Mesentério Glândulas de insetos Membranas fetais

Transcrição

1 MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR II - CITOQUÍMICA

2 Sistemas de estudos in vitro Preparações citológicas Citoquímica Autorradiografia Imunocitoquímica Cultura Fertilização Manipulações Célula Tecido Órgão Análises in situ Estudos bioquímicos Extrações/Purificações Centrifugações Diálises Eletroforeses Tecnologia do DNA/RNA

3 Métodos de Estudos in situ Preparações Citológicas e Técnicas Citoquímicas O estudo do material biológico ao Microscópio requer alguns procedimentos prévios que vão desde a escolha e coleta do material até a montagem final do preparado histológico Que os elementos a ser analisados não sejam difusíveis; Que o produto da reação seja visível (cor ou precipitado); Que a reação seja específica/seletiva para o que se pretende analisar Princípios da Citoquímica

4 Métodos de Estudos in situ Preparações Citológicas e Técnicas Citoquímicas O sucesso de uma reação citoquímica depende principalmente dos passos anteriores ao da reação de coloração: Coleta do material Fixação e agentes fixadores Agentes desidratantes

5 Coleta do Material Preparado permanente Células preservadas para melhor demonstração de sua estrutura Ideal = sejam mantidos estrutura e composição química quando in vivo 1) Montagem total: Material fino / transparente na lâmina Fixação e coloração Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas) Mesentério Glândulas de insetos Membranas fetais

6 Glândulas Salivares de Rhodnius prolixus Montagem total Glândula Principal Glândula Acessória Ducto Principal Ducto Acessório

7 Coleta do Material 2) Esfregaço: consistem em promover o espalhamento de células livres sobre a lâmina com o auxílio de outra lâmina Células livres: sangue, linfa, sêmen, líquor Fixação e coloração Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas)

8 Coleta do Material 3) Espalhamento: Erroneamente esfregaço Raspagem (espátula / palitos) de camadas superficiais (mucosas) Mucosas: bucal, anal, vaginal Fixação e coloração Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas)

9 Coleta do Material 4) Esmagamento: Esmagar, o material entre lâmina e lamínula, Coloração concomitante ou posterior Vantagem: estudo de divisões celulares Cromossomos Núcleo/Nucléolo

10 Coleta do Material 5) Decalque ou Imprint: Coleta de núcleos de tecidos moles fígado, baço, rim. timo Retira-se órgão face cortada lavada com salina seca com papel pressiona contra a lâmina (carimbo) Resultado: núcleos impressos Fixação e coloração Vantagem: - simples - estudo da quantidade de DNA

11 6) Cortes Histológicos

12 TÉCNICA DE MICROSCOPIA DE LUZ PARA O ESTUDO DAS CÉLULAS E TECIDO

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14 COMO PREPARAR UM CORTE HISTOLÓGICO???

15 MATERIAL BIOLÓGICO

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18 INIBIR A AUTÓLISE PRESERVAR A MORFOLOGIA E A COMPOSIÇÃO QUIMICA DO TECIDO FIXAÇÃO COAGULAR E ENDURECER O TECIDO FACILITAR A COLORAÇÃO

19 CONDUTA PARA BOA FIXAÇÃO Fixação por imersão: o fixador entra em contato com o material biológico após a retirada do organismo. Fixação por perfusão: o fixador é injetado na corrente sangüínea, possibilitando a fixação em nível pericelular e celular.

20 CRIOSTATO: objetivo é utilizar para o estudo da distribuição dos lipídeos.

21 FIXAÇÃO QUÍMICA: uso de substâncias que reagindo com as biomacromoléculas estabilizam as mesmas.

22 FORMOL (ALDEÍDO FÓRMICO a 40%) BOUIN (ÁCIDO PÍCRICO, FORMALDEÍDO E ÁCIDO ACÉTICO) KARNOVSKY ( PARAFORMALDEÍDO E GLUTARALDEÍDO

23 FATORES QUE ATUAM NO PROCESSO DE FIXAÇÃO Tamponamento Temperatura Espessura da peça Volume de fixador Tempo de fixação

24 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO DESIDRATAÇÃO: retirada da água dos tecidos e a sua substituição por álcool. DIAFANIZAÇÃO: substituição do álcool presente nos tecidos pelo óleo de cedro. IMPREGNAÇÃO: o óleo é substituído por parafina a 60 C. INCLUSÃO: o tecido é colocado em caixas com parafina e então solidificados.

