UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA DAYSE SANTOS ALMEIDA CASSIANO ESTUDO BIOGUIADO ATRAVÉS DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E DA ANÁLISE POR CLAE-DAD E CLAE-DAD-EM/EM DE Ocotea spp. (LAURACEAE) Feira de Santana, BA 2014

2 DAYSE SANTOS ALMEIDA CASSIANO ESTUDO BIOGUIADO ATRAVÉS DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E DA ANÁLISE POR CLAE-DAD E CLAE-DAD-EM/EM DE Ocotea spp. (LAURACEAE) Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Alexsandro Branco Feira de Santana, BA 2014

3 Ao Criador, Deus

4 AGRADECIMENTOS A Deus pela proteção ininterrupta e por renovar minhas forças em cada nova fase da minha vida. Ao meu querido esposo Nadson pelo amor, compreensão, apoio e incentivo. Aos meus pais, Nita e Nivaldo e as minhas irmãs Dayane e Daysyane pelo amor e carinho mesmo estando longe. Ao meu orientador, Prof. Alexsandro Branco (UEFS) por mais uma vez ter acreditado e confiado em mim. À Profª Rosilene Moretti Marçal (UFS) por ceder seu laboratório e sempre estar disposta a me ensinar. Ao Prof. Jorge M. David (UFBA) por facilitar a utilização do laboratório de Produtos Naturais e pelo carinho com que me recebeu. Aos amigos do laboratório de fitoquímica da UEFS pelo convívio e amizade. Às minhas secretárias Patrícia e Isabela que me deram uma mãozinha no final do doutorado. Aos novos amigos que fiz na UFBA. Aos amigos de Feira de Santana e Salvador, especialmente ao casal Valéria e Juninho, às amigas Ingrid e Mona Lisa, ao casal Avelino e Lídia e ao meu tio Erivaldo que me cederam um lugarzinho em suas casas no período em que estive em Feira de Santana e Salvador. Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBiotec) pela oportunidade e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudo.

5 Até os jovens se cansam e ficam exaustos, e os moços tropeçam e caem; mas os que esperam no Senhor, renovam as suas forças. Voam alto como águias; correm e não se cansam, caminham e não se fatigam. (Isaías 40:30 e 31)...De cada lado do rio estava a árvore da vida... E as suas folhas servirão para a cura das nações (Apocalipse 22:2)

6 RESUMO A família Lauraceae é constituída por 52 gêneros dentre os quais o gênero Ocotea Aubl. se destaca devido ao grande número de espécies de elevada importância econômica. O presente trabalho teve como principal objetivo realizar um estudo bioguiado pelo ensaio in vitro de avaliação da atividade anticolinesterásica a partir de espécies de Ocotea ainda não estudadas e disponíveis no semiárido baiano. Os extratos em diclorometano de O. pomaderroides (EDiOPom), O. percoriacea (EDiOPer), O. spixiana (EDiOS), e Ocotea sp. (EDiOsp) inibiram a atividade acetilcolinesterásica em 71,86; 92,09; 74,45 e 77,74%, respectivamente. Os extratos hexânicos: EHexOPom, EHexOPer e EHexOsp apresentaram atividade anticolinesterásica de 92,18; 83,28 e 86,72%, respectivamente e os extratos em acetato de etila: EAcOPOm e EAcOsp inibiram a ação da acetilcolinesterase em 74,25 e 76,19%. Os extratos EDiOPom e EDiOPer foram fracionados por cromatografia em coluna de sílica gel e as frações obtidas também foram submetidas a avaliação da atividade anticolinesterásica. As frações 4/5 (obtida de EDiOPom), 5/6 (proveniente de EDiOPer) e 10/7 (obtida de 5/6) demonstraram atividade anticolinesterásica de 89,03; 87,23 e 99,94%, respetivamente, comparável ao padrão eserina que inibiu a atividade da enzima em 94,35%. As frações ativas 4/5, 5/6 e 10/7 possuem, portanto, elevado potencial como produto biotecnológico com potente atividade acetilcolinesterásica. As análises do perfil químico por CLAE- DAD e CLAE-DAD-EM/EM dos extratos mais ativos revelaram a presença de flavonoides glicosilados derivados da quercetina e do canferol, além de flavonoides di-cumaroil glicosilados como substâncias majoritárias presentes nas amostras testadas. A partir da fração 5/5 (obtida de EDiOPom) foi possível isolar o β-sitosterol, identificado por RMN de 1 H e 13 C. Este trabalho descreve pela primeira vez estudos químicos e biológicos realizados com as espécies Ocotea pomaderroides, O. percoriacea e O. spixiana. Palavras-chave: Lauraceae. Ocotea. Atividade anticolinesterásica. Flavonoides glicosilados acilados.

7 ABSTRACT The Lauraceae family consists of 52 genera among which the Ocotea Aubl. genus stands out due to the large number of species of high economic importance. The present work aimed to carry out a study in vitro bio-guided assay, evaluating the acetylcholinesterase inhibitory activity from Ocotea species not yet studied and available in Bahia State's Semi-arid region. The dichloromethane extracts of Ocotea pomaderroides (EDiOPOm), O. percoriacea (EDiOPer), O. spixiana (EDiOS) and Ocotea sp. (EDiOsp) inhibited the acetylcholinesterase activity in 71.86; 92.09; and %, respectively, for 30 minutes. The hexane extracts: EHexOPom, EHexOPer and EHexOsp showed acetylcholinesterase inhibitory activity of 92.18; and 86.72%, respectively, and the extracts in ethyl acetate: EAcOPOm and EAcOsp inhibited the action of acetylcholinesterase in and 76.19%. The EDiOPom and EDiOPer extracts were fractionated by chromatography on silica gel column and the fractions obtained were also submitted to the evaluation of anticholinesterase activity. Fractions 4/5 (obtained from EDiOPom), 5/6 (obtained from EDiOPer) and 10/7 (obtained from 5/6) showed anticholinesterase activity of 89.03; and 99.94%, respectively, comparable to the standard eserine that inhibited the enzyme activity in 94.35%. The active fractions 4/5, 5/6 and 10/7 have therefore high potential as biotechnological products with potent anticholinesterase activity. The chemical analysis of the profile by HPLC-DAD and HPLC-DAD-MS/MS of the most active extracts revealed the presence of flavonoids glycosides derived from quercetin and kaempferol, as well as di-cumaroil glycosides flavonoids as major compounds present in the samples tested. From the fraction 5/5 (obtained from EDiOPom) it was possible to isolate the β-sitosterol, identified by 1 H and 13 C NMR. This study describes, for the first time, chemical and biological studies with Ocotea pomaderroides, O. percoriacea and O. spixiana species. Keywords: Lauraceae. Ocotea. Acetylcholinesterase inhibitory activity. Acylated glycosides flavonoids.

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Figura 2 Estruturas dos principais terpenos encontrados em óleos essenciais de espécies de Ocotea Principais tipos de sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea Figura 3 Sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea 26 Figura 4 Compostos fenólicos encontrados em espécies de Ocotea 29 Figura 5 Lignanas descritas em espécies de Ocotea 30 Figura 6 Principais tipos de neolignanas encontradas em espécies de Ocotea Figura 7 Alcaloides encontrados em espécies de Ocotea 32 Figura 8 Flavonoides encontrados em espécies de Ocotea 33 Figura 9 Inibidores da acetilcolinesterase utilizados para o tratamento de DA Figura 10 Espécies de Ocotea coletadas no semiárido baiano 40 Figura 11 Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOPer e espectros no UV 65 Figura 12 Estrutura química geral dos flavonoides 67 Figura 13 Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOsp e espectros no UV 69 Figura 14 Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOPer e espectros no UV Figura 15 Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOsp e espectros no UV 72 Figura 16 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPom e espectro no UV 73 Figura 17 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPer e espectros no UV 74 Figura 18 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOS e espectros no UV 75 Figura 19 Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOsp e espectros no UV 76 Figura 20 Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOPom e espectros no UV 79 Figura 21 Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOsp e espectros no UV 81 Figura 22 Cromatogramas por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5 e espectros no UV Figura 23 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 3/6 e espectros no UV 86 Figura 24 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 4/6 e espectros no UV 87 Figura 25 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/6 e espectros no UV 88 Figura 26 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/6 e espectros no UV 89 Figura 27 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/7 e espectro no UV 91 Figura 28 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/7 e espectros no UV

9 Figura 29 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 7/7 e espectros no UV 93 Figura 30 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 8/7 e espectros no UV 95 Figura 31 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 9/7 e espectros no UV 97 Figura 32 Figura 33 Figura 34 Figura 35 Figura 36 Figura 37 Figura 38 Figura 39 Figura 40 Cromatograma por CLAE-DAD da fração 10/7 e espectros no UV Cromatograma por CLAE-DAD da fração 11/7 e espectros no UV Cromatograma por CLAE-DAD da fração 12/7 e espectros no UV Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPom Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPer Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOS Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOsp Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOPom Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOsp LISTA DE QUADROS Quadro 1 Estado de conservação das espécies de Ocotea, segundo as categorias descritas na Lista Vermelha da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (sigla em inglês, IUCN). 22 Quadro 2 Rota biossintética dos fenilpropanoides 28 Quadro 3 Reação de Ellman 63

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Tabela 2 Massa total (g) e rendimento (%) dos extratos etanólicos obtidos a partir dos processos de moagem e da extração por maceração Massa total (g) das partições obtidas a partir dos extratos etanólicos brutos Tabela 3 Fracionamento de EDiOPom (CC 5) 45 Tabela 4 Fracionamento de 4/5 (CC 10) 46 Tabela 5 Fracionamento de 5/5 (CC 9) 47 Tabela 6 Fracionamento de 6/5 (CC 8) 47 Tabela 7 Fracionamento de EDiOPer (CC 6) 49 Tabela 8 Fracionamento de 5/6 (CC 7) 50 Tabela 9 Tabela 10 Tabela 11 Tabela 12 Tabela 13 Tabela 14 Tabela 15 Tabela 16 Tabela 17 Tabela 18 Tabela 19 Tabela 20 Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas das colunas cromatográficas 5 (EDiOPom), 6 (EDiOPer) e 7 (Fr 5/6 de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOPer Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOsp Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EHexOPer Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EDiOPom, EDiOPer e EDiOS Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EDiOsp Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EAcOPom Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EAcOsp Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 3/6 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 4/6 Tabela 21 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por

