos não ribossomais e policetídeos não são sintetizados com a participação direta dos ribossomos. (Walsh, 2004)

15 Vias de biossíntese de antibióticos Enzima peptídeo sintetase não ribossomal (NRPS) As NRPSs são constituídas por módulos que são responsáveis pela incorporação de um resíduo na cadeia de peptídeo nascente. Cada módulo é responsável por: ativação, adenilação, tioesterificação, condensação e modificação de um substrato (aminoácido) específico. Ex.: Penicilina, vancomicina, ciclosporina. (Challis & Naismith, 2004)

16 Vias de biossíntese de antibióticos Os domínios apresentam sítios catalíticos distintos com motivos estruturais conservados importantes para a atividade catalítica. Três domínios são necessários na estrutura de um módulo como: 1. Domínio A (adenilação) - seleciona e ativa os aminoácidos (seqüência primária); 2. Domínio PCP (proteína carreador peptidil) - liga o resíduo de serina do grupo tiol do cofator com o aminoácido ativado 3. Domínio C (condensação) - catalisa a formação das ligações peptídicas (Challis & Naismith, 2004)

17 Vias de biossíntese de antibióticos Enzima PKS (policetídeo sintase) Enzimas PKS atuam sobre o substrato acil CoA (ácidos graxos) para sintetizar os policetídeos; Policetídeos são cadeias de ácidos graxos que apresentam atividade farmacológica. Ex.: antibióticos, antitumorais, fitoalexinas; São organizados também em unidades funcionais (módulos); Cada módulo de PKS catalisa as diferentes etapas das reações químicas para a formação da estrutura do antibiótico. (Lal et al., 2000)

18 Vias de biossíntese de antibióticos A biossíntese de policetídeo: Ex.: Eritromicina, tetraciclina. PKS I Eritromicina A Modificações Pós-PKS 6-Deoxieritronolide B (Lal et al., 2000)

19 A biossíntese de policetídeo: Vias de biossíntese de antibióticos Um módulo de PKS também pode ser subdividido em domínios Os quatros domínios essenciais são: Domínio AT a) Domínio AT (acetiltransferase): ativação de ácidos graxos; b) Domínio ACP (proteína carreadora acil) - transporta os substratos participando da elongação; c) Domínio KS (cetosintase) - catalisa a reação de elongação; Domínio KS Domínio Te Reconhecimento do substrato e transferência para domínio ACP Formação da ligação cetide (ligação C-C) Liberação do produto d) Domínio Te (tioesterase) - liberação do produto (policetídeo).

20 Vias de biossíntese de antibióticos As PKSs são classificadas em tipo I, II, III PKS I - uma única cadeia polipeptídica multifuncional apresenta todas as atividades enzimáticas necessárias para um ciclo de elongação e processamento; PKS II - a atividade enzimática para a elongação e processamento da cadeia de policetídeos estão presentes em polipeptídeos separados; PKS III cadeia é elongada e processada em um único sítio ativo multifuncional. (Castoe et al., 2007)

21 Vias de biossíntese de antibióticos Fitoalexinas são compostos antimicrobianos que são sintetizados durante a infecção no tecido lesado via econômica; Estes compostos são sintetizados pela via PKS III; A síntese de fitoalexina é induzida por microrganismos, radiação ultravioleta, compostos químicos - sais de metais pesados, componentes da parede celular de fungos quitina; Os agentes que podem induzir a síntese de fitalexinas são chamados de elicitores. (Jeandet et al., 2002)

22 Vias de biossíntese de antibióticos Os policetídeos são sintetizados por bactérias, fungos, animais e plantas; Em plantas os policetídeos apresentam diversas funções: pigmentação de flores, resposta a exposição de luz UV, defesa contra patógeno (fitoalexinas); PKS específicos de plantas são chalcona sintase (CHS) e 2- pirona sintase (2-PS); Estas enzimas apresentam 74% de seqüência idêntica de aminoácidos. Entretanto, elas diferem no substrato selecionado e no número de reações de condensação. (Jez et al., 2000)

23 Vias de biossíntese de antibióticos Análise da estrutura tridimensional das PKSs de plantas mostraram que a cavidade de iniciação e elongação da enzima 2-pirona sintase é menor do que a da chalcona sintase A variação de aminoácidos que compõem a cavidade do sítio ativo altera a preferência ao substrato e o comprimento da cadeia de policetídeo (Jez et al., 2000)

