Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2010/2011. Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano

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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2010/2011 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO 3ª AULA PRÁTICA Doseamento de amónio no plasma (amoniémia). Importância clínica. Determinação da actividade plasmática das transaminases (TGO e TGP). Relevância clínica. 1

2 Amónio ou amonião (NH 4 + ) A eliminação renal do ião amónio, produzido pela protonação do amoníaco (NH 3 ) lançado no lúmen do nefrónio, principalmente pelo túbulo contornado proximal, é uma função renal da maior importância para a manutenção do equilíbrio ácido-base do organismo dos Mamíferos, particularmente no Ser Humano. A origem renal do azoto foi atribuída em 1929, por Elíseo Milheiro, da Faculdade de Medicina do Porto, a ácidos aminados. Destes, foi comprovado depois serem a glutamina e o ácido glutâmico os dadores fisiológicos, e foi também comprovado serem a glutaminase e a desidrogenase do glutamato (GLDH) as enzimas intervenientes no processo. Sabe-se que é igualmente na forma de glutamina que o azoto aminado transita da sua origem celular, ubíqua, onde se liberta pelo catabolismo dos aminoácidos, para o fígado, onde é transformado em ureia. O significado fisiológico da formação do ião amónio pelas células do nefrónio (nefrócitos) é, porém, distinto desse, e está principalmente associado aos processos homeostáticos do equilíbrio ácido-base. Nos nefrónios, principalmente nos túbulos contornados proximais, dão-se reacções intracelulares que resultam na síntese do amoníaco (NH 3 ). Este, em solução aquosa, encontra-se em equilíbrio com a sua forma protonada, amonião (NH + 4, dissolvido), que é segregado para o lúmen tubular; em conjunto com o anião hidrogenocarbonato, que é segregado para o espaço intersticial, permitem a poupança de catiões metálicos, com efeitos homeostáticos activos nos casos de acidose, mantendo-se o estado isoeléctrico celular (Figura 1). + Se a reabsorção tubular do hidrogenocarbonato for significativa, a síntese nefrónica do NH 4 não será activada. O NH + 4 produzido pode não ser eliminado, mas ser reabsorvido nos ramos ascendentes da ansa de Henle, onde se mantém um gradiente de NH + 4, por efeito de contra-corrente, com alta concentração de NH + 4 nas pirâmides medulares. Nos tubos colectores, o NH entra para o fluido tubular e é excretado. Além disso, o NH 4 está em equilíbrio nas células com o par NH 3 e H +. Uma vez que o pka desta reacção é cerca de 9, a relação do NH 3 para o NH + 4, a ph 7 é de 1/100. Contudo, o NH 3 é liposolúvel e difunde através das membranas celulares para o fluido intersticial e para o espaço intratubular, segundo o gradiente das concentrações. No fluido luminar, reage com o H + formando NH + 4 que permanece em solução no fluido. 2

3 Líquido intersticial Lúmen tubular Figura 1- Esquema de reacções metabólicas que resultam na poupança de catiões metálicos, neste caso do Na +, por troca com amonião, nos nefrócitos do túbulo contornado proximal. Abreviaturas: A Base conjugada; 1- anidrase carbónica; 2- glutaminase. [Referência: Hipólito-Reis, C., Alçada, M.N.M.P., e Azevedo, I. (2002) Práticas de Bioquímica para as Ciências da Saúde. Lidel, Lisboa.] 3