11 Tabela 22 Tabela 23 Tabela 24 Tabela 25 Tabela 26 Tabela 27 Tabela 28 Tabela 29 Tabela 30 Tabela 31 Tabela 32 Tabela 33 CLAE-DAD da fração 5/6 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 6/6 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 6/7 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 7/7 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 8/7 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 9/7 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 10/7 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 11/7 Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD da fração 12/7 Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos diclorometano de espécies de Ocotea Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea pomaderroides Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea sp. Dados dos espectros de RMN de 13 C [300 MHz, CDCl 3, δ (ppm)] do β-sitosterol isolado de EDiOPom e valores da literatura

12 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Gráfico 2 Gráfico 3 Gráfico 4 Gráfico 5 Gráfico 6 Gráfico 7 Gráfico 8 Gráfico 9 Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos etanólicos brutos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos hexânicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em diclorometano de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em acetato de etila de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos butanólicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos aquosos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPom nos tempos 30 e 60 min Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPer nos tempos 30 e 60 min Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de 5/6 (proveniente de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min

13 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea pomaderroides 48 Esquema 2 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea percoriacea 51 Esquema 3 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea notata 52 Esquema 4 Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea sp. e Ocotea spixiana 52 LISTA DE ANEXOS Anexo 1 Anexo 2 Anexo 3 Anexo 4 Anexo 5 Anexo 6 Anexo 7 Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 4/5 (EDiOPom) Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 5/6 (EDiOPer) Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 10/7 (EDiOPer) Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom Ampliação 1 do espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom Ampliação 2 do espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom Espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom Anexo 8 Ampliação 1 do espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom Anexo 9 Ampliação 2 do espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom Anexo 10 Ampliação 3 do espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom

14 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS AcOEt Acetato de etila CC Cromatografia em coluna CCD Cromatografia em camada delgada CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos CLAE-EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas DAD Detector de arranjo de diodo EtOH Etanol Gal Galactose Glu Glicose Hex Hexano m/z Relação massa carga MeOH Metanol nm Nanômetros RMN Ressonância magnética nuclear RMN de 13 C Ressonância magnética nuclear de carbono-13 RMN de 1 H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio t R UEFS UFBA UV Xyl δ λ máx Tempo de retenção Universidade Estadual de Feira de Santana Universidade Federal da Bahia Ultravioleta xilose Deslocamento químico em ppm Comprimento de onda (nm) de absorção máxima

15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO DA LITERATURA FAMÍLIA LAURACEAE O GÊNERO Ocotea E SUA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO GÊNERO Ocotea Terpenos Fenilpropanoides e derivados Lignanas Neolignanas Alcaloides Flavonoides ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO GÊNERO Ocotea ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E DOENÇA DE ALZHEIMER 3 OBJETIVOS GERAIS ESPECÍFICOS 38 4 MATERIAIS E MÉTODOS COLETA E IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA OBTENÇÃO DOS EXTRATOS E PARTIÇÕES ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA ESTUDO QUÍMICO BIOGUIADO Procedimentos experimentais gerais Fracionamento dos extratos bioativos 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES DE ESPÉCIES DE Ocotea 53

16 5.2 FRACIONAMENTO BIOGUIADO E ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DAS FRAÇÕES ANÁLISE POR CLAE-DAD DOS EXTRATOS BIOATIVOS ANÁLISE POR CLAE-DAD DAS FRAÇÕES BIOATIVAS ANÁLISE POR CLAE-DAD-EM/EM DOS EXTRATOS BIOATIVOS CONCLUSÕES 126 REFERÊNCIAS 127 ANEXOS 137

17 1 INTRODUÇÃO Os estudos sobre a composição química de extratos de plantas medicinais são bastante comuns. No entanto, numa investigação fitoquímica com o objetivo de se isolar os princípios ativos de uma planta, a escolha de uma espécie pode ser bastante difícil devido à grande quantidade de plantas existente no planeta, sendo que a maioria é desconhecida sob o ponto de vista científico (HOSTETTMANN et al., 2003). Várias abordagens para a seleção de espécies vegetais têm sido apresentadas na literatura, dentre elas, três tipos são alvo de maiores investigações: a) abordagem randômica escolha da planta sem qualquer critério, tendo como fator determinante a sua disponibilidade; b) abordagem quimiotaxonômica seleção da espécie correlacionada com a ocorrência de uma dada classe química de substância em um gênero ou família; c) abordagem etnofarmacológica seleção da espécie de acordo com o uso terapêutico evidenciado por um determinado grupo étnico (MACIEL et al., 2002). A abordagem randômica é a menos utilizada devido à demora que este método pode proporcionar ao processo de descoberta de uma planta que apresente considerável atividade biológica tendo a espécie sido escolhida ao acaso. Dentre os diferentes critérios de seleção, a quimiotaxonomia ou ciência da classificação das plantas em função de seus constituintes químicos pode conduzir a informações importantes uma vez que algumas classes de substâncias são características de uma família botânica ou mesmo de um gênero (HOSTETTMANN et al., 2003). Segundo Giordani et al. (2008), ao considerar as informações botânicas e quimiotaxonômicas, a escolha das plantas a serem investigadas torna-se mais selecionada. Como estratégia para investigação de plantas medicinais, a abordagem etnofarmacológica consiste em combinar informações adquiridas junto a comunidades locais que fazem uso da flora medicinal com estudos químicos/farmacológicos realizados em laboratórios especializados. O método etnofarmacológico permite a formulação de hipóteses quanto à(s) atividade(s) farmacológica(s) e à(s) substância(s) ativa(s) responsáveis pelas ações terapêuticas 17

18 relatadas pelas populações usuárias (ELIZABETSKY e SOUZA, 2007). Tanto a pesquisa bibliográfica como a informação popular servem de base para a indicação da atividade farmacológica. Historicamente, a maioria das plantas medicinais foi introduzida nas primeiras farmacopéias por sua ação terapêutica (LAPA et al., 2003). A combinação da abordagem quimiossistemática e etnofarmacológica torna ainda mais acertado o método de escolha da espécie a ser estudada. Além disso, a utilização de técnicas direcionadas para o isolamento de substâncias químicas ou frações de extratos de plantas através de screening, seguido de prospecção direcionada por bioensaio, também conhecida como estudo químico de plantas medicinais orientado pela análise biológica (CALIXTO, 2001) ou estudo bioguiado, são essenciais para a obtenção de bons resultados com uma relação interessante de custo-benefício. Essa relação de benefício é vista através da redução de tempo e menor gasto de materiais, quando comparado a outros modelos descritos na literatura, pois durante o isolamento e seleção dos compostos, estes são monitorados diretamente pela atividade biológica de interesse (HAMBURGER e HOSTETTMANN, 1991; MARTINEZ et al., 1996; RITCH-KRC et al., 1996). Desta forma, estudos com espécies inativas para determinada atividade farmacológica podem ser descontinuados ou direcionados para outros testes biológicos. O progresso da biologia celular e da farmacologia molecular, nas últimas décadas, deu um impulso importante para o desenvolvimento de testes biológicos baseados nos mecanismos de ação de algumas doenças. Quando as causas de uma doença são conhecidas, é possível agir diretamente sobre os receptores ou em mecanismos enzimáticos envolvidos na patologia (HAMBURGER e HOSTETTMANN, 1991). Um alvo interessante e atualmente bastante explorado é a inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), que pode ser utilizada para atenuar o desenvolvimento da doença de Alzheimer, a qual é responsável pela maioria dos casos de demência na terceira idade (FULTON e BENFIELD, 1996). Através do uso popular, várias plantas têm sido utilizadas para o tratamento de desordens cognitivas, incluindo doenças neurodegenerativas e diversas desordens neurológicas. Abordagens etnofarmacológicas e estudos bioguiados têm conduzido a identificação de inibidores potenciais da enzima AChE a partir de recursos vegetais. Muitos métodos para screening de inibidores da AChE provenientes de 18

19 plantas são baseados na reação de Ellman utilizando a determinação espectrofotométrica através da cromatografia em camada delgada e ensaios em microplacas (MUKHERJEE et al., 2007). Na busca por novos fármacos, os produtos naturais destacam-se pela diversidade estrutural e, assim, as plantas são candidatas importantes para screening de novos compostos bioativos. Ao considerar as informações etnofarmacológicas, botânicas e quimiotaxonômicas, a seleção das plantas a serem investigadas torna-se mais elaborada (GIORDANI et al., 2008). Considerando esse conjunto de fatores, o gênero Ocotea da família Lauraceae, particularmente, desponta como uma fonte promissora de novas substâncias bioativas, justificando a avaliação química e farmacológica das espécies presentes no Brasil, especificamente disponíveis na região do semiárido baiano. 19

20 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 FAMÍLIA LAURACEAE A família Lauraceae é constituída por 52 gêneros e aproximadamente 3000 espécies que compreendem árvores e arbustos e se distribuem geograficamente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente na Ásia e América, sendo que no Brasil ocorrem 25 gêneros e cerca de 400 espécies (WERFF e RICHTER, 1996; TAKAKU et al., 2007; SOUZA e LORENZI, 2005) Espécies desta família apresentam vários grupos de metabólitos secundários, em sua maioria, compostos aromáticos, que possuem relevância significativa para classificação quimiotaxonômica em Lauraceae (BATISTA et al., 2010). A presença de alcaloides ou lignoides, por exemplo, é uma característica marcante da família Lauraceae, uma vez que estas classes de metabólitos secundários são muito exploradas e estudadas farmacologicamente por apresentarem efeitos biológicos importantes (ELDEEN et al., 2005; ZANIN e LORDELLO, 2007; MORAIS et al., 1998). A família Lauraceae também possui grande relevância dentre as demais famílias pela sua importância econômica. Algumas espécies têm sido utilizadas na culinária e na medicina popular, na marcenaria e construção civil, na fabricação de papel, na indústria de perfumaria e indústria química. Dentre os muitos gêneros pertencentes a esta família, o gênero Ocotea Aubl. merece um especial destaque devido ao grande número de espécies que são utilizadas para diferentes fins (MARQUES, 2001a). 20

