Introdução à Bioquímica. Função das Proteínas

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1 Introdução à Bioquímica Função das Proteínas Dra. Fernanda Canduri Laboratório de Sistemas BioMoleculares. Departamento de Física.. UNESP São José do Rio Preto.. SP.

2 Tópicos! Mioglobina! Hemoglobina! Miosina e actina! Anticorpos

3 Mioglobina - Estrutura! Primeira proteína a ter sua estrutura determinada por cristalografia de raios X (1959).! Pequena proteína intracelular do músculo dos vertebrados com função de ligar oxigênio (O 2 ).! Possui 153 resíduos de aminoácidos, sendo que a maioria faz parte de oito hélices α.! Possui um único grupamento heme.

4 Mioglobina O grupo heme

5 Estrutura da mioglobina! O heme está encaixado em uma concavidade hidrofóbica! Duas cadeias laterais hidrofóbicas auxiliam na manutenção da posição do heme.! O sistema de anel heterocíclico do heme é um derivado porfirínico, contendo 4 grupos pirrólicos

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7 Estrutura da mioglobina! O átomo de Fe(II) do grupo heme, quando exposto ao O 2 é oxidado de maneira irreversível a Fe(III), forma que não liga O 2.! A porção protéica da mioglobina impede essa oxidação e torna possível a ligação reversível do O 2 ao heme.! A oxigenação leva a mudança de coloração da molécula de mioglobina.

8 Outras moléculas se ligam ao heme! Além do O 2, outras moléculas podem se ligar ao grupo heme: CO, NO e H 2 S! A afinidade destes compostos é muito maior do que o O 2.

9 Função da mioglobina Somente uma proteína armazenadora de O 2? Sua principal função fisiológica consiste em facilitar o transporte de oxigênio nos músculos. A mioglobina aumenta a solubilidade efetiva do O 2 no músculo, atuando como um carregador / descarregador molecular para aumentar a velocidade de difusão do O 2.

10 Função da mioglobina! Função de armazenar O 2 : Importante nos mamíferos aquáticos. Nesses animais, a concentração de mioglobina nos músculos é aprox. 10x maior do que nos mamíferos terrestres.

11 Função da mioglobina A ligação reversível do O 2 à mioglobina (Mb) é descrita por uma equação de equilíbrio Mb + O 2 MbO 2 A constante de dissociação (K) para essa equação é: K = [Mb][O 2 ] / [MbO 2 ]

12 A dissociação do O 2 da mioglobina é caracterizada por sua saturação fracional Y O2, que é definida como a fração dos sítios de ligação ocupados pelo O 2. Y O2 = [MbO 2 ] / [Mb] + [MbO 2 ] = [O 2 ] / K +[O 2 ] Desde que o O 2 é um gás, sua concentração é expressa por sua pressão parcial (po 2 ) Y O2 = po 2 / K + po 2 Essa equação descreve uma hipérbole

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14 Função da mioglobina! Numa po 2 baixa, pouco O 2 se liga à mioglobina (Y O2 é muito baixa).! A medida que a po 2 aumenta, mais O 2 ligase a Mb.! Numa po 2 muito alta, quase todos os sítios estão ocupados - diz-se que a Mb está saturada de O 2.

15 Função da mioglobina! A inclinação da hipérbole aumenta à medida que diminui o valor de K.! Quando po 2 é igual a K, metade da Mb estará saturada com O 2! Isso pode ser mostrado substituindo-se K por po 2 na equação anterior: se po 2 = K, Y O2 = po 2 /K + po 2 " Y O2 = 0,5 Então, K pode ser definido como o valor de po 2, no qual Y=0,5

16 Função da mioglobina! É conveniente definir K como p 50, ou seja, a pressão de O 2 na qual Mb está 50% saturada! A p 50 para a Mb é de 2,6 torr (760 torr=1atm) " no intervalo fisiológico da po 2 no sangue, a Mb está quase totalmente saturada com O 2. Y O2 =0,97 a po 2 =100 torr e 0,91 a po 2 =30 torr A Mb é um modelo útil para o estudo de outras proteínas de ligação.

17 Hemoglobina! Tem função fisiologicamente específica o transporte de O 2.! Constitui um sistema sofisticado de transporte que fornece a quantidade adequada de O 2 aos tecidos.

