Anotação de Genomas e Metabolismo Secundário
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1 Anotação de Genomas e Metabolismo Secundário Danillo Oliveira de Alvarenga Departamento de Tecnologia Universidade Estadual Paulista Jaboticabal-SP
2 Metabolismo Reações químicas que ocorrem em organismos vivos anabolismo: síntese de biomoléculas catabolismo: quebra de biomoléculas Vias metabólicas série de reações em cadeia substrato(s) que sofre(m) modifcações enzimas que promovem modifcações
3 Metabolismo Primário Metabolismo fundamental essencial para o organismo função fsiológica moléculas estruturais ou regulatórias
4 Metabólitos Primários Biomoléculas mais abundantes nucleotídeos e ácidos nucleicos aminoácidos e proteínas carboidratos lipídeos outras Encontrados em todos os organismos
5 Metabolismo Secundário Metabolismo especializado não é essencial para o organismo função ecológica moléculas bioativas
6 Metabólitos Secundários Estruturas mais simples alcaloides: cafeína, nicotina terpenoides: limoneno, mentol, caroteno Estruturas mais complexas peptídeos ribossômicos modifcados pós-traducionalmente: bacteriocinas peptídeos não ribossômicos: gramicidina, ciclosporina policetídeos: afatoxina, antramicina Maior diversidade em bactérias, fungos e plantas
7 Alcaloides Derivados de moléculas nitrogenadas aminoácidos bases nitrogenadas outras ciclopamina nicotina cafeína
8 Terpenoides Derivados de isopreno hemiterpenos monoterpenos sesquiterpenos isopreno mentol diterpenos beta-caroteno geosmina
9 Peptídeos Ribossômicos Modifcados Precursor ribossômico um ou mais peptídeos microviridina Enzimas modifcadoras pós-tradução ciclização desidratação alteração da cadeia lateral
10 Peptídeos Não Ribossômicos Peptídeo sintetases não ribossômicas (NRPS) gastam ATP aminoácidos proteinogênicos aminoácidos não proteinogênicos Domínios mínimos adenilação condensação carreador de peptidil Domínios complementares metiltransferase cetorredutase epimerase gramicidina
11 Policetídeos Policetídeo sintases não usam ATP ácidos carboxilícos Domínios mínimos cetossintase aciltransferase carreador de acila doxiciclina Domínios complementares cetorredutase desidratase enoil redutase afatoxina
12 Produtos Naturais Molécula sintetizada por um organismo vivo substância encontrada na natureza pode ser obtida por síntese química Bioprospecção processos industriais medicamentos cosméticos recuperação ecológica
13 Integração de Muitas Disciplinas QUÍMICA ORGÂNICA QUÍMICA BIOQUÍMICA ANALÍTICA BIOLOGIA PRODUTOS MOLECULAR NATURAIS FARMACOLOGIA ECOLOGIA GENÔMICA BIOINFORMÁTICA
14 Outros Interesses Ecologia Bioquímica interações metabolismo completo ecofsiologia evolução de vias ecotoxicologia comunicação química Biossegurança Genômica toxicologia informação bioterrorismo caracterização
15 Vias Metabólicas Codifcadas no Genoma Operons genes controlados pela mesma região promotora RNA mensageiro policistrônico em procariotos Agrupamentos gênicos genes funcionalmente relacionados em proximidade envolvidos no mesmo processo interação entre agrupamentos Conservação de agrupamentos pressão evolutiva transferência vertical ou horizontal
16 Motivação de Projetos de Genômica
17 Penicilina Alexander Fleming (1928) descoberta e isolamento Microbiologia Staphylococcus sp. Penicillium notatum halo de inibição Nobel de Medicina (1945)
18 Penicilina Dorothy Hodgkin (1945) confrmação da estrutura Bioquímica cristalografa de raios-x contráriou algumas hipóteses insulina, vitamina B12 Nobel de Química (1964)
19 Penicilina Bruno Díez & Juan Martín (1990) descrição do agrupamento gênico Biologia Molecular ligação a cosmídeo clonagem em E. coli sequenciamento expressão heteróloga