24 Vias de biossíntese de antibióticos Para demonstrar este princípio o sítio ativo da CHS foi modificada para parecer-se com a 2-PS por mutagênese sítio dirigida; Identificação dos produtos da reação confirmaram que a modificação na CHS alterou a preferência do substrato de p-coumaroyl-coa por acetyl- CoA e o produto formado foi um tricetídeo em vez de tetracetídeo; A manipulação do volume do sítio ativo é uma estratégia para aumentar a diversidade molecular de policetídeos. (Jez et al., 2000)

25 Vias de biossíntese de antibióticos Enzimas pós PKSs Enzimas pós PKSs alteram a estrutura de policetídeos sendo importantes para a atividade biológica dos mesmos; Oxidação, metilação, alquilação e glicosilação; A função das enzimas pós PKSs é testada por meio da inativação de genes, seguido por caracterização dos metabólitos resultantes; É possível avaliar a seqüência de modificações até chegar ao composto bioativo final. (Weissman & Leadlay, 2005)

26 Vias de biossíntese de antibióticos Enzimas pós PKSs Outra técnica alternativa é expressar um gene pós-pks em hospedeiro heterólogo na presença de uma cadeia de policetídeo; Glicosiltransferases (GTs) têm sido estudadas para avaliar a tolerância delas a outros açúcares alternativos; Estes experimentos são realizados em hospedeiros heterólogos usando a combinação de GTs nativas e exógenas, genes da via PKSs e de acúcares. (Weissman & Leadlay, 2005)

27 Vias de biossíntese de antibióticos Ex.: Genes que codificam GTs e o açúcar desosamina foram coexpressos em uma biblioteca gênica codificando diferentes macrolactonas. Narbomicina (Weissman & Leadlay, 2005)

28 Vias de biossíntese de antibióticos Algumas pós PKSs são específicas a um determinado substrato, enquanto que outras são mais flexíveis permitindo a produção de novos compostos bioativos; A flexibilidade destas enzimas pode ser conseguida com mutagênese sítio dirigida ou evolução dirigida. (Weissman & Leadlay, 2005)

29 Evolução A via de biossíntese de ácidos graxos (FAS) está presente em todos os organismos; FAS PKS A via de FAS e PKS usam o mesmo núcleo de atividade enzimática, portanto, acredita-se que exista uma conexão evolutiva entre estas vias. (Kodama et al., 2005)

30 Evolução Para provar essa hipótese, foram estudadas as seqüências do domínio KS presentes em classes de FASs e PKSs encontrados em bactérias, fungos, animais e vegetais; A árvore filogenética derivada destas seqüências reflete um processo evolutivo longo e compartilhado destas vias (PKS e FAS). (Kodama et al., 2005)

31 Evolução Proteínas KS de plastídios e mitocôndrias estão localizados próximo das bactérias, consistente com a origem procariótica destas organelas. (Kodama et al., 2005)

32 Evolução FAS I micobacteriana agrupou com FAS I de fungos -arquitetura muito similar destas duas enzimas; PKSI bacteriano divide um ancestral comum com FAS I animal e PKS I de fungos Eventos evolucionários independentes podem ter levado ao desenvolvimento do sistema de FAS em fungos e animais. (Kodama et al., 2005)

33 Evolução Reconstruções da árvore indicaram que o PKSI bacteriano apresenta um papel central, sendo que ele pode ser derivado de FAS bacterianas. (Kodama et al., 2005)

34 Evolução Seqüências dos domínios KSs revelaram que duplicações múltiplas de genes, perda de genes, e transferência horizontal de genes tem contribuído para a evolução de PKS em bactérias (Kodama et al., 2005)

35 Vias de biossíntese de antibióticos A biossíntese de PKS-NRPS: Existem também antibióticos que são sintetizados por um sistema híbrido NRPS-PKS. A Leinamicina é um antibiótico híbrido peptídeo-policetídeo. Caracterização bioquímica dos genes da biossíntese da leinamicina em Streptomyces atroolivaceus S-140 revelou que este antibiótico (antitumoral) é sintetizado por um sistema híbrido NRPS-PKS (2-NRPS e 6-PKS). Módulos Enzimas NRPS-PKS (Tang et al., 2006)