18 Estrutura da hemoglobina! É uma proteína tetramérica, com a estrutura quaternária α 2 β 2 (um dímero αβ).! As subunidades α e β são relacionadas estrutural e evolutivamente entre si e com a mioglobina.! Sua estrutura foi elucidada por Max Perutz em 1968, o pai da cristalografia de proteínas por difração de raios X.

19 Cada monômero da estrutura tetramérica da hemoglobina possui um grupo heme

20 Estrutura da hemoglobina Apenas cerca de 18% dos resíduos de aminoácidos são identicos na mioglobina e nas subunidades da hemoglobina, mas os três polipeptídeos possuem estruturas terciárias similares.

21 A estrutura da hemoglobina! A ligação do O 2 altera toda a estrutura do tetrâmero, de forma que a estrutura da desoxiemoglobina e a da oxiemoglobina são perceptivelmente diferentes.! Em ambas as formas, as subunidades α e β fazem contato extenso: os contatos na interface α 1 -β 1 e seu equivalente, envolvem 35 resíduos, e os da interface α 1 -β 2 envolvem 19 resíduos.! Essas associações são predominantemente hidrofóbicas, embora envolvam ligações de H e pares iônicos.

22 Oxihemoglobina e desoxihemoglobina

23 A estrutura da hemoglobina! Os pares das subunidades α 1 α 2 e β 1 β 2 estão separados por um canal de ~20Å de diâmetro preenchido com solvente.! Quando o O 2 se liga, os contatos α 1 β 2 e α 2 β 1 sofrem um deslocamento, produzindo uma alteração na estrutura quaternária.! Esse rearranjo estrutural é um elemento crucial no comportamento da ligação do O 2 à hemoglobina.

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25 Ligação do O 2 à hemoglobina! A hemoglobina tem uma p 50 total de 26 torr (em uma pressão de O 2 de 26 torr, metade da hemoglobina está saturada com O 2 )! Valor cerca de 10x maior do que a p 50 da mioglobina (2,8 torr)! A hemoglobina não apresenta uma curva hiperbólica de ligação ao O 2, como na mioglobina.

26 A ligação de O 2 à hemoglobina segue o traçado de uma curva sigmóide

27 Ligação do O 2 à hemoglobina! A hemoglobina pode transferir mais O 2 para os tecidos do que transferiria se apresentasse uma curva hiperbólica com a mesma p 50! Nas pressões arteriais de O 2, está quase totalmente saturada com O 2, mas nas pressões venosas de O 2 está somente metade saturada.

28 Ligação do O 2 à hemoglobina! Em qualquer sistema de ligação, uma curva sigmóide é característica de uma interação cooperativa entre os sítios: A ocupação de um sítio pelo ligante afeta a ocupação dos demais sítios por ligantes adicionais

29 Equação de Hill! Tentativa inicial de analisar a curva sigmóide de dissociação do O 2 da hemoglobina foi realizada por Archibald Hill (1910)! Hill presumiu que a hemoglobina (Hb) liga n moléculas de O 2 em uma única etapa Hb + n O 2 " Hb(O 2 ) n ou seja, com cooperatividade infinita.

30 Equação de Hill Em analogia a equação Y O2 = po 2 /K + po 2 para a Mb, Y O2 = (po 2 ) n / (p 50 ) n + (po 2 ) n é conhecida como equação de Hill. Ela descreve o grau de saturação da hemoglobina como uma função da po 2.

31 " A cooperatividade infinita da ligação de O 2 como descrita por Hill é uma impossibilidade física! A quantidade n, a constante de Hill, aumenta com o grau de cooperatividade de uma reação, proporcionando uma caracterização conveniente de uma reação de ligação de ligante n=1, a equação descreve uma hipérbole (reação não cooperativa) n>1, a equação descre uma sigmóide (reação positivamente cooperativa) n<1, reação negativamente cooperativa

32 A constante de Hill, n, e o valor de p 50 que melhor descrevem uma curva de saturação da Hb podem ser determinados graficamente pela equação Y O2 / 1 - Y O2 = (po 2 ) n / (p 50 ) n Tomando o log em ambos os lados, tem-se uma equação linear log (Y O2 / 1 - Y O2 ) = n log po 2 n log p 50

33 Gráfico de Hill A curva linear do log (Y O2 / [1 - Y O2 ]) pelo log de po 2, chamada curva de Hill, tem uma inclinação de n e um intercepto de log p 50 no eixo do log po 2.