25 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

26 INCLUSÃO EM PARAFINA E RESINAS HISTOLÓGICAS

27 INCLUSÃO

28 Diferentes planos dos cortes histológicos

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30 Micrótomo Leica RM2155 Cortes blocos parafina e resina - lâminas Navalha parafina Navalha resina Navalha diamante

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35 DISTENSÃO DOS CORTES

36 DESPARAFINIZAÇÃO HIDRATAÇÃO COLORAÇÃO

37 Corte histológico Clarificação

38 Citoquímica / Histoquímica Área da biologia celular e estrutural dedicada aos estudos dos métodos de coloração dos tecidos e constituintes celulares e subcelulares

39 Células x Tecidos Elementos químicos de Baixo P.M. (C, O, N, H, etc.) Matéria Orgânica Baixo Contraste Material a ser examinado ao M.L. - Fino - Transparente ( luz formação da imagem) Material Biológico Coloração ou reações

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42 Citoquímica Métodos de coloração Princípios químicos das reações de coloração Procedimentos protocolares

43 Coloração do Material Biológico Componentes químicos que podem ser avaliados pela técnica citoquímica Ácido Nucléicos Proteínas Polissacarídeos Lipídios Íons (Complexos moleculares) Vitaminas e Enzimas Pesquisa científica Diagnóstico patológico

44 Sucesso da reação citoquímica: Elementos avaliados Não difusíveis no processamento Produto da reação cor insolúvel Reação específica para o composto celular analisado Coleta Passos anteriores à reação: Fixação Desidratação

45 Reações Citoquímicas Natureza das reações citoquímicas envolvidas Ligações eletrostáticas Corante Ligações covalentes Substrato Interações hidrofóbicas

46 Reações Citoquímicas Mediadas por Ligações Eletrostáticas Afinidade eletrostática: um corante ionizado em uma solução reage com um substrato de carga iônica oposta. + - Substrato catiônico Acidofilia Corante aniônico Substrato aniônico - Basofilia Corante catiônico +

47 Basofilia Corantes Básicos (Catiônicos +) Substrato carregado negativamente (aniônico) reage eletrostaticamente com um corante carregado positivamente (catiônico). Corantes: Azul de metileno Azul de toluidina Azul de alcian

48 Basofilia

49 Basofilia Corantes catiônicos reagem com grupamentos ionizáveis na célula / no tecido, que apresentam cargas negativas (aniônicos) Fosfatos (ácidos nucléicos) Grupamentos negativos Sulfatos (Glicosaminoglicanos sulfatados) Carboxilas (Proteínas e açúcares ácidos)

50 Basofilia

51 Corante interage com um componente tissular, corando-o com cor diferente da sua cor original. O azul de toluidina é um corante básico que interage com compostos poliméricos ricos em grupamentos sulfato.

52 Metacromasia e Basofilia metacromática Alguns corantes básicos, devido à natureza planar de suas moléculas, podem promover um empilhamento ordenado ao ligarem-se a substratos polianiônicos: Fenômeno - metacromasia Metacromático Ortocromático

53 Corantes ácidos (Aniônicos) Reação de Acidofilia Esses corantes reagem com os elementos que possuem cargas positivas na célula, como por exemplo, as proteínas, que podem apresentar radicais básicos de seus aminoácidos ionizados (NH3+). Orceína Fast green Amarelo de Naftol Xilydine Ponceau Sírius Red

54 Ex.: Corante aniônico Orceína lacto-acética Corante se liga à proteínas histônicas ou totais, complexadas ao DNA da cromatina; Diferenciação entre eucromatina e heterocromatina (corante mais forte); Heterocromatina: Mais compacta e menor número de proteínas. Orceína lacto-acética Testículo de gafanhoto

55 Orceína lacto-acética Espermatogênese em testículo de triatomíneos

56 Hematoxilina Eosina Hematoxilina (+) Substratos (-) Núcleos (grupam/os fostato do DNA) Azul Eosina (-) Substratos (+) Citoplasma (grupam/o NH 2+ ) Rosa

57 Hematoxilina Eosina (Ribeiro & Lima, 2000) Coloração de rotina para análise geral da morfologia dos túbulos seminíferos (Mus muscullus) (ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)

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59 HE R Estrutura dos túbulos seminíferos Formação do grânulo préacrossomal (Peruquetti, 2004) C G

60 Corantes ácidos Coram estruturas básicas do tecido. Ex: aminoácidos básicos (lisina, arginina, histidina) Corantes básicos Coram estruturas ácidas do tecido. Ex: ácidos nucleicos, aminoácidos ácidos (aspártico, glutâmico).