20 Penicilina O HO NH2 + O + OH ácido α-aminoadípico cisteína valina ACV sintetase δ (L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina isopenicilina N sintase 2 isopenicilina N isopenicilina N N-aciltransferase penicilina G
21 Penicilina pcbab pcbc pende peptídeo sintetase não ribossômica oxidorredutase aciltransferase pcbab: δ (L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina sintetase pcbc: isopenicilina N sintase pende: isopenicilina N N-aciltransferase
22 Actinobactérias Bactérias gram-positivas de alto GC metabólitos secundários geosmina Modos de vida livre simbiose Distribuição solos rizosfera ambientes marinhos ambientes áridos
23 Metabólitos Secundários Actinobacterianos Metabólitos secundários 42% dos conhecidos Principal fonte de antibióticos 45-55% dos conhecidos Streptomyces spp. Bioatividade antibiótica antitumoral imunomodulatória
24 Genomas Actinobacterianos Genômica 17 anos depois do primeiro genoma genomas actinobacterianos 800 completos Streptomyces spp. 985 genomas 78 completos
25 Bioprospecção Tradicional Processo praticamente aleatório Limites para descoberta isolamento alvos específcos cultivo e fermentação ensaios pré-determinados geração de extrato bruto atividades conhecidas testes de bioatividade expressão e regulação caracterização química alta concentração Bachmann et al,, 2014
26 Mineração Genômica Descoberta de metabolitos secundários a partir de genomas detecção de genes e agrupamentos predição e caracterização de candidatos orientação de análises químicas posteriores
27 Bioprospecção Baseada em Genômica Processo direcionado Função biológica isolamento opcional papel fsiológico caracterização genômica papel em interações busca in silico expressão homóloga/heteróloga Streptomyces coelicolor A3(2) caracterização química mais que o esperado Bentley et al. (2000) Bachmann et al,, 2014
28 Outras Vantagens Evolução herança variação Monitoramento detecção controle Síntese química clonagem
29 Indo na Direção Oposta Biossíntese desconhecida para muitas moléculas Das moléculas para os genes hipóteses biossintéticas a partir da estrutura genética da biossíntese Biologia da molécula evolução distribuição regulação
30 Limitações da Genômica Grande número de agrupamentos órfãos sequências desconhecidas em bancos de dados biossíntese desconhecida moléculas desconhecidas Bancos de dados precisam ser aprimorados mais dados de alta qualidade melhor anotação e curadoria Espécimes cultivados linhagens isoladas axenicamente
31 Conhecimento Limitado para Vários Grupos Bancos de dados parciais Quadro incompleto viés taxonômico alta sub-representação viés ecológico maior grau de homogeneidade viés geográfco baixa diversidade metabólica
32 Metagenômica Genômica um organismo linhagem cultivada ambiente estranho mineração com expressão homóloga ou heteróloga Metagenômica vários organismos não cultivados ou em cocultivo genômica ambiental / genômica de comunidades mineração com expressão heteróloga
33 Metagenômica Caracterização e comparação de comunidades perfl taxonômico perfl funcional Acessar organismos inacessíveis por métodos tradicionais micro-organismos atualmente não cultiváveis 99 % de toda a diversidade bacteriana enorme número de genes desconhecidos enorme número de vias e metabólitos desconhecidos
34 Metagenômica Hug et al., 2016
35 Metagenômica Parks et al., 2017
36 Encontrando Novos Metabólitos Secundários Alvo domínio/reino/flo espécies-tipo linhagens consagradas ambientes e regiões subexplorados táxons subexplorados e/ou novos tamanho do genoma Método tradicional ou pós-genômico isolados ou amostras mistas equipe interdisciplinar
37 Anotação Identifcação de características biológicas regiões codifcantes e não codifcantes prováveis produtos regiões de repetição Métodos automático manual Comparações entre sequências referências conhecidas algoritmos de predição
38 Anotação