36 Vias de biossíntese de antibióticos Peptídeos antimicrobianos são sintetizados com a participação direta de ribossomos em animais, plantas e microrganismos; A maioria destes peptídeos são catiônicos e lipofílicos provocando a morte de bactérias através do rompimento na membrana celular; A carga positiva destes peptídeos facilita a interação com a carga negativa da membrana bacteriana que contém fosfolipídios. O caráter lipofílico permite a permeabilização na membrana bacteriana; Nos animais, os peptídeos antimicrobianos são a primeira linha de defesa do sistema imunológico. (Peláez, 2006)

37 Vias de biossíntese de antibióticos Uma ampla variedade de peptídeos antimicrobianos é produzida por bactérias como bacteriocinas; Os peptídeos antimicrobianos sintetizados nos ribossomos das bactérias são conhecidos como bacteriocinas; Entretanto, os antibióticos não estão incluídos nesse grupo, pois são sintetizados por meio do metabolismo secundário, ou seja, sem o envolvimento direto dos ribossomos. (Peláez, 2006)

38 Genes da biossíntese de antibióticos em procariotos Os genes podem estar organizados em operon (gramicidina S, surfactina e tirocidina). Os genes responsáveis pela biossíntese de antibióticos encontramse agrupados em clusters contíguos. Cluster do ácido clavulâmico em Streptomyces clavuligerus Nestes agrupamentos gênicos encontram-se também genes reguladores e de resistência ao antibiótico.

39 Genes da biossíntese de antibióticos em fungos filamentosos Genes de fungos filamentosos que atuam na biossíntese de antibióticos estão organizados em clusters Genes da biossíntese de antibióticos organizados em clusters em Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans e Acremonium chrysogenum. (Gutiérrez et al., 1999)

40 Genes da biossíntese de antibióticos em fungos filamentosos Genes agrupados em um único cromossomo ou em cromossomos diferentes Genes da biossíntese de penicilina agrupados em um único cromossomo cluster em Penicillium chrysogenum e Aspergillus nidulans Genes da biossíntese de Cefalosporina em clusters diferentes no fungo Acremonium chrysogenum (Gutiérrez et al., 1999)

41 Genes da biossíntese de antibióticos em fungos filamentosos Organização dos genes em cluster Facilita a expressão coordenada de genes da biossíntese de antibióticos, a identificação e o sequenciamento de novos clusters de PKSs (Weissman & Leadlay, 2005) Seminário Pós Biossíntese Graduação de antibióticos Vias de em Biossíntese microrganismos de Antibióticos

42 Resistência microbiana Por meio do uso abusivo e indiscriminado dos antibióticos ocorreu a seleção de microrganismos resistentes as drogas. Estratégias gerais de resistência às drogas: Os patógenos podem: Produzir uma enzima que destrói a droga; Genes de resistência são transportados em plasmídeos e são encontrados em transposons Alterar o alvo molecular da droga; Mutação cromossômica Diminuição do acúmulo do antibiótico na bactéria. Genes de resistência em plasmídeos (Rang et al., 1997)

43 Resistência microbiana A resistência a antibióticos nos microrganismos dissemina-se em três níveis: Transferência de bactérias entre pessoas; Transferência de genes de resistência entre bactérias (geralmente em plasmídios); Transferência de genes de resistência entre elementos genéticos no interior das bactérias, por meio de transposons. (Rang et al., 1997)

44 Novos antibióticos As pesquisas que visam ao desenvolvimento de novos antibióticos são prioritárias devido a vários fatores: a) Aparecimento de novos patógenos e a seleção de resistentes; b) Aquisição de múltiplos níveis de resistência pelas bactérias; c) Variados efeitos colaterais indesejáveis dos antibióticos existentes, que devem ser eliminados; d) Escassez de tratamento efetivo para múltiplas doenças tropicais como malária, doença de Chagas, leishmaniose e diversos tipos de diarréias; e) Necessidade de estudo e identificação de novos antibióticos na área de agricultura, que poderão substituir os produtos agroquímicos, os quais apresentam alta toxicidade, custo e agressividade ao meio ambiente. (Strobel et al., 2004)