4 A principal reacção intracelular que dá origem a NH + 4 é, como foi referido, a hidrólise da glutamina, catalisada pela glutaminase. Esta actividade é exercida por duas isozimas que concomitantemente se encontram nos rins. Uma necessita do ião fosfato e é designada por glutaminase I; a outra, designada por glutaminase II, é independente do ião fosfato, sendo activada pelo malato. A regulação da actividade destas duas isoenzimas, exercida certamente por múltiplos actores, é mal conhecida, mas sabe-se que apenas a glutaminase I é induzida e reprimida pela acidose e pela alcalose, respectivamente, e que estes comportamentos apenas se verificam nos túbulos contornados proximais. A GLDH também produz NH + 4 e, concomitantemente, o alfa-cetoglutarato. Na acidose crónica, aumenta a quantidade de NH + 4 excretada na urina, seja qual for o ph desta, porque a quantidade de NH 3 que entra nos túbulos renais também aumenta. Este processo homeostático, de mecanismo mal conhecido, aumenta a eliminação de H + pela urina e, consequentemente, a ulterior secreção de H +, poupando também a eliminação dos outros catiões. Como foi já referido, a manutenção destes mecanismos e as suas consequências fisiológicas processam-se pelo fluxo no interior do nefrónio com arrastamento do produto final para os departamentos urinários inferiores em que as trocas são canceladas. O processo de segregação do NH 3 para o fluido luminar, onde, por protonação, se transforma em NH + 4, classifica-se como difusão não iónica. Os salicilatos e outros compostos na forma não ionizada (incluindo, por isso, bases fracas ou ácidos fracos) são também segregados por difusão não iónica, difundindo para o fluido luminar, a velocidades dependentes do ph deste. Consequentemente, a quantidade destas substâncias eliminadas na urina depende do ph da mesma. AMONIÉMIA O ião amónio é um catabolito do metabolismo dos aminoácidos. O ciclo da ureia é a via comum final para a excreção de amónio nos mamíferos, ocorrendo parcialmente no citosol e na mitocôndria. O fígado é o único órgão que contém todas as enzimas do ciclo da ureia. O amónio também é excretado como tal na urina, sendo responsável pelo cheiro amoniacal da mesma, tendo a sua excreção um importante papel na regulação do equilíbrio ácido-báse do organismo. A amoniémia diz respeito aos níveis plasmáticos de amónio. A hipoamoniémia não tem significado clínico. 4

5 O amoníaco (forma desprotonada do amonião), pode atravessar a barreira hematoencefálica (BHE) e, quando ultrapassa as concentrações normais, é tóxico para o SNC. Provoca edema cerebral e encefalopatia, pelo que a hiperamoniémia é deletéria e potencialmente fatal. As causas mais importantes de hiperamoniémia são (1) as doenças hepáticas difusas quando cursam com insuficiência hepática, como a cirrose hepática e as hepatites, víricas ou tóxicas, por exemplo; ou (2) doenças hereditárias, como os défices enzimáticos do ciclo da ureia, muito mais raras, que ocorrem habitualmente na infância, mas podem manifestar-se em qualquer idade. As hiperamoniémias hereditárias, de causa genética, agrupam-se em quatro categorias: - Défices de enzimas do ciclo da ureia - Défices no transporte de aminoácidos dibásicos - Acidémia orgânica - Défices enzimáticos da β-oxidação dos ácidos gordos. A hiperamoniémia provoca edema cerebral por aumento da glutamina: a amónia liga-se ao glutamato com formação de glutamina, com aumento da osmolaridade celular. Há um défice energético associado, devido ao consumo do alfa-cetoglutarato (ciclo de Krebs) para formar glutamato. Surgem também alterações ao nível dos neurotransmissores, nomeadamente de serotonina, devido à elevação na concentração de aminoácidos aromáticos, por défice hepático na sua degradação, como o triptofano, precursor da serotonina, que atravessa a BHE. A hiperamoniémia (Figura 2) é um dos sinais laboratoriais e um dos responsáveis pela fisiopatologia do coma hepático. Ocorre em muitas doenças hereditárias do metabolismo, quer primariamente (défices enzimáticos do ciclo da ureia ou de transportadores relacionados com este ciclo metabólico), quer secundariamente a alterações do metabolismo intramitocondrial, como por exemplo, nos defeitos da oxidação dos ácidos gordos. A doença hereditária do ciclo da ureia mais frequente está associada ao défice da ornitina transcarbamilase (OTC). Trata-se de uma doença de hereditariedade ligada ao cromossoma X, em que as manifestações clínicas são mais frequentes na infância, mas podem ocorrer em qualquer idade, sendo ambos os sexos afectados, com maior gravidade no masculino. De um modo geral, nos casos de défice do ciclo da ureia, há uma relação entre os valores da amoniémia e o grau de alteração do estado de consciência, bem com das sequelas neurológicas. 5