21 2.2 O GÊNERO Ocotea E SUA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA O gênero Ocotea é um dos maiores da família Lauracea, possuindo cerca de 350 espécies, entre árvores e arbustos, distribuídas na América tropical e subtropical, desde o México até a Argentina, com poucas espécies na África e em Madagascar e ausentes na Ásia (ROHWER et al., 1993; QUINET, 2008). Algumas espécies deste gênero, como a O. porosa ( imbuia ) e O. odorifera ( sassafrás ) possuem grande importância econômica pela produção de madeira de lei de excelente qualidade para a construção civil e naval (SOUZA e LORENZI, 2005). Devido à curta viabilidade das sementes, frutificação errática e crescimento lento, a dificuldade de propagação associada à extração de madeira tem levado à extinção muitas espécies de Ocotea, razão pela qual são encontrados na literatura vários estudos de cultura de tecidos in vitro para o gênero (FUNASAKI et al., 2009; PELEGRINI et al., 2011; HANAI et al., 2010). Outro fator que contribuiu para o risco de extinção de algumas espécies, principalmente O. odorifera, foi a grande exploração na década de 90 do óleo de sassafrás, rico em safrol que é um metabólito secundário de alto valor comercial, utilizado como matéria-prima para síntese de vários produtos na indústria de fármacos, inseticidas piretróides e perfumes (RIVA et al., 2011). O quadro 1 categoriza as espécies de Ocotea presentes na lista vermelha elaborada pelo Órgão Internacional que discrimina o estado de conservação da natureza. 21

22 Quadro 1: Estado de conservação das espécies de Ocotea, segundo as categorias descritas na Lista Vermelha da União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (sigla em inglês, IUCN). EXTINTO AMEAÇADA BAIXO RISCO Extinto Extinto na natureza Criticamente em perigo Em perigo Vulnerável Dependente de conservação Quase ameaçada Pouco preocupante O. aciphylla X O. argylei X O. basicordatifolia X O. benthamiana X O. clarkei X O. cymbarum X O. foetens X O. gabonensis X O. glaucosericea X O. harrisii X O. jorge-escobarii X O. kenyensis X O. lancilimba X O. langsdorffii X O. monteverdensis X O. otuzcensis X O. pachypoda X O. porosa X O. pretiosa X O. puberula X O. raimondii X O. rivuralis X O. robertsoniae X O. rotundata X O. rugosa X O. staminoides X O. uxpanapana X O. viridiflora X Fonte: IUCN

23 A prospecção tecnológica para o gênero em estudo foi realizada em fevereiro de 2014 nos bancos públicos de patentes nacional e europeu, Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) e European Patent Office (EPO), respectivamente. No INPI apenas uma patente foi encontrada para o gênero Ocotea, referente aos óleos essenciais para controle de pragas à base de O. odorifera e Eucalyptus viminalis (APC, 2013). As patentes depositadas no EPO são referentes a uma composição para inibição de fibrose (NIPPON, 2013), uma composição para uso externo (LION, 2001), a utilização da madeira e seus extratos com atividade inseticida e repelente (CNRS, 2001), alcaloides do gênero utilizados para o alívio da ansiedade (FERRARI e CASAGRANDE, 1975), método de extração de alcaloides (CASAGRANDE, 1973), alcaloides do gênero (SIPHAR, 1969a; 1969b) e produção de derivados metilenodioxifenil (FMC, 1960). 2.3 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO GÊNERO Ocotea Estudos fitoquímicos prévios tem evidenciado a presença de lignanas, neolignanas, alcaloides benzilisoquinolínicos e aporfínicos, fenilpropanoides, flavonoides e sesquiterpenos, além de uma variedade de monoterpenos presentes nos óleos essenciais (CHAVEZ et al., 1995; FARAGO et al., 2005) Terpenos A composição química dos óleos essenciais de várias espécies de Ocotea já foi descrita, revelando a presença de uma grande diversidade de monoterpenos, com predominância de α-pineno (M1) e β-pineno (M2), além dos sesquiterpenos β- cariofileno (S1) e germacreno-d (S2) (TAKAKU et al., 2007; GARRETT et al., 2010; FARAGO et al., 2010) (Figura 1). 23

24 Figura 1: Estruturas dos principais terpenos encontrados em óleos essenciais de espécies de Ocotea M1 M2 S1 S2 Também foram encontrados em extratos de folhas e cascas de espécies de Ocotea outros sesquiterpenos, principalmente com esqueletos eudesmânicos (I), calamenênicos (II) e cadinânicos (III) (CHAVEZ et al., 1995; DAVID e YOSHIDA, 1998; LORDELLO et al., 2000) (Figura 2). 24

25 Figura 2: Principais tipos de sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea I II V III IV O sesquiterpeno aromático (1R*, 4S*)-7-hidroxicalameneno (S3) foi isolado das folhas de O. elegans (BATISTA et al., 2010) e O. corymbosa (DAVID e YOSHIDA, 1998). Dos frutos verdes de O. corymbosa também foram isolados os sesquiterpenos eudesmânicos (1S*,4S*,5R*,7R*,10R*)-10-desmetil-1-metil-11- eudesmano (S4), (1S*,4R*,5R*,7R*,10R*)-10-desmetil-10-hidroxi-1-metil-3-oxo-11- eudesmano (S5) e (5R*,7R*)-10-desmetil-1-metil-1,10-dioxo-1,10-seco-11- eudesmano (S6) (CHAVEZ et al., 1995) (Figura 3). 25

26 Figura 3: Sesquiterpenos encontrados em espécies de Ocotea S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S16 S14 S15 26

27 A partir das cascas de O. pulchella foram isolados os sesquiterpenos eudesmânicos 11-eudesmen-4α-ol (S7) e 4-furanoeudesmen-6-ona (S8) (BOTEGA et al., 1993) (Figura 3). Recentemente, sesquiterpenos do tipo eremofilano (IV) foram descritos em Ocotea pela primeira vez por Camargo et al. (2013) que isolaram das folhas de O. lancifolia sete sesquiterpenos eremofilanos: ácido 4β,5β,7β-eremofil-9-en-12-oico (S9); ácido 4β,5β,7β-eremofil-1(10)-en-12-oico (S10); ácido 4β,5β,7β-eremofil-1(10)- en-2-oxo-12-oico (S11); 4β,5β,7β-eremofil-9-en-12,8α-olido (S12); 4β,5β,7β-eremofil- 9-en-12,8β-olido (S13); ácido 4β,5β,7β-eremofilan-9α,10α-epóxi-12-oico (S14); 4β,5β,7β-eremofil-11-en-10α-ol (S15) e um sesquiterpeno aromadendreno (V), espatulenol (S16), o qual já havia sido descrito em Ocotea catharinensis (FUNASAKI et al., 2009) (Figuras 2 e 3) Fenilpropanoides e derivados De ocorrência muito frequente em Ocotea, os fenilpropanoides quase sempre estão presentes nas frações voláteis obtidas de troncos e folhas, junto com mono e sesquiterpenos (CHAVEZ et al., 1995). São normalmente do tipo alil ou propenilfenóis, cujo precursor básico é o aminoácido L-fenilalanina que, através de uma série de transformações que incluem a formação do ácido cinâmico, resulta na formação de aldeídos, alcoóis e finalmente dos alil e propenilfenóis (FUNASAKI, 2006) (Quadro 2). 27

28 Quadro 2: Rota biossintética dos fenilpropanoides Fonte: Adaptado de DEWICK, 2002; BARROS, O fenilpropanoide mais comum no gênero é o safrol (F1), principal constituinte do óleo de sassafrás obtido de Ocotea odorifera, O. pretiosa e O. fragrantissima, de grande valor industrial (FUNASAKI, 2009) (Figura 4). Do extrato etanólico de O. cymbarum foram obtidos os derivados alilfenóis: apiol (F2); dilapiol (F3); 4-hidroxi-2,3,5-trimetoxialilbenzeno (F4) e apioglicol (F5) (ANDREI et al., 1988). Um éster metílico do ácido 4-O-E-cafeoilquínico (F6) foi isolado das folhas de O. corymbosa (BATISTA et al., 2010) (Figura 4). 28

29 Figura 4: Compostos fenólicos encontrados em espécies de Ocotea F1 F5 F2 R 1 R 2 =CH 2, R 3 =Me F3 R 1 = Me, R 2 =R 3 =CH 2 F4 R 1 = R 3 =Me, R 2 =H F Lignanas A diversidade estrutural de lignanas (dímeros de alcoóis coniferílicos) é bastante restrita em espécies de Lauraceae (FUNASAKI, 2006). A Iangambina (L1), uma das lignanas mais conhecidas do gênero, foi obtida de O. duckei (NETO et al., 2008) e o lioniresinol (L2) foi isolado de O. cymbarum (ANDREI et al., 1988) e O. minarum (GARCEZ et al., 2005) (Figura 5). Lignanas furofurânicas também foram encontradas em O. duckei (MORAIS et al., 1996, 1998; BARBOSA-FILHO et al., 1999). Lignanas com esqueletos tetraidrofurânicos foram encontradas apenas em O. foetens (LOPEZ et al, 1995) e O. veranguensis (CROSSLEY e DJERASSI, 1962). 29