45 Microrganismos endofíticos e alguns de seus produtos Endófito Composto químico Referência Acremonium sp. Leucinostatina A Strobel & Hess (1999) Conoplea elegantula Isocumarinas Findlay et al. (1995) C. cf. quercina Criptocina Li et al. (2000) Cryptoriopsis cf. quercina Criptocandina Strobel (2003) Streptomyces sp. Kakadumicina Castillo et al. (2003) Streptomyces sp. Munumbicina A, B, C e D Strobel (2003) Streptomyces sp. Metilalbonoursina Strobel (2003)

46 Novas Aplicações Aspergillus fumigatus Endófito Cynodon dactyron Produção de novos compostos bioativos Asperfumóide, asperfumina Separados por CLAE e identificados por EM Atividade contra 3 patógenos C. albicans, Tricophyton rubrum e A. niger (Liu et al., 2004)

47 Novos antibióticos Entretanto, os novos antibióticos podem apresentar alta toxicidade e propriedades farmacocinéticas indesejáveis como baixa absorção por via oral e instabilidade da droga. Portanto, alguns pesquisadores se dirigem a tecnologias como a biossíntese combinatória e produção de antibióticos híbridos para conseguir novos compostos bioativos. Seminário Pós Graduação Biossíntese Vias de antibióticos de Biossíntese em microrganismos de Antibióticos (Rodriguez & McDaniel, 2001)

48 Antibióticos híbridos O princípio da produção de antibióticos híbridos é baseado na clonagem de genes heterólogos da biossíntese de antibióticos, em uma cepa que produz um composto similar. São clonados genes que codificam enzimas utilizadas em reações estruturais de modificação como metiltransferases, hidroxilases, redutases, glicosiltransferases e oxidases. (Hutchinson, 1997)

49 Novos antibióticos Produção de 11-hidroxiaclacinomicina A pela expressão do gene dnrf de Streptomyces peucetius (produtor de aclacinomicina). As setas indicam o sítio de ação de DnrF; o asterisco indica o novo grupo hidroxila. (Salas & Mendez, 1998)

50 Biossíntese combinatória O princípio da produção de biossíntese combinatória é baseado na clonagem ou mistura de núcleos de enzimas biossintéticas produzindo novos núcleos moleculares. Os experimentos com esta PKSs e NRPS geralmente envolvem a deleção, a substituição ou a adição de módulos, ou a criação de módulos híbridos de diferentes PKS-NRPS. Assim, novos metabólitos podem ser gerados a partir da formação de proteínas com novas propriedades enzimáticas. (Hutchinson, 1997)

51 Biossíntese combinatória Biossíntese combinatória com sintases aromáticas policetônicas. A) Combinando o PKS da actinorodina (act min) e a aromatase/ciclase (ARO/CYC) da tetracenomicina (tcm). B) Combinando o PKS da tetracenomicina, act KR e griseusin (gris) ARO/CYC. Estas combinações resultaram em novas moléculas.

52 Biossíntese combinatória Rifampicina B: não é ativa via oral Rifampicina: ativa via oral Geldanamicina: antitumoral tóxico 17-DMAG: menos tóxico

53 Biossíntese combinatória A biossíntese combinatória compreende a manipulação biossintética que tenta acelerar o processo de evolução; A evolução é dirigida por mutação, recombinação e seleção. A biossíntese combinatória acelera o processo de mutação e recombinação entre os genes presentes em diferentes espécies; A seleção ocorre primeiro com a escolha de módulos e por fim são escolhidas as moléculas ativas farmacologicamente.

54 Novos antibióticos Os requerimentos para a obtenção de antibióticos híbridos têm sido analisados por Hutchinson (1997) e Salas & Mendes (1998): Escolha do organismo produtor do antibiótico; Conhecimento químico e bioquímico da via biossintética; Conhecimento genético de síntese do antibiótico; Determinação do novo antibiótico produzido por um microrganismo híbrido.