34 Modelos mais realistas para analisar a ligação cooperativa do O 2 à Hb foram desenvolvidos Proteínas alostéricas A cooperatividade da ligação do O 2 à Hb é um modelo clássico A ligação de um ligante pode aumentar ou diminuir a afinidade de ligação de ligantes a outros sítios da proteína são interações alostéricas

35 Existem dois modelos propostos para explicar a ligação cooperativa do ligante 1. Modelo de simetria do alosterismo (proposto por Monod, Wyman e Changeux em 1965): a. Uma proteína alostérica é um oligômero de subunidades simetricamente relacionadas; b. Cada subunidade existe em dois estados conformacionais em equilíbrio; c. O ligante pode ligar-se à subunidade em ambas as conformações. Somente a mudança conformacional altera a afinidade pelo ligante; d. As subunidades devem alterar a conformação de modo combinado.

36 Modelo de simetria de MWC! A principal objeção ao modelo de simetria consiste na dificuldade de acreditar que a simetria oligomérica seja perfeitamente conservada em todas as proteínas! E, embora algumas proteínas exibam cooperatividade negativa, o modelo explica somente a cooperatividade positiva.

37 2. Modelo sequencial - proposto por Daniel Koshland! É uma alternativa ao modelo de simetria.! A ligação do ligante induz uma alteração conformacional na subunidade à qual se liga e, pela influência dessa sobre as subunidades vizinhas, surgem interações cooperativas! As mudanças conformacionais ocorrem sequencialmente à medida que mais sítios de ligação estão sendo ocupados! A afinidade varia com a conformação.

38 As proteínas que seguem o modelo sequencial do alosterismo podem apresentar cooperatividade positiva ou negativa! Se o acoplamento mecânico entre as subunidades for particularmente forte, as mudanças conformacionais ocorrerão simultaneamente, mantendo sua simetria! Neste caso, o modelo de simetria pode ser considerado um caso extremo do modelo sequencial! A ligação do O 2 à Hb exibe características de ambos os modelos é combinada e causa mudanças estruturais pequenas

39 Mecanismo de cooperatividade da ligação de O 2 Como a ligação de um O 2 num grupo heme afeta a afinidade de ligação de outro grupo heme? A informação é transmitida de modo mecânico para os demais grupos heme por movimentos da proteína. Esses movimentos são responsáveis pelas diferentes estruturas quaternárias da oxi- e desoxi- Hb.

40 A hemoglobina possui dois estados conformacionais! Baseadas nas estruturas cristalográficas das formas oxi e desoxi, Perutz formulou um mecanismo para a oxigenação da Hb: Há dois estados conformacionais estáveis: o estado R, oxigenado, e o estado T, desoxigenado. As conformações das 4 subunidades diferem do estado T para o R. A ligação do O 2 inicia uma série de movimentos coordenados.

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42 Formas R e T! A característica da transição T " R da Hb é que suas subunidades estão tão firmemente acopladas que não podem acontecer grandes mudanças estruturais terciárias dentro de uma subunidade, sem que ocorram mudanças estruturais quaternárias em toda a proteína só há duas formas R e T.! Nenhuma subunidade ou dímero muda sua conformação de modo independente.

43 Formas R e T! O estado T tem baixa afinidade pelo O 2, devido ao comprimento da ligação Fe-O 2 (0,1 Å maior).! Quando 1 O 2 liga-se a um dímero, a tensão gerada no estado T é suficiente para levar a proteína ao estado R! Então todas as subunidades são convertidas simultaneamente ao estado R, tenham ou não O 2 ligado.! Nesta conformação, as subunidades não-ocupadas apresentam maior afinidade pelo O 2.

44 O efeito Bohr! As mudanças conformacionais que ocorrem na Hb pela ligação do O 2 reduzem os pks de vários grupos (N-terminal das α e C-terminal das β).! No estado T esses grupos ácidos com carga positiva participam de ligações iônicas o que eleva seus pks, ao passo que no estado R tais interações não existem.! O aumento do ph (remoção de prótons), estimula a hemoglobina a ligar mais O 2 em pressões de O 2 mais baixas é o efeito Bohr Christian Bohr (1904)

45 O efeito Bohr

46 O efeito Bohr desempenha funções importantes O 2 " pulmões para os tecidos CO 2 " difunde-se dos tecidos para os capilares e pulmões O CO 2 dissolvido transforma-se lentamente em bicarbonato (HCO 3- ) CO 2 + H 2 O " H + + CO 3 - No eritrócito, a enzima anidrase carbônica acelera essa reação. Então, a maior parte do CO 2 é transportado no sangue na forma de bicarbonato.