30 Figura 5: Lignanas descritas em espécies de Ocotea L1 L Neolignanas De acordo com Gottlieb (1972), as neolignanas, principalmente biciclooctânicas (VI) e benzofurânicas (VII) (Figura 6), constituem o principal grupo de metabólitos secundários da família Lauraceae, devido à elevada frequência e grande variedade de substituintes e configurações. A espécie O. porosa, conhecida popularmente como imbuia e muito utilizada no Brasil para a construção de móveis, é uma das espécies de Lauraceae mais investigadas quimicamente e apresenta uma predominância da neolignana benzofurânica porosina (AIBA et al., 1973). Também foi relatada a presença de grande diversidade de neolignanas hexaidrobenzofurânicas e biciclooctânicas nas folhas, caules e embrióides cutivados in vitro de O. catharinensis (LORDELLO, 1996; LORDELLO e YOSHIDA, 1997; HARAGUCHI et al., 1983; ISHIGE et al., 1991). 30

31 Figura 6: Principais tipos de neolignanas encontradas em espécies de Ocotea VI VII Alcaloides Além dos lignoides, os alcaloides são uma classe de metabólitos secundários de ocorrência bastante frequente em espécies de Ocotea. No entanto, foi observado dutante os levantamentos realizados até o momento que, em espécies que acumulam lignoides não foi constatada a presença de alcaloides (ZANIN e LORDELLO, 2007). A partir das cascas de O. puchella foram isolados os alcaloides benzilisoquinolínicos: 1-(p-metoxibenzoil)-6,7-metilenodioxiisoquinolina (A1); 1- (hidroxi-p-metoxibenzil)-6,7-metilenodioxiisoquinolina (A2) e seus derivados 1,2-dihidro-derivados (A3 e A4) (BOTEGA et al., 1993) (Figura 7). O alcaloide aporfínico talicminina (A5) foi obtido de O. puberula (BARALLE et al., 1973) e o alcaloide indólico triptofol-5-o-β-d-glicopiranosideo (A6) foi isolado a partir dos frutos de O. minarum (GARCEZ et al., 2005) (Figura 7). Vários alcaloides aporfínicos foram encontrados em O. macrophylla: nantenina (A7), glaucina (A8), isocordina (A9) e deidronantenina (A10) foram isolados da madeira, enquanto (S)-3-metoxi-nordomesticina (A11), (S)-Netoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (A12), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticina (A13) e (S)- N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (A14) foram obtidos do extrato etanólico do caule de O. macrophylla (PABON e CUCA, 2010) (Figura 7). 31

32 Figura 7: Alcaloides encontrados em espécies de Ocotea R 1 R 2 X A1 O O, 1,2 N A6 A2 H OH, 1,2 N A5 A3 O O NH A4 H OH NH A2 H OH, 1,2 N A7 A8 R 1 A11 H A12 COOCH 2 CH 3 A13 COH A14 COOCH 3 A9 A Flavonoides Os flavonoides são metabólitos secundários de ocorrência muito frequente no reino vegetal e também foram encontrados em espécies de Ocotea. A maioria dos flavonoides isolados até o momento são derivados das agliconas quercetina (FL1) e de di-hidroquercetina (FL2) e essa característica parece ser comum para o gênero (Figura 8). 32

33 Figura 8: Flavonoides encontrados em espécies de Ocotea FL1 FL2 FL3 R 1 =Rha FL7 R 1 =H FL4 R 2 =β-d-glu FL5 R 2 =β-d-gal FL6 R 2 =β-d-xyl FL8 R 3 = β-d-glicopiranosídeo FL9 R 4 = β-d-glicopiranosídeo FL10 R 5 = β-d-glicopiranosídeo O flavonoide (2R*, 3R*)-astibina (FL3) foi isolado das folhas de O. elegans e os flavonoides glicosilados quercetina-3-o-β-d-glicose (FL4), quercetina-3-o-β-dgalactose (FL5) e quercetina-3-o-β-d-xilose (FL6) foram encontrados nas folhas de O. corymbosa (BATISTA et al., 2010). A partir dos frutos de O. minarum foram isolados a cumarina escopoletina e os flavonoides taxifolina (FL7), quercetina-7-o-β- 33

34 D-glicopiranosídeo (FL8), eriodictiol-3 -O-β-D-glicopiranosídeo (FL9) e prunina (naringenina-7-o-β-d-glicopiranosídeo) (FL10) (GARCEZ et al. 2005) (Figura 8). 2.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DO GÊNERO Ocotea Vários extratos e substâncias isoladas de espécies de Ocotea já foram testados para diversas atividades biológicas. O alcaloide reticulina, isolado da entrecasca de O. duckei, apresentou efeito antiespasmódico (MARTIN et al., 1993), depressor do sistema nervoso central (SNC) em ratos e camundongos (MORAIS et al., 1998), ação bloqueadora neuromuscular em músculo esquelético de sapos (KIMURA et al., 1983) e efeito hipotensor em ratos normotensos (DIAS et al., 2004). A iangambina, lignana extraída de O. duckei é uma antagonista seletivo de PAF (fator de ativação plaquetária), capaz de discriminar subtipos de receptores PAF em órgão isolado de ratos (JESUS-MORAIS et al., 2000). Além disso, a iangambina demonstrou efeito de proteção contra colapso cardiovascular e choque anafilático (TIBIRICA et a., 2001), apresentou atividade antialérgica (SERRA et al., 1997), analgésica e antitumoral em células de câncer colorretal (HAUSOTT et al., 2003). A glaziovina, um dos alcaloides proaporfínicos mais importantes farmacologicamente, foi isolado pela primeira vez por Gilbert e cols. (1965) a partir da Ocotea glaziovii. A esta substância foram atribuídas propriedades ansiolítica e tranquilizante, sendo registrada com o nome comercial de Suavedol nos anos 70 como uma especialidade terapêutica do laboratório SIMES (PERÉZ et al., 2005, FERRARI e CASAGRANDE, 1975). O alcaloide bis-benzilisoquinolínico, rupununina, isolada de O. rodiaei foi patenteado em 1994 como febrífugo, contraceptivo, inibidor do crescimento de tumores, antiviral, antimitótico, agente neuroativo e ainda como pesticida (GORINSKY, 1994). O alcaloide aporfínico dicentrinona, isolado de O. leucoxyon, apresentou atividade inibitória da enzima topoisomerase I (ZHOU et al., 2000). 34

35 A neolignana biciclo[3,2,1]octânica, sibilenona, isolada do tronco da madeira de O. bullata, tem sido utilizada como medicamento tradicional na África devido à alta atividade anti-inflamatória com efeito inibitório da 5-lipoxigenase (ZSCHOCKE et al., 2000). O extrato etanólico das folhas de O. glomerata demonstrou atividade larvicida contra Aedes aegypti (LUNA et al., 2005) e antibacteriana contra cepas resistentes de S. aureus (LIMA et al., 2006). O extrato etanóico bruto obtido das cascas do caule e folhas de O. duckei apesentou atividade antimicrobiana contra 6 diferentes cepas de Staphylococcus aureus enquanto a iangambina, extraída da mesma planta, apresentou atividade antimicrobiana contra todas as cepas de Escherichia coli testadas (ANTUNES et al., 2006). O óleo essencial de O. notata apresentou atividade no ensaio de toxicidade sobre Artemia salina Leach e atividade antibacteriana contra duas cepas ATCC de Staphylococcus aureus (25923 e 9213), S. epidermidis (12223) e Enterococcus faecalis (29212) (GARRETT et al., 2007). Extratos etanólicos de galhos de Ocotea ceanothifolia, O. leucoxylon e O. minor e o extrato etanólico de folhas de O. minor apresentaram atividade anticolinesterásica no teste qualitativo utilizando cromatoplacas de camada delgada (YAMAGUCHI et al., 2012). A avaliação quantitativa da atividade anticolinesterásica dos extratos hidrometanólicos (1,0 mg/ml) das cascas frescas e estocadas de O. bullata evidenciou alta atividade com inibições de 87,1±2,63 e 84,8±3,98%, respectivamente (AMOO et al., 2012). Os óleos voláteis de folhas de O. nectandrifolia e O. puberula, coletadas nas diferentes estações do ano, foram considerados inativos para a atividade anticolinesterásica por apresentarem inibições abaixo de 40%. A ausência de atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase nos óleos das duas espécies foi atribuída aos baixos teores de monoterpenos (RAGGI, 2008), uma vez que Miyazawa et al. (1997) afirmam que os monoterpenos são os principais responsáveis pela atividade anticolinesterásica dos óleos essenciais. Apesar da grande quantidade de artigos publicados de trabalhos realizados com o gênero Ocotea, várias de suas espécies ainda não foram estudadas do ponto de vista químico e/ou biológico. Dentre elas, as espécies Ocotea pomaderroides, O. 35

36 percoriacea e O. spixiana não possuem registro na literatura de sua composição química e/ou atividade biológica. 2.5 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E DOENÇA DE ALZHEIMER A Doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa, progressiva, que afeta principalmente a população idosa, responsável por 50-60% dos casos de demência em pessoas com mais de 65 anos de idade (FRANCIS et al., 1999). Os principais sintomas associado a DA envolve deficiência orgânica cognitiva, principalmente perda de memória. Outras características associadas com os estágios avançados de DA inclui déficit na linguagem, depressão, problemas de comportamento, inclusive agitação, alterações de humor e psicose (BARBOSA FILHO et al., 2006). Dados epidemiológicos indicam um crescimento potencialmente considerável na prevalência da doença nas próximas duas décadas (JOHNSON et al., 2000). A neurotransmissão colinérgica é especialmente afetada em pacientes com a doença de Alzheimer e um dos mais promissores caminhos para tratar esta doença é aumentar o nível de acetilcolina no cérebro usando inibidores da acetilcolinesterase (AChE) (ENZ et al., 1993). Vários inibidores da AChE estão sendo investigados para o tratamento de DA. Entretanto, somente a tacrina (1, Cognex ), donezepil (2, Aricept ), rivastigmina (3, Exelon ) e galantamina (4, Reminyl ) foram aprovados pela Food and Drug Administration nos Estados Unidos (ZAROTSKY et al., 2003), e destes apenas 1, 3 e 4 são comercializados no Brasil, a preços bastante onerosos (TREVISAN e MACEDO, 2003) (Figura 9). Diante disto, a busca por métodos alternativos para o tratamento da doença de Alzheimer, como a utilização de plantas que apresentem atividade anticolinesterásica, seria de grande interesse para a população brasileira. Vários estudos têm sido realizados no Brasil com o objetivo de selecionar plantas com atividade anticolinasterase para tratamento da doença de Alzheimer (TREVISAN e MACEDO, 2003; VIEGAS Jr et al., 2004, TREVISAN et al., 2006). 36

