Função de Proteínas: Mioglobina e Hemoglobina

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1 Aula de Bioquímica Avançada Tema: Função de Proteínas: Mioglobina e Hemoglobina Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP borgesjc@iqsc.usp.br

2 Proteínas Funções Transporte e Estoque; Catálise enzimática; Movimento; Suporte mecânico; Proteção imune; Sinalização intra e extracelular; etc. Variedade Funcional Diferentes Estruturas Tridimensionais Estrutura 3D Estrutura Estável em função do tempo Estabilidade versus flexibilidade Função versus Conformação.

3 Como as Proteínas Funcionam Grande maioria interação com outras moléculas Interações reversíveis ligante (qualquer tipo de molécula, inclusive proteína); ***Natureza transitória das interações proteína-ligante*** VIDA RESPOSTA RÁPIDA E REVERSÍVEL A MUDANÇAS AMBIENTAIS E CONDIÇÕES METABÓLICAS SÍTIO DE LIGAÇÃO Interação específica Acoplada a uma mudança conformacional ENCAIXE INDUZIDO *ENZIMAS: Substratos; Sítio catalítico ou Sítio ativo.

4 Introdução Organismos aeróbicos Necessitam de suprimento de O 2 constante Organismos multicelulares vertebrados - Desenvolvimento de sistema circulatório - Desenvolveram proteínas de transporte de O 2 1 Mioglobina músculo - mantém suprimento local de O 2 2 Hemoglobina sangue hemácias - Transporta O 2 dos pulmões para os tecidos - Transporta CO 2 e H 3 O + dos tecidos para os pulmões Mioglobina versus Hemoglobina - São similares na Estrutura Primária, Secundária e Terciária - Ligam O 2 de maneira muito similar - Em condições similares aos tecidos, a Hemoglobina está 7% saturada com O 2 enquanto que a Mioglobina apenas 90% saturada - Hemoglobina liga O 2 de maneira cooperativa e é uma proteína alostérica - Ambas são importantes proteínas-modelo de estudo Bioquímico

5 Grupo Prostético = Heme A ligação O 2 pelas globinas depende do grupo Heme Grupo Heme Protoporfirina + Fe 2+ = responsável pela cor vermelha do sangue - Protoporfirina 4 anéis pirrólicos (anel tetrapirrólico) - 8 Cadeias Laterais = 4 metilas, 2 vinilas e 2 Ácidos Caboxílicos - Ferro é coordenado no centro pelos átomos de Nitrogênio dos 4 grupos Pirróis. Porfirina Heme Fe 2+ Coordenação Hexagonal

6 Holomioglobina Grupo heme está ligado à apoproteína: 1) pelo ocupação do Quinto ponto de coordenação do Fe 2+ pela His proximal 2) Interações Hidrofóbicas do anel tetrapirrólico - Sexto ponto de coordenação do Fe 2+ é ocupado pelo O 2 - Na forma deoxi, a His Proximal retira o Fe 2+ do plano central da porfirina

7 Holomioglobina Grupo heme permite monitoramento:

8 Holomioglobina 1º Proteína a ter a sua estrutura 3D resolvida - Estrutura em Hélices Alfa - Possui 153 resíduos de AA - Total de 8 hélices anfipáticas nomeadas de A a H Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F - Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8) - Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7)

9 Holomioglobina Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F - Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8) - Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7) A ligação O 2 Fe 2+ gera a transferência parcial de 1 elétron do Fe 2+ para o O 2 forma o íon superóxido O 2 - A His E7 estabiliza o O 2 ligado ao Fe 2+ por uma ligação de H; Evita a formação do íon superóxido; - O componente protéico estabiliza a reatividade do O 2

10 Interação Proteína-Ligante pode ser quantificada Proteínas são capazes de interagir especificamente com ligantes A interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica P + L k 1 k 2 PL Questões apresentadas 1) Qual é o máximo número de moles de ligante por proteína? 2) Qual é a constante de equilíbrio deste ligante por cada um dos sítios de ligação? 3) A constante de equilíbrio do L por cada um dos sítios é independente da ocupação dos demais? 4) A constante de equilíbrio do L é modificada pela presença de um segundo ligante?