47 Nos pulmões, onde a pressão de O 2 é alta, a ligação do O 2 à Hb rompe as ligações iônicas do estado T e forma o estado R, liberando assim, os prótons de Bohr, que se recombinam com o bicarbonato para eliminar o CO 2.

48 A hemoglobina altamente purificada (Stripped Hb) tem uma afinidade muito maior pelo oxigênio do que a hemoglobina no sangue total. Porque? Joseph Barcroft (1921) especulou que o sangue conteria, além do CO 2, alguma outra substância, afetando a ligação do O 2 à Hb.

49 D-2,3-bisfosfoglicerato o BPG

50 D-2,3-bisfosfoglicerato o BPG Liga-se fortemente a desoxi-hb e fracamente a oxi- Hb. Assim, a presença do BPG nos eritrócitos reduz a afinidade da Hb pelo O 2 por mantê-la na sua forma desoxi Onde se liga na molécula da Hb?

51 O BPG liga-se à concavidade central! Na transição T " R, as duas subunidades β se aproximam,estreitando a concavidade central, e expulsando o BPG! Portanto, estabiliza a conformação T da Hb pela ligação cruzada de suas subunidades β! Desloca o equilíbrio R " T, reduzindo a afinidade da Hb pelo O 2.

52 BPG função fisiológica indispensável! No sangue arterial (po 2 = 100 torr) a Hb está 95% saturada com O 2! No sangue venoso (po 2 = 30 torr) a Hb está 55% saturada Então, ao passar pelos capilares, a Hb descarrega cerca de 40% de O 2 Na ausência de BPG, somente pequena parte do O 2 seria liberado, devido ao aumento da afinidade. O BPG exerce um papel importante na adaptação às grandes altitudes

53 A Hb fetal (α 2 γ 2 ) tem baixa afinidade pelo BPG

54 Hemoglobinas anormais O estudo de indivíduos com deficiências fisiológicas levou a descoberta de aproximadamente 500 hemoglobinas variantes Cerca de 95% delas são resultado de substituições de um único aminoácido na cadeia polipeptídica da globina.

55 Hemoglobinas anormais! As mutações que desestabilizam as estruturas terciárias e quaternárias alteram a afinidade da Hb pelo O 2 e reduzem a sua cooperatividade.! As Hbs instáveis são degradadas pelos eritrócitos e seus produtos de degradação causam lise celular é a anemia hemolítica

56 Hemoglobinas anormais! Outras mutações favorecem a oxidação do Fe(II) para Fe(III) cianose São indivíduos portadores de metahemoglobina Essa Hb apresentam cooperatividade reduzida! Há também mutações que aumentam a afinidade da Hb pelo O 2, levando ao aumento do número de eritrócitos para compensar a quantidade reduzida de O 2 que chega aos tecidos - policitemia

57 A anemia falciforme! Os indivíduos que apresentam os dois alelos (homozigotos) do gene da hemoglobina S sofrem de anemia falciforme, na qual a desoxi-hb S forma filamentos insolúveis que deformam os eritrócitos

58 Micrografia eletrônica de eritrócitos humanos

59 A anemia falciforme! As células rígidas e em forma de foice não conseguem passar com facilidade pelos capilares.! Em 1956, V. Ingram mostrou que a Hb S continha uma Val na posição 6 das cadeias β, ao invés de Glu. Doença congênita originada pela troca de um aminoácido específico de uma proteína

60 Hemoglobina S! A estrutura cristalográfica da desoxi-hb S mostrou que a cadeia lateral da Val de cada molécula mutante encaixase em uma concavidade hidrofóbica na superfície da subunidade β de outra molécula de hemoglobina! Esse contato intermolecular permite a formação de polímeros lineares entre as moléculas da Hb S formam agregados de 14 cadeias que enrolam-se e formam fibras de cerca de 220Å de diâmetro

61 Anemia falciforme Nem a Hb normal, e nem a oxi-hb S podem polimerizar A concavidade hidrofóbica não acomoda a cadeia lateral do Glu de uma cadeia normal, e essa concavidade não existe na oxi-hb Muitos homozigotos para Hb S apresentam somente uma forma leve de anemia falciforme, pois apresentam níveis relativamente altos de Hb fetal (α 2 γ 2 )