37 Figura 9: Inibidores da acetilcolinesterase utilizados para o tratamento de DA

38 3 OBJETIVOS 3.1 GERAIS Contribuir para o conhecimento químico e biológico de espécies do gênero Ocotea do semiárido baiano, a partir do estudo bioguiado pela atividade anticolinesterásica. 3.2 ESPECÍFICOS Coletar as espécies Ocotea notata, O. pomaderroides, O. percoriacea e O. spixiana em municípios do semiárido baiano; Obter os extratos brutos e partições das espécies coletadas; Submeter os extratos brutos e partições das espécies de Ocotea a um screening para verificação da atividade anticolinesterásica; Selecionar os extratos bioativos para realização do fracionamento bioguiado; Realizar a caracterização química dos extratos, partições e frações das espécies testadas através de CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM/EM ; Identificar os principais constituintes das frações que evidenciarem atividade anticolinesterásica promissora; Correlacionar a atividade biológica e as classes de metabólitos secundários encontrados nas espécies em estudo. 38

39 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 COLETA E IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA A escolha do gênero a ser trabalhado neste estudo foi feita a partir da aborgadem quimiossistemática. As espécies foram escolhidas de acordo com a ausência de estudos químicos e biológicos relatados na literatura e disponibilidade na região do semiárido baiano. A coleta da espécie Ocotea notata (Figura 10) foi realizada no município de Morro do Chapéu ( ,9 S; ,8 W), estado da Bahia, Brasil, em março de 2009, sob supervisão da botânica Tânia R. S. Silva (UEFS). As espécies O. percoriacea, O. pomaderroides, O. spixiana e Ocotea sp. (Figura 10) foram coletadas no município de Rio de Contas (13º22 26,9 S e 41º53 27,5 W), Bahia, Brasil, em agosto de 2012, com o auxílio do botânico Francisco H. F. do Nascimento. As exsicatas das espécies coletadas encontram-se depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS) sob os números, , , e A espécie Ocotea sp. ainda não foi identificada pela possibilidade de tratar-se de uma espécie nova e endêmica da região do semiárido baiano. 39

40 Figura 10: Espécies de Ocotea coletadas no semiárido baiano A: Ocotea notata (Nees) Mez; B: Ocotea percoriacea Kosterm.; C: Ocotea pomaderroides (Meisn.) Mez; D: Ocotea sp. E: Ocotea spixiana (Nees) Mez 4.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS E PARTIÇÕES Para obtenção dos extratos etanólicos brutos, as folhas de cada espécie, separadamente, foram secas à temperatura ambiente e moídas em moinho de facas (tipo Willey). O pó seco das folhas de cada espécie foi submetido à extração por maceração em erlenmeyer com etanol (EtOH) por 5 dias e posterior filtração. Os filtrados obtidos foram concentrados em rotaevaporador rendendo os extratos etanólicos brutos de cada espécie, os quais foram submetidos a um processo de partição líquido-líquido com solventes em ordem crescente de polaridade (hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol). Uma parte de cada extrato etanólico bruto obtido foi dissolvido em H 2 O/EtOH (3:1) e com o auxílio de um funil de separação foram realizadas extrações com hexano. A fase hexânica foi coletada e concentrada em rotaevaporador rendendo o extrato hexânico. O extrato hidroetanólico foi particionado com diclorometano dando origem ao extrato diclorometânico e extrato hidroetanólico residual, o qual foi submetido a sucessivas extrações com acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (n-buoh), rendendo os extratos acetato de etila e n- 40

41 butanólico, respectivamente. Finalmente, o extrato aquoso residual foi parcialmente concentrado em rotaevaporador rendendo o extrato aquoso. Por ter sido coletada antes das demais espécies, a obtenção do extrato e partições da espécie O. notata serviu como piloto para realizações das extrações posteriores. A tabela 1 descreve a massa total do pó seco obtido de cada espécie após moagem das folhas e a massa total e rendimento dos extratos etanólicos brutos obtidos por maceração. Tabela 1: Massa total (g) e rendimento (%) dos extratos etanólicos obtidos a partir dos processos de moagem e da extração por maceração Espécies Pó seco (g) EEt (g) Rend.(%) O. notata 715,00 171,74 24,02 O. pomaderroides 890,00 245,47 27,58 O. percoriacea 2.500,00 409,37 16,37 O. spixiana 1.200,00 191,95 15,99 Ocotea sp ,00 401,38 19,20 EEt: Extrato etanóllico bruto Aproximadamente 190,00g do extrato etanólico de Ocotea sp., 100,00g dos extratos etanólicos de O. pomaderroides, O. percoriacea e O. spixiana, e 50,00g do extrato etanólico de O. notata, foram submetidos ao particionamento com solventes em ordem crescente de polaridade e as massas totais de cada partição estão descritas na tabela 2. 41

42 Tabela 2: Massa total (g) das partições obtidas a partir dos extratos etanólicos brutos Espécies EHex EDic EAc EBu* O. notata 9,82-18,99 20,30 O. pomaderroides 4,66 5,46 1,68** 49,35 O. percoriacea 5,23 6,06 51,53 78,65 O. spixiana 8,81 10,47 12,55 62,79 Ocotea sp. 14,22 5,47 56,43 111,13 EEt: Extrato etanóllico bruto, EHex: Extrato hexânico, EDic: Extrato diclorometano, EAc: Extrato acetato de etila, EBu: Extrato butanólico; *extratos pastosos; **houve perda de massa Os extratos butanólicos e aquosos não secaram completamente e permaneceram na forma pastosa. Apenas uma pequena porção destes extratos foi concentrada com o auxílio de um secador para realização dos ensaios in vitro. 4.3 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA A avaliação da atividade anticolinesterásica foi realizada conforme o método utilizado por Atta-ur-Rahman et al. (2001), com modificações. Os extratos e frações testados foram diluídos em metanol para obtenção da concentração estoque a 10mg/mL. O padrão utilizado como controle positivo foi a eserina na concentração 500µM. Numa microplaca de 96 poços foram pipetados 140µL de tampão fostato 0,1M contendo albumina bovina sérica (BSA) 0,1%, 20µL da amostra a ser testada ou do padrão e 20µL da enzima acetilcolinesterase 5U/mL diluída em tampão fosfato 0,1M. Após incubação de 15 minutos em temperatura ambiente foram adicionados 10µL de DTNB 10mM e 10µL de ACTI 75mM. As absorbâncias da reação enzimática foram obtidas a 405nm em leitor de microplacas EL800 (BioTek ) nos tempos 0; 30 e 60min logo após a adição do ACTI. O branco consistiu na substituição da amostra a ser testada por 20µL de tampão fostato 0,1M contendo albumina bovina sérica (BSA) 0,1%. Todas as amostras foram testadas em triplicata em cada experimento. 42

43 A enzima acetilcolinesterase (AChE) tipo VI-S obtida de Electrophorus electricus (enguia elétrica), iodeto de acetiltiocolina (ACTI), 5,5 -ditiobis-(ácido 2- nitrobenzóico) (DTNB ou reagente de Ellman), eserina [(-)-fisostigmina)] e o tampão fosfato 0,1M (ph 7,5) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). O cálculo da porcentagem da atividade enzimática foi feito conforme as fórmulas descritas abaixo: %A T 30 = (T 30 -T 0 ) amostra x 100/(T 30 -T 0 ) branco e %A T 60 = (T 60 -T 0 ) amostra x 100/(T 60 -T 0 ) branco, onde: %A é a porcentagem da atividade enzimática, T 0 corresponde ao tempo logo após o início da reação, T 30 corresponde ao tempo de 30 min após a primeira leitura e T 60 corresponde ao tempo de 60 min logo após a primeira leitura. Os gráficos foram plotados como atividade colinesterásica (%A) embora os dados na seção dos resultados sejam expressos como inibição da atividade colinesterásica (%I). A porcentagem de inibição da atividade colinesterásica foi calculada como 100% - %A (SANTOS et al., 2012). 4.4 ESTUDO QUÍMICO BIOGUIADO Procedimentos experimentais gerais As colunas cromatográficas (CC) foram eluídas em sílica gel 60 ( mesh, Acros Organics), sílica tipo flash (35-75 µm, Acros Organics) ou Sephadex LH-20 (Pharmacia ) e as análises cromatográficas em camada delgada (CCD) foram desenvolvidas em cromatofolhas de alumínio (Merck), visualizadas em UV (254 e 360 nm) e reveladas em iodo. 43

44 As análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector de arranjo de diodos (DAD) foram realizadas em cromatógrafo líquido Merck-Hitachi LaChrom Elite com coluna LiChrospher 100 RP-18 (150 mm X 4 mm; 5 μm). Para a fase móvel utilizou-se um gradiente de H 2 O/H 3 PO 4 0,1% (A) e MeOH (B) conforme descrito abaixo. Tempo (min) A (%) B (%) O fluxo da fase móvel e a temperatura da coluna foram de 1 ml/min e 30 C, respectivamente. Os espectros no UV foram adquiridos na faixa de 200 a 400 nm, sendo que para registro dos cromatogramas, os comprimentos de onda foram escolhidos após as análises. As análises por CLAE acoplada a espectrometria de massas (EM) foram realizadas em Espectrômetro de massas Bruker Daltonics (modelo Equire Plus 3000), com fonte de íons eletrospray (ESI) e analisador íon trap e cromatógrafo Shimadzu com coluna Phenomenex Luna C-18 (250 x 4.6 mm - 5um), Bombas LC- 20AD, Controladora CBM-20A, Detector SPD-20A e injetor automático SIL-20AC. O gradiente de solventes utilizado foi H 2 O/CH 2 O 2 0,2% (A) e ACN (B) nas seguintes condições: 0-20 min A (75-0%) e B (25-100%), min: A (0%) e B (100%), min: A (0-75%) e B (100-25%) e min: A (0%) e B (100%). A temperatura do forno da coluna e o fluxo da fase móvel foram de 40 o C e 1mL/min, respectivamente. As análises por CLAE-DAD-EM/EM e RMN de 1 H e 13 C foram realizadas na Central analítica do Instituto de Química da Universidade Federal de São Paulo (USP). Os demais procedimentos foram realizados no Laboratório de Fitoquímica da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) e Laboratório de Química de Produtos Naturais da Universidade Federal da Bahia (UFBA). 44