11 Interação Proteína-Ligante pode ser quantificada A interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica P + L k 1 k 2 PL K eq = K A = k k [ PL] K 1 = D = 2 [ P][ L] 1 K A k 1 e k 2 são as constantes de velocidade de associação e dissociação K A e K D são as constantes de equilíbrio no sentido de associação e dissociação K A é dado em (mol/l) -1 (M -1 ) Quanto maior o valor de K A maior a afinidade da interação PL K D é dado em mol/l (M) Quanto menor o valor de K D maior a afinidade da interação PL Quando a [L] é >>> [P] podemos considerar que a formação do PL não altera a [L] A fração de Sítios de ligação na P frente ao L pode ser descrita pela seguinte equação θ = Sítios Ocupados Total de Sítios Disponíveis [ PL] = [ PL] + [ P]

12 Interação Proteína-Ligante pode ser quantificada Θ pode ser monitorado e seu valor em função da [L] resulta numa hiperbólica retangular θ = [ PL] [ PL] + [ P] [ PL] K A = [ PL] = [ P][ L] K A [ P][ L] Substituindo [PL] θ = K A K A[ P][ L] [ P][ L] + [ P] = K A[ L] K [ L] + 1 A = [ L] 1 [ L] + K A = [ L] [ L] + K D Quando [L] = K D [L] onde metade dos sítios de ligação estão ocupados pelo Ligante Dividindo ambos os por [P] Dividindo ambos por K A 1 K = K A D Para 90% de saturação [L] = 9 x K D

13 Equilíbrio múltiplo Considerações gerais -n > 1 θ n ik i 1 1 = n= k i = 0 1 [ A] [ A] i i Se n = 1 K eq = K A = k k 1 = 2 [ PLn ] [ P][ L] n Equação de Adair

14 Equilíbrio múltiplo Sítios equivalentes e independentes - Todos os ligantes interagem com a os seus sítios de ligação com a mesma afinidade. Uma das vias possíveis para a saturação de todos os sítios possíveis

15 Equilíbrio múltiplo Sítios não-equivalentes - Sítios diferentes que ligam com diferentes afinidades K 1 # K 2 θ n1k1 [ L] + K [ L] n K 2 2 K2[ L] [ L] + 1 Curvas de saturação A: K 1 = K 2 = 1e6 M -1 B: K 1 = K 2 = 1e5 M -1 C: K 1 = 1e6 M -1 e K 2 = 1e5 M -1 D: K 1 = 1e6 M -1 e K 2 = 1e3 M -1

16 Interação Mioglobina-O 2 A interação entre a mioglobina e O 2 segue as leis da termodinâmica mesmo considerando o Oxigênio como gás - Adequação experimental e matemática é necessária θ = [ O2] [ O ] + 2 K D A [O 2 ] em solução depende diretamente da pressão de O 2 na atmosfera que pode ser controlada. θ = po po K D Quando po 2 for equivalente à metade do sinal máximo temos K D e assim podemos definir P 50 Se P 50 = [O 2 ] na qual metade dos sítios estão ocupados θ = po po P 50 P 50 = K D O 2 liga fortemente à mioglobina com um P 50 de 0,26 kpa - Condição na qual metade dos sítios estão ocupados

17 Estrutura da Hemoglobina A Hemoglobina é um heterotetrâmero - Duas cadeias Alfa (141 resíduos) e duas cadeias Beta (146 resíduos) - Possui estrutura em hélice alfa Hemoglobina A (HbA) = par de dímeros α 1 β 1 e α 2 β 2 - A interface α 1 β 1 e α 2 β 2 apresenta ~30 contatos - A interface α 1 β 2 e α 2 β 1 apresenta ~19 contatos Maioria hidrofóbicos e alguns hidrofílicos Importantes para regulação - Grupos Heme estão bem separados (24-40 Å)

18 Estrutura da Hemoglobina Cadeia Alfa e Beta da HbA apresentam ~25% de identidade com a Mioglobina Alta identidade estrutural - Apesar da baixa identidade sequencial - Identidade estrutural é mais conservada Mesma forma de ligar grupo Heme -Possui His Proximal e Distal