55 Novos antibióticos Descoberta de novos genes da via de biossíntese de antibióticos Sequenciamento do genoma microbiano permite a identificação de todos os clusters de PKSs e a rede regulatória. Ex.: Streptomyces coelicolor e Streptomyces avermitilis; Rastreamento de uma biblioteca de cosmídeo de uma determinada bactéria para os genes de PKSs modulares; Metagenômica: biblioteca de DNA obtida de amostras do ambiente. (Weissman & Leadlay, 2005)

56 Indústria Farmacêutica Fases de P & D aquisição das amostras extração testes iniciais isolamento e caracterização testes in vitro estrutura testes pré-clínicos * testes clínicos* * alto investimento Ten Kate & Laird,1999

57 Conclusão Os produtos naturais apresentam uma grande fatia dos produtos que são utilizados na medicina e agricultura. Atualmente têm sido foco de atenção os trabalhos com microrganismos produtores de compostos bioativos, os quais apresentam um grande potencial para a descoberta de novos metabólitos secundários - antibióticos. O desenvolvimento de técnicas para a descoberta de novas biomoléculas, através de biossíntese combinatória e antibióticos híbridos, contribuiu para melhorar efeitos farmacocinéticos como absorção e ação da droga, e ainda diminuiu possíveis efeitos colaterais.

58 Referências Ayuso-Sacido A, Genilloud O (2004) New PCR primers for the screening of NRPS and PKS systems in actinomycetes: detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups. Microbial Ecology 49: Amnuaykanjanasin A, Punia J, Paungmoung P, Rungroid A, Tachaleat A, Punkpatanaguichot S, Cheedihanarak S, Tanticharoen M (2005) Diversity of type I polyketide synthase genes in the wood-decay fungus Xylaria sp. BCC1067. FEMS Microbiology Letters Baltz RH (1998) Genetic manipulation of antibiotic producing Streptomyces. Trends in Microbiology 6: Bentley R (2005) The development of penicillin. Biology and Medicine 48: Brown K (2004) Penicillin Man: Alexander Fleming and the Antibiotic revolution. Journal of antimicrobial chemotherapy 17: Challis GL, Naismith JH (2004) Structural aspects of non-ribosomal peptide biosynthesis. Current Opinion in structural biology 14: Cohen FL, Tarsky D (1997) Microbial resistance to drug therapy: a review. State of the science 25: Floss, HG (2006) Combinatorial biosyntesis Potential and problems. Journal of Biotechnology 124: Hutchinson CR (1997) Combinatorial Biosynthesis for new drug discovery. Current Opinion in Microbiology 1: Katz L, McDaniel R (1999) Novel macrolides through genetic engineering. Kosan Bioscience 19: Krechel A, Faupel A, Hallmann J, Ulrich A, Berg G (2002) Potato-associated bacteria and their antagonistic potential towards plant-pathogenic fungi and the plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood. Canadian Journal Microbiology 48: Martin JF (1998) New aspects of genes and enzymes for β-lactam antibiotic biosynthesis. Apply Microbiol Biotechnology 50:1-15. Owen NL, Hundley N (2004) Endophytes the chemical synthesizer inside plants. Science Progress 87: Padilla, G (2002) Manipulação genética e molecular de actinomicetos produtores de antibióticos. Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, pp Papagianni, M (2003) Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnology Advances 21: Peláez F (2006) The historical delivery of antibiotic from microbial natural products can history repeat? Biochemical Pharmacology 71: Rodriguez E, McDaniel, R (2001) Combinatorial biosynthesis of antimicrobials and other natural products. Current Opinion in Microbiology 4: Salas JA, Mendez C (1998) Genetic manipulation of antitumor agent biosynthesis to produce novel drugs. Trends in Biotechnology 16: Schwarzer D, Mariel MA (2001) Multimodular biocatalysts for natural product assembly. Naturwissenchaften 88: Strobel G, Daisy B (2003) Bioprospecting for Microbial Endophytes and their natural productis. Microbiology and Molecular Biology Review 67: Sessitsch A, Reiter B, Berg G (2004) Endophytic bacterial communities of field-grown potato plants and their plant-growth-promoting and antagonistic abilities. Canadian Journal Microbiology 50: Walsh CT (2004) Polyketide and Nonribosomal peptide antibiotics: modularity and versatility. Science 303: Yoon YJ, Becu BJ, Kim BS, Kang HY, ReynoldsKA, Sherman DH (2002) Generation of Multiple bioactive macrolides by hybrid modular polyketide syntheses in Streptomyces venezuelae. Chemistry & Biology 9: Zhang HW, Song YC, Tan RX (2006) Biology and chemistry of endophytes. Natural Product Reports 23:

59 Fim Obrigada!