45 4.4.2 Fracionamento dos extratos bioativos Todos os extratos foram submetidos à análise por CLAE-DAD. Os extratos que apresentaram atividade anticolinesterásica superior ou igual a 60% de inibição da atividade da enzima foram selecionados e submetidos à análise por CLAE-DAD- EM/EM. Baseado nas análises por CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM/EM, alguns extratos bioativos foram submetidos ao fracionamento através da cromatografia em coluna (CC), eluída com misturas de solventes em ordem crescente de polaridade. As frações obtidas foram monitoradas por CCD e CLAE-DAD. O extrato diclorometano de O. pomaderroides (EDiOPom; 3,0g) foi submetido a CC de sílica gel eluída com CH 2 Cl 2, CH 2 Cl 2 /MeOH e MeOH e originou 11 frações de aproximadamente 100 ml cada. Após análise por CCD, as frações 4/5 a 6/5 e 9/5 foram submetidas à CLAE-DAD. Baseado no perfil químico evidenciado pelos cromatogramas e espectros de UV, algumas frações foram selecionadas para análise por CLAE-DAD-EM/EM (Tabela 3, Esquema 1). Tabela 3: Fracionamento de EDiOPom (CC 5) Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/5 CH 2 Cl 2 7,5 mg Reservada 2/5 CH 2 Cl 2 199,8 mg Reservada 3/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (99:1) 253,3 mg CLAE-DAD 4/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (97:3) 66,3 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 5/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (95:5) 50,7 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 6/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (9:1) 36,6 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 7/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (9:1) 600,7 mg CLAE-DAD 8/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (4:1) 68,3 mg CLAE-DAD 9/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (7:3) 113,4 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 10/5 CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) 42,9 mg Reservada 11/5 MeOH 29,8 mg Reservada 45

46 A subfração 4/5 foi submetida ao fracionamento por CC em sílica flash eluída com Hex; Hex/AcOEt e AcOEt e forneceu 20 subfrações de aproximadamente 150 ml cada. Suas subfrações foram monitoradas por CCD, unidas de acordo com a semelhança do perfil cromatográfico e submetidas à CLAE-DAD. As frações 2-3/10 e 4/10 também foram analisadas por CLAE-DAD-EM/EM (Tabela 4, Esquema 1). Tabela 4: Fracionamento de 4/5 (CC 10) Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/10 Hex/AcOEt (95:5) 10,4 mg CLAE-DAD 2-3/10 Hex/AcOEt (95:5) 2,4 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 4/10 Hex/AcOEt (95:5) 2,9 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 5-6/10 Hex/AcOEt (95:5) 1,5 mg CLAE-DAD 7/10 Hex/AcOEt (95:5) 1,4 mg CLAE-DAD 8-11/10 Hex/AcOEt (95:5) 3,7 mg CLAE-DAD 12/10 Hex/AcOEt (95:5) 1,0 mg CLAE-DAD 13-15/10 Hex/AcOEt (95:5) 3,5 mg CLAE-DAD 16/10 Hex/AcOEt (95:5) 0,9 mg CLAE-DAD 17/10 Hex/AcOEt (95:5) 0,5 mg CLAE-DAD 18/10 Hex/AcOEt (9:1) 0,4 mg CLAE-DAD 19/10 Hex/AcOEt (4:1) 17,7 mg CLAE-DAD 20/10 AcOEt 1,4 mg CLAE-DAD A subfração 5/5 foi submetida ao fracionamento por CC em sílica flash eluída com Hex; Hex/AcOEt, AcOEt e MeOH e rendeu 43 subfrações que foram monitoradas por CCD, unidas de acordo com a semelhança do perfil cromatográfico e submetidas à CLAE-DAD (Tabela 5, Esquema 1). A fração 2/9 rendeu uma substância pura que foi analisada por RMN de 1 H e 13 C. 46

47 Tabela 5: Fracionamento de 5/5 (CC 9) Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/9 Hex/AcOEt (9:1) 3,3 mg CLAE-DAD 2/9 Hex/AcOEt (9:1) 16,1 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 3/9 Hex/AcOEt (9:1) 3,4 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 4-5/9 Hex/AcOEt (9:1) 2,0 mg CLAE-DAD 6-36/9 Hex/AcOEt (1:1) 5,3 mg CLAE-DAD 37/9 AcOEt 3,7 mg CLAE-DAD 38/9 AcOEt 3,8 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 39/9 AcOEt 2,5 mg CLAE-DAD 40/9 AcOEt 2,2 mg CLAE-DAD 41/9 AcOEt 1,0 mg CLAE-DAD 42/9 AcOEt 0,7 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 43/9 MeOH 1,2 mg CLAE-DAD A subfração 6/5 foi submetida ao fracionamento por CC em Sephadex eluída com CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) e forneceu 10 subfrações de aproximadamente 100 ml cada. As subfrações foram monitoradas por CCD e unidas de acordo com a semelhança do perfil cromatográfico (Tabela 6, Esquema 1). Tabela 6: Fracionamento de 6/5 (CC 8) Frações Massa Análises realizadas 1/8 2,2 mg CLAE-DAD 2/8 3,1 mg CLAE-DAD 3/8 4,0 mg CLAE-DAD 4-8/8 15,7 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 9/8 2,4 mg CLAE-DAD 10/8 1,7 mg CLAE-DAD 47

48 Esquema 1: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea pomaderroides Folhas Secagem Moagem Pó seco EtOH EEtOPom H 2O/EtOH (3:1) Partição CLAE-DAD Teste IAchE EHexOPom EDiOPom EAcOPom EBuOPom EAqOPom CLAE-DAD Teste IAchE CC 11 CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-MS CC 5 23 Frações CCD CLAE-DAD 11 Frações CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-EM CCD CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-MS CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE Fr 4/5 Fr 5/5 Fr 6/5 CC10 CC9 CC8 20 Frações 43 Frações 10 Frações CCD CLAE-DAD CCD CLAE-DAD CCD CLAE-DAD O extrato diclorometano de O. percoriacea (EDiOPer; 6,0g) foi submetido a CC em sílica gel eluída com CH 3 Cl, CH 3 Cl/MeOH e MeOH e originou 11 frações de aproximadamente 100 ml cada. Após análise por CCD todas as frações foram submetidas à CLAE-DAD (Tabela 7, Esquema 2). 48

49 Tabela 7: Fracionamento de EDiOPer (CC 6) Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1/6 CH 3 Cl 0,24 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 2/6 CH 3 Cl/MeOH (99:1) 1,19 g CLAE-DAD 3/6 CH 3 Cl/MeOH (95:5) 0,45 g CLAE-DAD 4/6 CH 3 Cl/MeOH (9:1) 0,18 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 5/6 CH 3 Cl/MeOH (4:1) 2,56 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 6/6 CH 3 Cl/MeOH (3:2) 0,27 g CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 7/6 CH 3 Cl/MeOH (1:1) 0,12 g CLAE-DAD 8/6 CH 3 Cl/MeOH (2:3) 0,32 g CLAE-DAD 9/6 CH 3 Cl/MeOH (3:7) 0,17 g CLAE-DAD 10/6 CH 3 Cl/MeOH (1:4) 0,04 g CLAE-DAD 11/6 MeOH 0,11 g CLAE-DAD A subfração 5/6 foi submetida ao fracionamento por CC em sílica flash eluída com Hex; Hex/AcOEt; AcOEt, AcOEt/MeOH e MeOH e forneceu 26 subfrações de aproximadamente 100 ml cada. Após análise por CCD as subfrações 3/7 a 20/7 foram submetidas à CLAE-DAD e as frações 4/7, 7/7 e 10/7 foram analisadas por CLAE-DAD-EM/EM (Tabela 8, Esquema 2). 49

50 Tabela 8: Fracionamento de 5/6 (CC 7) Frações Sistema eluente Massa Análises realizadas 1-2/7 Hex 6,6 mg Reservado 3/7 Hex/AcOEt (9:1) 78,9 mg CLAE-DAD 4/7 Hex/AcOEt (4:1) 150,8 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 5/7 Hex/AcOEt (4:1) 122,5 mg CLAE-DAD 6/7 Hex/AcOEt (4:1) 103,3 mg CLAE-DAD 7/7 Hex/AcOEt (4:1) 88,7 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 8/7 Hex/AcOEt (4:1) 59,0 mg CLAE-DAD 9/7 Hex/AcOEt (4:1) 91,7 mg CLAE-DAD 10/7 Hex/AcOEt (7:3) 97,4 mg CLAE-DAD, CLAE-EM/EM 11/7 Hex/AcOEt (7:3) 95,2 mg CLAE-DAD 12/7 Hex/AcOEt (7:3) 32,3 mg CLAE-DAD 13/7 Hex/AcOEt (3:2) 131,4 mg CLAE-DAD 14/7 Hex/AcOEt (3:2) 77,1 mg CLAE-DAD 15/7 Hex/AcOEt (1:1) 39,3 mg CLAE-DAD 16/7 Hex/AcOEt (1:4) 256,4 mg CLAE-DAD 17/7 AcOEt 50,1 mg CLAE-DAD 18/7 AcOEt/MeOH (4:1) 66,9 mg CLAE-DAD 19/7 AcOEt/MeOH (7:3) 318,3 mg CLAE-DAD 20/7 AcOEt/MeOH (7:3) 212,9 mg CLAE-DAD 21/7 AcOEt/MeOH (3:2) 67,8 mg Reservado 22/7 AcOEt/MeOH (1:1) 54,3 mg Reservado 23/7 AcOEt/MeOH (2:3) 42,4 mg Reservado 24/7 AcOEt/MeOH (3:7) 32,4 mg Reservado 25/7 MeOH 33,5 mg Reservado 26/7 MeOH 87,8 mg Reservado 50