61 Impregnação por Íons Prata

62 Impregnação pelo Nitrato de Prata A técnica de impregnação pela prata é utilizada para marcar: Nucléolos de núcleos interfásicos Regiões organizadoras nucleolares (RONs) nos cromossomos

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64 Nucléolo (ME) CG CFD CF

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66 Durante a intérfase, a impregnação pela prata ocorre largamente no Centro Fibrilar (CF) e no Componente Fibrilar Denso (CFD); Testes citoquímicos e análises químicas indicaram que a prata tem afinidade pelas proteínas acídicas (B 23, C 23 )

67 Impregnação por íons prata (Howell & Black, 1980) Identificação de proteínas nucleolares (B23 e C23) (nucléolos e corpúsculos nucleolares) (Mus muscullus) (ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)

68 Prata Proteínas nucleolares B 23 e C 23 (Peruquetti, 2004)

69 Aplicações A) Pesquisas citogenéticas Bandamento cromossômico Indicar atividades de transcrição do DNAr Estudo da atividade nucleolar durante a gametogênese B) Diagnósticos patológicos Leucemias Tumores: ovário mama útero tireóide Proteínas AgNOR Taxa de proliferação Grau de malignidade

70 Região Organizadora Nucleolar Regiões cromossômicas com as quais os nucléolos se associam e que são responsáveis pela reorganização destes, no final da divisão celular, onde os genes de DNAr estão localizados

71 Reações citoquímicas mediadas por ligações covalentes Muitas reações citoquímicas são mediadas por ligações covalentes, principalmente aquelas que precisam ser facilitadas por mordentes (componentes metálicos). Estas reações são chamadas de reações Tricrômicas. Tricômico de Masson Tricrômico de Gömöri Tricômico de Mallory São técnicas específicas para fibras do tecido conjuntivo e selecionam compostos celulares dos compostos fibrosos

72 Métodos Tricrômicos de Coloração Composição básica - Dois ou + corantes aniônicos - Mordentes (moléculas de componentes metálicos): ácido fosfofúngstico / ácido fosfomolibdico Resultados - Coloração seletiva para os componentes do tecido conjuntivo - Histopatologia - Pesquisa científica (Biologia celular e tecidual)

73 Tricrômico de Mallory Epitélio intestinal (roxo); fibras colágenas (azul)

74 Tricrômico de Gömöri Tecido conjuntivo (azul esverdeado) Células: pigmentos de fucsina Núcleos: escuros

75 Tricrômico de Masson Língua Fibras musculares (lilás) Fibras colágenas (azul) Núcleos (azul escuro)

76 Reações Citoquímicas Mediadas por Ligações Covalentes Outro exemplo clássico deste tipo de reação são as reações intermediadas pelo Reativo de Schiff: Reação de Feulgen (DNA); Teste do PAS (polissacarídeos neutros) Aldeídos livres 2(R-CHO) Leucoderivado da Fucsina básica Restauração do grupo cromofórico (2 fórmulas prováveis)

77 Reação de Feulgen

78 Importância da Reação de Feulgen Verificar a influência da ação de drogas, hormônios e do envelhecimento sobre o conteúdo do DNA; Detectar a presença de aneuploidias e poliploidias em vários tipos de tumores. DNA Feulgen + RNA Feulgen - Controle da reação: Extração do DNA Feulgen -

79 Mecanismo da Reação de Feulgen Duas etapas A) Hidrólise ácida (HCl) remove bases púricas Depurinação do DNA Ácido apurínico B) Exposição do material hidrolisado ao reativo de Schiff ( cora somente aldeídos livres)

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81 Hidrólise Ácida

82 Depurinação

83 Ligação do corante à molécula Reativo de Schiff

84 Fatores modificadores da resposta à Reação de Feulgen Disponibilidade de substrato a ser corado Influência da fixação Variações na etapa hidrolítica: molaridade do ácido / tempo / temperatura Ex.: HCl a 1N - 60o HCl 5N - temperatura ambiente Influência da composição e de outras características do Reativo de Schiff

85 Túbulos Seminíferos de Mus musculus

86 Reação de Feulgen Túbulos seminíferos R Áreas nucleolares (-) (espermatócitos I Espermátides) Heterocromatina (Peruquetti, 2004) C G

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88 MATERIAL INCLUÍDO EM PARAFINA

89 MATERIAL INCLUÍDO EM PARAFINA

90 MATERIAL INCLUÍDO EM PARAFINA

91 MATERIAL INCLUÍDO EM HISTORRESINA

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93 REFERÊNCIAS MICHALANY, J., Técnica Histológica em Anatomia Patológica. São Paulo: Editora Pedagógica e Universitária. JUNQUEIRA, L. C. & CARNEIRO, J., Biologia Celular e Molecular. 8. ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. DE ROBERTIS JR. E.M.F Bases da Biologia Celular e Molecular. 4ª. Edição. Guanabara Koogan. MELLO, R.C.N Células & Microscopia: princípios básicos e práticas. Juiz de Fora: Editora UJFJ.

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