6 Figura 2- Abordagem clínico-laboratorial da hiperamoniémia. Abreviaturas: ASA=argininosuccinic acid, THAN=transient hyperammonemia of the newborn, LPI=lysinuric protein intolerance, HHH=hyperammonemia-hyperornithinemia-homocitrullinuria syndrome, OTC=ornithine transcarbamylase, CPS=carbamyl phosphate synthetase, NAGS=N-acetylglutamate synthetase. Urine orotic acid also tends to be elevated in LPI and HHH, but citrulline concentration is normal. [adaptado de Outros sinais associados à hiperamoniémia são a hiperventilação por estimulação do centro respiratório, com consequente alcalose respiratória e níveis baixos de ureia sanguínea, bem notório nas doenças do ciclo da ureia, em que a sua produção é muito reduzida. Para além do coma, que pode ser inaugural ou, mais frequentemente, surgir após um período mais ou menos longo de manifestações clínicas, como vómitos de repetição associados a prostração e/ ou agitação e agressividade, as doenças do ciclo da ureia podem confundir-se com quadros digestivos ou psiquiátricos crónicos. Na história clínica, pode ser de valorizar uma dieta espontaneamente pobre em proteínas (i.e. anorexia selectiva para alimentos ricos em proteínas) ou alterações clínicas mais evidentes após abusos alimentares ou doenças febris intercorrentes, com jejuns prolongados. O coma hiperamoniémico pode ser precedido por grande agitação psicomotora. A determinação da amoniémia é mandatória em todos os casos de coma de causa desconhecida ou em comas pós-traumáticos de gravidade não justificada pelo traumatismo, a par da glicémia e da alcoolémia. Devem valorizar-se os valores de amónio acima do normal, mesmo apenas ligeiramente elevados, em doentes sintomáticos (alcalose respiratória, letargia, vómitos, estupor ou 6

7 coma, ou outros sinais, de aumento da pressão intracraneana) ou em doentes com níveis iguais ou superiores a 100 µm, os quais correm o risco de encefalopatia hiperamoniémica severa. A colheita de sangue para o doseamento da amónia, que pode ser venoso ou arterial capilar, deve ser feita, de preferência sem garrote, para um tubo heparinizado ou com EDTA, mantido em gelo, e o plasma prontamente centrifugado (máximo até 30 minutos após a colheita), de preferência numa centrífuga refrigerada. É de notar que a colheita com luta e/ou o uso de garrote durante a mesma, bem como a demora no transporte para o laboratório e/ou na separação do plasma, pode levar à detecção de falsas elevações da amoniémia. Em princípio, não há alterações significativas nos níveis de amoniémia determinada em sangue total conservado a 4ºC até 1-2 horas após a colheita. O plasma, quando separado imediatamente do sangue, é estável durante 4 horas a 4ºC, ou 24 horas se imediatamente congelado a -20ºC (pode variar de acordo com o método de detecção). Existem vários métodos de doseamento da amónia, sendo mais comum a utilização de um método enzimático, com detecção espectrofotométrica. Baseia-se na aminação do alfacetoglutarato a glutamato, com oxidação simultânea do NADPH a NADP + por acção da enzima GLDH, segundo a reacção: alfa-cetoglutarato + NH NADPH L-glutamato + H 2 O + NADP + A variação da concentração de NADPH (diminuição) reflecte a concentração de NH + 4 ; é medida pela diferença entre dois valores de DO num período de tempo curto e definido (p.e. 5 minutos), devido à reversibilidade, aplicando a Lei de Beer-Lambert e usando um padrão. É avaliada por espectrofotometria de ultra-violeta, a 340 nm; o NADPH tem um coeficiente de absortividade molar de 6220 cm -1 M -1. Os valores normais variam entre 10 e 55 µm, com pequenas variações dos extremos, dependendo do laboratório. A interpretação de valores entre 30 e 100 µm dependerá da precisão do laboratório, já que, a não ser que seja seguida uma metodologia muito rigorosa, os níveis mais baixos estão sujeitos a erros. Um valor acima de 100 µm tem sempre significado patológico, excepto nos recém-nascidos prematuros nos quais pode existir hiperamoniémia transitória por imaturidade enzimática. 7