51 Esquema 2: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea percoriacea Folhas Secagem Moagem Pó seco EtOH EEtOPer H 2O/EtOH (3:1) Partição CLAE-DAD Teste IAchE EHexOPer EDiOPer EAcOPer EBuOPer EAqOPer CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-MS CC 6 CLAE-DAD Teste IAchE 11 Frações CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CCD Fr 5/6 CC7 26 Frações CCD CLAE-DAD CLAE-EM Teste IAchE Todos os extratos em diclorometano foram submetidos à CCD eluída com CH 2 Cl 2, visualizadas em UV e reveladas com reagente Dragendorff para verificação da presença de alcaloides. O estudo químico buioguiado das espécies Ocotea notata, O. spixiana e Ocotea sp. está resmido nos esquemas 3 e 4. 51

52 Esquema 3: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea notata Folhas Secagem Moagem Pó seco EtOH EEtON H 2O/EtOH (3:1) Partição CLAE-DAD Teste IAchE EHexON EAcON EBuON EAqON CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE Esquema 4: Resumo do estudo químico bioguiado de Ocotea sp. e O. spixiana Folhas Secagem Moagem Pó seco EtOH EEt H 2O/EtOH (3:1) Partição CLAE-DAD Teste IAchE EHex EDi EAc EBu EAq CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE CLAE-DAD Teste IAchE 52

53 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DOS EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES DE ESPÉCIES DE Ocotea Para avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos, foi realizada uma triagem testando-se apenas a concentração máxima geralmente utilizada para este tipo de teste com extratos (Rhee et al., 2001; Eldeen et al., 2005). A concentração final dos extratos e da eserina em cada poço foi de 1 mg/ml e 50µM, respectivamente. Eldeen et al. (2005) consideram, para testes com extratos, atividade anticolinesterásica moderada inibições menores que 60%. Vinutha et al. (2007) classificam a inbição da atividade acetilcolinesterásica como potente quanto a inibição for maior que 50%, moderada quando a inibição for de 30-50% e baixa quando a inibição for menor que 30%. Para este trabalho, os extratos e frações foram considerados ativos quando a inibição da atividade acetilcolinesterásica foi maior que 60%. As leituras das absorbâncias foram realizadas nos tempos 0; 30 e 60 min para avaliar possíveis alterações da atividade enzimática no decorrer do tempo. Uma vez que a atividade enzimática é calculada em relação ao branco (ao qual é atribuído a atividade máxima da enzima), os valores de atividade enimática dos extratos e frações que foram superiores a 100% foram corrigidos para o máximo de 100%. As médias dos resultados em triplicata da atividade acetilcolinesterásica na presença de cada extrato nos tempos 30 e 60 minutos são mostrados nos gráficos 1 a 6. 53

54 Gráfico 1: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos etanólicos brutos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. De acordo com o gráfico 1, os extratos etanólicos brutos de O. percoriacea e Ocotea sp. apresentaram melhor atividade anticolinesterásica com porcentagens de inibição da atividade enzimática de 79,55 e 71,65% no tempo 30min e 74,68 e 67,62% no tempo 60min, respectivamente (Tabela 9). No entanto, considerando que os extratos etanólicos brutos de O. pomaderroides, O. notata e O. spixiana também apresentaram uma considerável inibição da atividade anticolinesterásica (40 a 50%), todos os extratos foram particionados para avaliação da atividade anticolinesterásica das partições, denominadas extratos hexânico, diclorometano, acetato de etila, butanólico e aquoso. 54

55 Gráfico 2: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos hexânicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Os extratos hexânicos de O. pomaderroides, O. percoriacea e Ocotea sp. apresentaram porcentagens de inibição da atividade acetilcolinesterásica de 92,18; 83,28 e 86,72%, respectivamente no tempo 30min. No tempo 60min a inibição permaneceu muito semelhante ao tempo 30min (T60: 92,91; 81,72 e 86,34%, respectivamente). A ação do extrato hexânico de O. pomaderroides destaca-se pela inibição da atividade enzimática comparável ao padrão eserina, que apresentou atividade anticolinesterásica de 95,66% no tempo 30 e 92,05% no tempo 60 min (Gráfico 2, Tabela 9). 55

56 Gráfico 3: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em diclorometano de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. De acordo com o gráfico 3 e tabela 9, todos os extratos diclorometano testados apresentaram atividade anticolinesterásica com porcentagens de inibição da atividade enzimática acima de 60%. Os extratos diclorometano de O. pomaderroides, O. percoriacea, O. spixiana e Ocotea sp. inibiram a atividade acetilcolinesterásica em 71,86; 92,09; 74,45 e 77,74%, respectivamente, no tempo 30 min e 71,59, 89,30; 77,65 e 77,59%, respectivamente, no tempo 60 min. A inibição da atividade enzimática produzida pelo extrato diclorometano de O. percoriacea foi semelhante ao efeito do padrão eserina. 56

57 Gráfico 4: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos em acetato de etila de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. Os extratos acetato de etila mais ativos foram das espécies O. pomaderroides e Ocotea sp. que apresentaram porcentagens de inibição da atividade acetilcolinesterásica de 74,25 e 76,19%, respectivamente no tempo 30min e 75,81 e 72,97%, respectivamente, no tempo 60min (Gráfico 4, Tabela 9). Gráfico 5: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos butanólicos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. 57

58 Conforme mostram os gráficos 5 e 6 e tabela 9, nenhum extrato butanólico ou aquoso das espécies de Ocotea avaliadas foi capaz de inibir a atividade enzimática da acetilcolinesterase em mais de 60% nos diferentes tempos avaliados (T30 e T60). Gráfico 6: Atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos aquosos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. 58

59 Tabela 9: Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença dos extratos de espécies de Ocotea nos tempos 30 e 60 min. T30 EEt EHex EDi EAc EBu EAq O. pomaderroides 52,10±9,51 92,18±1,63 71,86±3,09 74,25±9,99 44,48±3,27 20,74±7,48 O. percoriacea 79,55±8,28 83,28±1,30 92,09±2,73 43,71±12,25 28,45±8,28 16,17±13,24 O. notata 50,74±1,65 22,44±11,50-51,91±5,60 41,90±4,57 19,86±10,98 O. spixiana 45,79±7,09 58,55±20,93 74,45±1,00 50,73±3,75 27,08±3,01 27,57±17,40 Ocotea sp. 71,65±9,58 86,72±1,73 77,74±10,98 76,19±3,74 44,77±15,21 9,32±8,33 T60 EEt EHex EDi EAc EBu EAq O. pomaderroides 49,36±12,50 92,91±2,93 71,59±1,42 75,81±8,16 38,13±4,74 17,00±11,65 O. percoriacea 74,68±5,29 81,72±2,11 89,30±5,81 36,84±7,34 17,98±5,59 4,37±7,57 O. notata 48,54±1,86 23,96±7,48-47,78±7,90 41,24±3,00 5,24±9,07 O. spixiana 36,88±8,23 56,37±19,63 77,65±2,32 48,31±5,61 27,59±5,16 7,54±7,96 Ocotea sp. 67,62±12,29 86,34±4,71 77,59±11,17 72,97±1,82 41,50±14,74 0,68±1,17 Controles T30 T60 Eserina 95,66±1,46 92,05±1,47 MeOH 0,93±1,61 0,79±1,37 59

60 5.2 FRACIONAMENTO BIOGUIADO E ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA DAS FRAÇÕES De acordo com os resultados da avaliação da atividade anticolinesterásica, todos os extratos em diclorometano foram ativos. Isto sugere a presença de substâncias ativas que fazem parte de alguma classe química em comum, uma vez que cada classe de substâncias químicas tem afinidade por um dos solventes utilizados nas partições. Sendo assim, os extratos em diclorometano das duas primeiras espécies avaliadas, EDiOPom e EDiOPer, foram selecionados para fracionamento bioguiado. Após o fracionamento de EDiOPom (CC 5) e EDiOPer (CC 6 e 7), suas frações também foram submetidas à avaliação da atividade anticolinesterásica. Gráfico 7: Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPom nos tempos 30 e 60 min As subfrações 4/5, 5/5 e 6/5 apresentaram atividade anticolinesterásica maior que 60%, com porcentagens de inibição da atividade enzimática de 96,56; 74,49 e 70,53%, respectivamente, após 60 min (Gráfico 7, Tabela 10). A subfração 4/5 apresentou atividade comparável ao controle positivo, eserina, e foi submetida a fracionamento (CC 10). 60

61 Gráfico 8: Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de EDiOPer nos tempos 30 e 60 min As subfrações 3/6, 4/6, 5/6 e 6/6 apresentaram atividade anticolinesterásica maior que 60%, com porcentagens de inibição da atividade enzimática de 62,32; 62,05; 87,23 e 62,17%, respectivamente, após 30 min (Gráfico 8, Tabela 10). A subfração 5/6, que apresentou melhor atividade anticolinesterásica, foi submetida a fracionamento (CC 7). 61