19 Estrutura da Hemoglobina A HbA liga O 2 de maneira cooperativa curva Sigmoidal A ligação de O 2 em uma cadeia da HbA aumenta a ligação de O 2 nas demais cadeias A dissociação de O 2 em uma cadeia da HbA facilita a dissociação de O 2 nas demais cadeias

20 Estrutura da Hemoglobina A ligação de O 2 com HbA é >10 x mais fraca do que com a Mioglobina A baixa afinidade da HbA por O 2 está relacionada com a função desta proteína - Captar O 2 nos pulmões ( alta po 2 ) e liberar nos tecidos ( baixa po 2 ) A alta afinidade da Mioglobina por O 2 está relacionada com a função: Armazenar O 2

21 Cooperatividade A Alosteria outra forma está envolvida na cooperatividade Sistema de variação de afinidade/atividade frente à modulação. Envolve a participação de um Modulador - Modulador Ativador ou inibidor - Modulação homotrópica: Ligante e modulador iguais - Modulação heterotrópica: Ligante e modulador diferentes Uma curva de ligação sigmoidal é um sinal de ligação cooperativa.

22 Cooperatividade A ligação cooperativa de O 2 na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910) P + nl k 1 k 2 PL n K eq = K A = k k 1 = 2 [ PLn ] [ P][ L] n θ n nk An[ L] K [ L] + 1 = n An n θ [ L] = θ K n D log n θ θ = nlog[ L] nlog Equação de Hill K D 1) Reorganizando 2) Dividindo ambos por K A 3) Substituindo por K D Aplicando Log Curva de Hill log [θ/(1-θ)] versus log[l] onde a inclinação = n = n H

23 Cooperatividade A ligação cooperativa de O 2 na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910) log n θ θ = nlog ( p0 2 ) nlog( P ) 50 n H não representa o número de sítios de ligação, mas o grau de interação entre eles: o grau de cooperatividade n H representa a cooperatividade entre os sítios de ligação n H < n

24 Equilíbrio múltiplo Sítios cooperativos - n H = 1 interação não cooperativa - n H > 1 cooperatividade positiva - n H < 1 cooperatividade negativa

25 Ligação de O 2 na Hemoglobina Em exercício, o sangue arterial, após uma passagem pelo pulmão, apresenta ~98% de saturação da HbA com O 2 Após passar pelos tecidos, o sangue venoso apresenta ~32% de saturação de O 2 - Portanto, ~66% dos pontos de ligação contribuíram para o transporte de O 2 A ação cooperativa da HbA favorece a DESCARGA adequada de O 2 - Nestas condições, a Mioglobina permaneceria com 91% de saturação 7% de transporte A HbA transporta ~10 x mais O 2 do que a Mioglobina

26 A cooperatividade da HbA A ligação de O 2 na HbA resulta em mudanças conformacionais na tetrâmero de HbA-O 2 - Um dímero Alfa-Beta sofre rotação de 15º em relação ao outro A HbA existe em duas conformações principais: 1) T (Tenso) Estado deoxigenado 2) R (Relaxado) Estado Oxigenado - O Estado R apresenta maior afinidade por O 2 do que o estado T - Na presença de O 2, o estado R é mais estável O 2

27 A cooperatividade da HbA Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α 1 β 2 e α 2 β 1 A ligação de O 2 altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos - Mudanças no ambiente do grupo Heme são transmitidas para as outras cadeias do oligômero

28 A cooperatividade da HbA Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α 1 β 2 e α 2 β 1 A ligação de O 2 altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos

29 A cooperatividade da HbA Modelos de cooperatividade Modelo Combinado Modelo Sequencial

30 A cooperatividade da HbA Modelos de cooperatividade Modelo Combinado ou Coordenado Modelo Sequencial, em concerto ou simultâneo

31 A cooperatividade da HbA A HbA pura no estado T é muito instável - Liga avidamente O 2 em baixas [O 2 ] e libera apenas 8% de O 2 em condições fisiológicas A transição T R adequada depende de um ligante o 2,3-Bisfosfoglierato 2,3-BPG A [2,3-BPG] nas hemácias é aumentada na altitude. - Adaptação em ~ 24 horas - Permite menor afinidade entre HbA-O 2 - A HbA liga menos O 2, MAS descarga de O 2 nos tecidos é MAIOR apesar da menor po 2 atmosférica

32 A cooperatividade da HbA Efeito do 2,3-Bisfosfoglierato 2,3-BPG na p50

33 A cooperatividade da HbA O 2,3-BPG é sintetizado a partir de intermediários da via glicolítica:

34 A cooperatividade da HbA O 2,3-BPG: 1) Liga-se no centro do Tetrâmero da HbA; 2) É liberado após transição T R; 3) Age mantendo HbA no Estado T; 4) É um Efetor Alostérico.