8 TRANSAMINASES As transaminases são enzimas intracelulares que permitem a transferência de grupos amina de α-aminoácidos para α-cetoácidos (reacções de transaminação). Pertencem à classe das transferases. Têm como coenzima o piridoxal-fosfato (vitamina B6). A constante de equilíbrio para a maior parte das transaminações é próxima da unidade, o que significa que estas reacções são reversíveis. Cada transaminase é específica para um par aminoácido/cetoácido. Acção da transaminase glutâmico-oxalacética ou aspartato aminotransferase (TGO/ASAT): Ácido aspártico + ácido α-cetoglutárico ácido oxalacético + ácido glutâmico (HOOC-C-CNH2-COOH + HOOC-C-C-CO-COOH HOOC-C-CO-COOH + HOOC-C-C-CNH2-COOH) Acção da transaminase glutâmico pirúvica ou alanina amino-transferase (TGP/ALAT): Alanina + ácido α-cetoglutárico ácido pirúvico + ácido glutâmico (CH3-CNH2-COOH + HOOC-C-C-CO-COOH CH3-C-CO -COOH + HOOC-C-C-CNH2-COOH As transaminases têm um papel importante nas reacções reversíveis de transferência de grupos amina entre pares de α-amino-/α-ceto-ácido, sendo fundamentais na transferência de grupos amina para outros intermediários transportadores e na sua eliminação. São enzimas intracelulares: a TGP é citoplasmática e a TGO é citoplasmática e mitocondrial. As transaminases existem em quantidades mínimas no sangue de um indivíduo normal, sendo a concentração da TGO superior à da TGP. São enzimas indicadoras de lesão/morte celular: após destruição celular extensa, os seus níveis aumentam significativamente no plasma. 8

9 Existem na maior parte das células, mas surgem em quantidades importantes nas células hepáticas, cardíacas, musculares e pulmonares. A lesão celular nestes orgãos leva ao aumento da actividade plasmática destas enzimas, como acontece, por exemplo, nos quadros de hepatite, enfarte de miocárdio, miosite ou embolia pulmonar. 9

10 Fundamento da técnica de determinação da actividade das TGO e TGP pelo método de Reitman e Frankel As enzimas TGP e TGO catalizam a conversão do ácido α-cetoglutárico em ácido glutâmico (ambas) e de alanina em ácido pirúvico e ácido aspártico em ácido oxalacético (respectivamente). Os cetoácidos formados (oxaloacetato e piruvato) reagem com a 2,4-dinitrofenilhidrazina, formando hidrazonas cetoácidas. Estas, após adição de hidróxido de sódio, produzem uma intensa cor acastanhada, cuja intensidade é proporcional à concentração dos cetoácidos que lhes deram origem, o que permite a sua detecção e quantificação por espectrofotometria de absorção do visível. Valores normais: TGP: < 12 U/l ; TGO: < 12 U/l 10

11 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II, Mestrado Integrado em MEDICINA, 2010/2011 PROTOCOLO DE BANCADA - 3ª AULA PRÁTICA Grupos 1 a 4 Determinação da amoniémia: MÉTODO ENZIMÁTICO (GLUTAMATO DESIDROGENASE, GLDH) CAL (Padrão de amónia) 294 µmol/l ou 5 µg/ml ou 0,5 mg/dl Reagente 1a NADPH 0,26 mm α-cetoglutarato 3,88 mm Reagente 1b Tampão (contém AZIDA DE SÓDIO) Trietanolamina 0,15 M, ph 8,6 Reagente 1 - Solução de trabalho Reconstituir o conteúdo de R1 a com 5ml de R1 b estável durante 3 semanas a 2-8 ºC, protegido de contaminação bacteriana. Reagente 2 GLDH 1200 U/ ml Amostra: plasma obtido de sangue venoso, colheita em Heparina ou EDTA, colocado em gelo (4ºC), imediatamente à colheita. O plasma deve ser separado até 30 minutos após a colheita e mantido a 2-8 ºC. O ensaio deve ser realizado até um máximo de 2 horas após a colheita. 1. Preparar os tubos da amostra, branco e padrão Amostra Branco Padrão CAL (Padrão) µl Amostra 100 µl - - H 2 O µl - Reagente 1 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Misturar e esperar, protegendo de contaminação bacteriana, durante 5 minutos. Acertar o zero com uma cuvette vazia e registar o valor inicial de DO (1) DO 1 (340 nm) Reagente 2 10 µl 10 µl 10 µl Misturar e incubar durante 5 minutos. Registar o valor final de DO (2) DO 2 (340 nm) DO (DO 1 -DO 2 ) Cálculo da amoniémia: DO amostra - DO branco DO padrão - DO branco x [padrão] (µmol/l, µg/ml ou mg/dl) VALORES NORMAIS (deste método): Plasma: 10,0 47,0 µmol/l ou 0,17 0,80 µg/ml 1