39 Anotação Gene região que codifca proteína ou RNA gene/rrna/trna intron/exon pseudo Sequência codifcante coding sequence (CDS) éxons em eucariotos Quadro aberto de leitura open reading frame (ORF) ATG TAA/TAG/TGA
40 Avanço nas ferramentas bioinformáticas Detecção de metabólitos secundários bancos de dados em expansão mais algoritmos Predição de agrupamentos
41 BLAST
42 BLAST Alinhamentos locais encontra regiões com similaridade signifcativa Qualquer banco de dados que quiser NCBI GenBank/WGS banco local BLAST contra referências de produtos naturais agrupamentos de metabólitos já conhecidos inspecionar predições automáticas
43 RAST
44 RAST Anotação genômica automática subsistemas SEED: função em um processo ou estrutura biológica Predições funcionais possibilidades metabólicas do organismo Curadoria melhor para micro-organismos populares pouca informação sobre metabólitos secundários
45 RAST
46 RAST
47 KEGG
48 KEGG
49 NaPDoS
50 antismash
51 antismash Agrupamentos gênicos de metabólitos secundários banco de dados curado mais de 40 tipos detectados Predição algorítmica ou comparativa agrupamentos similares a sequências conhecidas agrupamentos hipotéticos Alguns agrupamentos não são preditos nenhum modelo implementado
52 MIBiG
53 MIBiG Anotações padronizadas agrupamentos gênicos de metabólitos secundários produtos desses agrupamentos Vias conhecidas genética bioquímica Diversos organismos bactérias fungos plantas
54 MIBiG
55 Artemis
56 Artemis Navegador de anotações genômicas visualizar e adicionar informações a arquivos GenBank/EMBL rodar BLAST sobre sequências codifcantes Curadoria manual inspecionar predições automáticas predizer agrupamentos gênicos
57 Prática
58 I. Baixando um genoma 1) Abra a página do NCBI Genome em
59 I. Baixando um genoma 2) Visualize os genomas disponíveis por organismo.
60 I. Baixando um genoma 3) Navegue pelas opções e escolha um genoma.
61 I. Baixando um genoma
62 I. Baixando um genoma 4) Visualize o relatório de montagem e anotação dos genomas do táxon.
63 I. Baixando um genoma 5) Escolha o genoma de uma linhagem do táxon.
64 I. Baixando um genoma 6) Baixe o arquivo GenBank com o genoma-alvo anotado.
65 I. Baixando um genoma 7) Descomprima o genoma baixado.
66 I. Baixando um genoma 8) Renomeie o arquivo com a extensão.gb ou.gbk.
67 I. Baixando um genoma
68 II. Predizendo agrupamentos gênicos 1) Abra a página do antismash em
69 II. Predizendo agrupamentos gênicos 2) Indique o tipo de organismo a ser analisado.
70 II. Predizendo agrupamentos gênicos 3) Entre o endereço para envio dos resultados.
71 II. Predizendo agrupamentos gênicos 4) Clique na opção de enviar arquivo.
72 II. Predizendo agrupamentos gênicos 5) Busque pelo arquivo do genoma no seu computador.
73 II. Predizendo agrupamentos gênicos 6) Submeta o arquivo à análise e espere pelos resultados.
74 II. Predizendo agrupamentos gênicos 7) Vá para e encontre os resultados para a análise do genoma da cianobactéria Anabaena sp. 90.
75 II. Predizendo agrupamentos gênicos 8) Verifque os resultados e diferencie agrupamentos com produtos potencialmente conhecidos e agrupamentos órfãos.
76 II. Predizendo agrupamentos gênicos 9) Baixe os arquivos GenBank para o agrupamento de interesse.
77 III. Analisando agrupamentos gênicos 1) Abra o Artemis.
78 III. Analisando agrupamentos gênicos 2) Selecione a tabela de código genético para bactérias e cloroplastos.
79 III. Analisando agrupamentos gênicos 3) Abra o arquivo GenBank baixado.
80 III. Analisando agrupamentos gênicos 4) Olhe a anotação e rode o BLAST em uma CDS.
81 III. Analisando agrupamentos gênicos 5) Adicione a informação do gene à CDS com base nos resultados de BLAST.
82 III. Analisando agrupamentos gênicos 6) Salve a anotação.
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