35 A cooperatividade da HbA A transição T R expulsa o BPG do sítio de ligação Estado T Estado R

36 A Hemoglobina Fetal - A Hb fetal contem duas cadeia Alfa e duas cadeias Gama A cadeia Gama é 72% idêntica à cadeia Beta na seqüência de aminoácidos - A modificação Beta-His143 Gama-Ser143 - Modifica o sítio de interação do 2,3-BPG com a Hb Consequências: - Redução da afinidade da Hb Fetal por 2,3- BGP - Aumento da afinidade da Hb Fetal por O 2 Permite que a Hb Fetal receba eficientemente o O 2 transportado pela HbA maternal - O feto não experimenta po 2 atmosférica Outros genes Existem outras 3 cadeias de hemoglobina expressas em diferentes estágios do desenvolvimento Existem ainda: Neuroglobina e citoglobina (+ similares à mioglobina)

37 Integração das trocas gasosas O CO 2 é transportado como HCO 3- (maior parte) A Hidratação do CO 2 gera H +

38 A HbA transporta H + e CO 2 dos tecidos para o pulmão A HbA é sensível aos níveis de H + e CO 2 nos tecidos - H + e CO 2 são efetores alostéricos da HbA aumentam a liberação de O 2 para os tecidos O estado T é estabilizado pela redução do ph - Resultado: descarga de O 2 nos tecidos É chamado de Efeito Bohr (Christian Bohr, pai de Niels Bohr) O CO 2 é hidratado pela enzima Anidrase Carbônica nas hemácias A afinidade da HbA por O 2 diminui com a redução do ph

39 A HbA liga H + e CO 2 A HbA transporta H + dos tecidos para o pulmão No capilar sanguíneo (tecidos) A Hidratação do CO 2 é catalisada pela Anidrase carbônica Ponte salina na interface α 2 β 1 O próton liberado pela hidratação do CO 2 liga-se à cadeia alfa e beta da HbA estabilizando uma ponte salina estabilização do estado T Permite o transporte de próton para os pulmões - 80% do transporte

40 A HbA liga H + e CO 2 A HbA transporta CO 2 dos tecidos para o pulmão O CO 2 liga-se à aminas terminais - ~15-20% do transporte ligado à HbA - Restante é transportado na forma de HCO 3- solúvel Forma grupos carbamato carga negativa Estabiliza estado T por favorecer interações eletrostáticas na interface cadeia Alfa-Beta da HbA Descarga de O 2 pela HbA 66% 77% 88%

41 Fatores influentes na HbA Efeitos na curva de saturação

42 Mutações na HbA Os genes da Hb sofrem mutações que alteram a cadeia protéica - Podem prejudicar a afinidade da Hb pelo O 2 - Originam as Hemoglobinopatias são as anemias hereditárias - ~ 500 tipos de mutações identificadas na população humana - Muitas mutações são inócuas - O Surgimento da anemia depende se o indivíduo é heterozigoto ou homozigoto Anemia falciforme - devido à mutação D6V na cadeia Beta - Forma a Hemoglobina S - Forma um contato hidrofóbico com a F85 e V88 entre as cadeias beta inter-tetrâmeros

43 Mutações na HbA As pontes hidrofóbicas inter-cadeias propicia a fibrilação

44 Mutações na HbA As pontes hidrofóbicas inter-cadeias precipitam a HbS não liga O 2

45 Mutações na HbA A HbS forma fibras que deformam a estrutura das hemácias HbS aumenta resistência à malária parasita vive dentro das hemácias -possível fator seletivo positivo da HbS por isto foi selecionada e persiste presente