12 ou 0,017 0,080 mg/dl Linearidade: O método é linear até uma concentração de 1180 µmol/l (20 µg/ml, 2 mg/dl). Acima deste valor, as amostras deverão ser diluídas (1:2) com NaCl 0,9% e multiplicar o resultado por 2. NOTAS IMPORTANTES SOBRE A AZIDA DE SÓDIO: - Evite ingerir ou o contacto com a pele ou mucosas. - No caso de contacto com a pele, lave imediatamente com bastante água. - No caso de contacto com os olhos e se ingerido, dirija-se ao Centro de Saúde ou Hospital mais próximo. - A azida de sódio reage facilmente com o chumbo ou cobre dos lavatórios/superfície de metal e forma compostos de azida altamente explosivos. - Os tubos contendo azida de sódio devem ser colocados em contentor próprio para resíduos perigosos. - Em caso de derrame, as superfícies de metal deverão ser lavadas com uma solução de 10% de hidróxido de sódio (NaOH) para descontaminação. 2

13 DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE PLASMÁTICA DE TRANSAMINASES (TGO/TGP) Grupos 1 e 2- Determinação de TGO (GOT ou AST): ácido aspártico + ácido α-cetoglutárico ácido oxalacético + ácido glutâmico Solução 1 ou tampão tampão fosfato 100 mm, ph 7,4; L-aspartato 100 mm, α- oxoglutarato ou cetoglutarato 2 mm Solução 2 2,4-dinitrofenilhidrazina 2 mm Tubo Branco Tubo Amostra Amostra Solução 1 H 2 O destilada ,5 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,5 ml Misturar e incubar durante 30 min, a 37 ºC Solução 2 0,5 ml 0,5 ml Misturar e deixar repousar durante aproximadamente 20 min, a ºC NaOH (0,4 M) 5,0 ml 5,0 ml Lêr a absorvância da amostra contra o branco após 5 minutos, a 546 nm. Grupos 3 e 4 Determinação de TGP (GPT ou ALT): alanina + ácido α-cetoglutárico ácido pirúvico + ácido glutâmico Solução 1 ou tampão tampão fosfato 100 mm, ph 7,4; L-alanina 200 mm, α-oxoglutarato ou cetoglutarato 2 mm Solução 2 2,4-dinitrofenilhidrazina 2 mm Tubo Branco Tubo Amostra Amostra Solução 1 H 2 O destilada ,5 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,5 ml Misturar e incubar durante 30 min, a 37 ºC Solução 2 0,5 ml 0,5 ml Misturar e deixar repousar durante aproximadamente 20 min, a ºC NaOH (0,4 M) 5,0 ml 5,0 ml Ler a absorvância da amostra contra o branco após 5 minutos, a 546 nm. 3

14 ANÁLISE DOS RESULTADOS (TGP e TGO): Os resultados obtêm-se a partir de uma curva padrão (usar os valores na tabela seguinte para cada um dos gráficos respectivos) e expressam-se em U/l (U = nº de nmol de substrato transformados por minuto). TGP Absorvância 0,025 0,050 0,075 0,100 0,125 0,150 0,175 0,200 0,225 0,250 0,275 0,300 0,325 0,350 0,375 0,400 0,425 0,450 0,475 0,500 U/l TGO Absorvância 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070 0,080 0,090 0,100 0,110 0,120 0,130 0,140 0,150 0,160 0,170 U/l VALORES NORMAIS: TGP < 12 U/l e TGO < 12 U/l 4