62 Gráfico 9: Atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas de 5/6 (proveniente de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min De acordo com o gráfico 9 e tabela 10, as subfrações 5/7 a 12/7 e 15/7 apresentaram atividade anticolinesterásica com porcentagens de inibição da atividade enzimática acima de 80% em T30 e T60. As subfrações 9/7 e 10/7 produziram efeito inibitório de 98,78 e 99,94%, respectivamente (T30), resultado melhor que o obtido para o padrão eserina (% inibição: 94,35%, T30). A avaliação da atividade anticolinesterásica segue o método de Ellman que se baseia na hidrólise do substrato acetiltiocolina (5) pela enzima acetilcolinesterase (6), gerando como produto a tiocolina (7), que reage com o ácido 5,5 -ditiobis-[2- nitrobenzóico] (DTNB ou reagente de Ellman) (8), produzindo 2-nitrobenzoato-5- mercaptotiocolina (9) e 5-tio-2-nitrobenzoato (10), que podem ser detectados a 405 nm (TREVISAN E MACEDO, 2003) (Quadro 3). 62

63 Quadro 3: Reação de Ellman FONTE: Adaptado de SILVA, 2001 Em geral, testes que utilizam reagentes de cor apresentam algumas limitações para avaliação de extratos que, em geral, apresentam coloração esverdeada intensa devido à presença de clorofila e de alguns metabólicos secundários que possuem cor. Outro fator limitante é a utilização de um solvente orgânico que não interfira no ensaio e que seja capaz de solubilizar todas as amostras (Rhee et al., 2001). O desvio-padrão elevado observado nos resultados de alguns extratos pode ter ocorrido devido à presença de pequenas bolhas de ar no início da reação (logo após a pipetagem dos reagentes) que interferem na leitura. Apesar das limitações e interferências, o método de avaliação da atividade anticolinesterásica utilizado foi capaz de identificar os extratos e frações mais ativos e direcionar o fracionamento biomonitorado. 63

64 Tabela 10: Inibição da atividade acetilcolinesterásica na presença das frações obtidas das colunas cromatográficas 5 (EDiOPom), 6 (EDiOPer) e 7 (Fr 5/6 de EDiOPer) nos tempos 30 e 60 min. EDiOPom EDiOPer CC 5 T30 T60 CC6 T30 T60 CC7 T30 T60 Fr 2/5 0,00±0,00 35,47±3,93 Fr 1/6 30,11±14,80 31,66±3,35 Fr 3/7 41,87±6,17 51,01±4,47 Fr 3/5 0,00±0,00 42,57±0,77 Fr 2/6 50,34±9,72 56,12±3,36 Fr 4/7 65,62±5,93 72,90±1,60 Fr 4/5 89,03±6,64 96,56±1,89 Fr 3/6 62,32±4,90 63,24±0,82 Fr 5/7 90,73±2,14 90,83±0,31 Fr 5/5 44,02±3,79 74,49±1,46 Fr 4/6 62,05±11,36 67,79±10,06 Fr 6/7 94,09±3,50 95,01±4,02 Fr 6/5 48,06±0,47 70,53±3,62 Fr 5/6 87,23±9,99 88,32±7,83 Fr 7/7 85,25±2,65 88,10±1,28 Fr 7/5 25,08±1,03 54,44±6,21 Fr 6/6 62,17±7,51 64,49±6,72 Fr 8/7 90,48±3,76 91,16±1,30 Fr 8/5 1,25±2,16 22,28±3,85 Fr 7/6 37,41±14,55 45,66±6,20 Fr 9/7 98,78±2,12 98,68±1,60 Fr 9/5 0,00±0,00 0,00±0,00 Fr 8/6 26,18±14,33 36,34±2,22 Fr 10/7 99,94±0,10 98,40±2,76 Fr 10/5 0,00±0,00 0,00±0,00 Fr 9/6 40,70±13,15 46,85±4,94 Fr 11/7 84,35±11,44 87,34±9,06 Fr 11/5 0,00±0,00 3,15±2,90 Fr 10/6 39,29±12,07 43,81±4,82 Fr 12/7 94,71±3,60 94,01±4,55 Fr 11/6 21,00±18,38 5,23±5,01 Fr 13/7 57,60±7,84 65,02±5,53 Fr 14/7 63,56±2,95 67,31±1,83 Controles Fr 15/7 83,99±1,89 88,48±3,41 Eserina 94,35±1,44 91,78±0,77 Fr 16/7 34,10±9,63 39,57±9,15 MeOH 0,00±0,00 0,00±0,00 Fr 17/7 41,19±0,85 47,90±7,28 Fr 18/7 9,94±9,05 8,70±4,22 Fr 19/7 22,68±15,53 29,85±3,42 Fr 20/7 35,15±6,06 47,98±2,43 64

65 5.3 ANÁLISE POR CLAE-DAD DOS EXTRATOS BIOATIVOS A técnica de CLAE-DAD é uma ferramenta bastante utilizada para análise do perfil de substâncias fenólicas presentes em amostras obtidas de plantas (ANDERSEN e MARKHAM, 2006). Por apresentarem cromóforos distintos entre si, diferentes classes e subclasses de fenólicos podem ser identificadas a partir do espectro de absorção no UV. As análises por CLAE-DAD realizadas contribuíram para avaliação do perfil químico dos metabólitos secundários presentes nos extratos e frações através da comparação dos espectros de UV obtidos com os dados disponíveis na literatura. As figuras 11 e 13 a 21 apresentam os cromatogramas e os espectros no UV dos extratos que apresentaram melhor atividade (inibições maiores que 60%) como inibidores da enzima acetilcolinesterase. Figura 11: Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOPer (λ=330 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 15,87 min) Pico 2 (t R : 16,45 min) 65

66 Pico 3 (t R : 16,67 min) Pico 4 (t R : 16,91 min) Pico 5 (t R : 17,38 min) Pico 6 (t R : 17,80 min) Pico 7 (t R : 18,17 min) Pico 8 (t R : 21,95 min) Pico 9 (t R : 22,32 min) De acordo com Fossen e Andersen (2006) os picos dos cromatogramas obtidos por CLAE-DAD com bandas entre nm e nm estão relacionados à presença de flavonoides. 66

67 O espectro de UV-VIS de flavonoides inclui duas bandas de absorção, sendo que a banda I é característica de absorção devido ao grupo cinamoil do anel B (figura 12) e encontra-se na região de comprimento de onda (λ) que varia de 210 a 350 nm para as flavonas, enquanto nos flavonois é encontrada entre 350 a 385 nm (HARBORNE et al., 1975; TSIMOGIANNIS et al., 2007). Os flavonois são flavonas substituídas na posição C-3 por uma hidroxila (ZUANAZZI e MONTANHA, 2007). A banda II, característica do grupo benzoil do anel A e encontrada na faixa de 250 a 290 nm, é muito semelhante entre os diversos subgrupos de flavonoides (HARBORNE et al., 1975; TSIMOGIANNIS et al., 2007). Figura 12: Estrutura química geral dos flavonoides O aumento do grau de hidroxilação do núcleo leva ao aumento do efeito batocrômico e, consequentemente, os espectros deslocam-se no sentido dos maiores comprimentos de onda. A metilação ou glicosilação dos grupamentos hidroxila em geral não altera os respectivos espectros, exceto na hidroxila característica dos flavonois (em C-3) ou em C-4, quando se percebe efeito hipsocrômico na banda I (HARBORNE et al., 1975; ZUANAZZI e MONTANHA, 2007). A acilação de um flavonoide tende a anular o efeito das hidroxilas fenólicas no espectro UV. A acilação de um açúcar por substituintes do tipo ácido cinâmico é revelada pela presença de duas bandas de absorção na região do UV, sendo que a banda adicional ( nm) corresponde à presença do grupamento acila (HARBORNE et al., 1975). A análise do cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico bruto de Ocotea percoriacea (EEtOPer) (Figura 11, Tabela 11) revelou que os picos 1, 2, 3 e 4 apresentam espectros no ultravioleta característicos da presença de flavonois, 67

68 com máximos de absorção em torno de 255 e 355 nm. Os picos 5, 6 e 7 do mesmo cromatograma possuem espectros no UV provavelmente pertencentes à classe das flavonas ou flavonóis com uma hidroxila a menos em C-3. Os picos 8 e 9 possuem bandas de absorção semelhantes, em torno de 266 e 312, e pertencem à mesma classe química. De acordo com Harborne et al. (1975) esse padrão de absorção no UV pode indicar a presença de flavonoides acilados. No entanto, foram necessárias análises por meio de outras técnicas, como CLAE acoplada à espectrometria de massas para melhor elucidação da classe química destas substâncias (resultados apresentados posteriormente). Tabela 11: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOPer Pico t R (min) λ máx (nm) 1 15,87 255, ,45 253, ,67 255, ,91 256, ,38 266, ,80 265, ,17 264, ,95 267, ,32 266, 317 O cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico bruto de Ocotea sp. (EEtOsp) (Figura 13, Tabela 12) apresentou os picos 3, 4 e 5, com espectros no UV característicos de flavonois, enquanto os picos 6, 7 e 8 provavelmente pertencem à classe das flavonas ou flavonóis com uma hidroxila a menos em C-3. Os picos 9 e 10 possuem bandas de absorção máxima em torno de 280 e 310 nm. De acordo com Tsimogiannis et al. (2007), di-hidroflavonois, flavanonas e isoflavonas exibem banda I de baixa intensidade, frequentemente aparecendo como ombro que absorve entre nm, sendo a banda II (λ máx =277 a 295nm) a banda principal. 68

69 Figura 13: Cromatograma por CLAE-DAD de EEtOsp (λ=320 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 11,90 min) Pico 2 (t R : 12,32 min) Pico 3 (t R : 12,90 min) Pico 4 (t R : 13,26 min) Pico 5 (t R : 13,50 min) Pico 6 (t R : 14,05 min) 69

70 Pico 7 (t R : 14,41 min) Pico 8 (t R : 14,77 min) Pico 9 (t R : 18,92 min) Pico 10 (t R : 19,33 min) Tabela 12: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EEtOsp Pico t R (min) λ máx (nm) 1 11, ,32 255, ,90 254, ,26 256, ,50 255, ,05 265, ,41 265, ,47 264, ,92 279, ,33 282, 314 A análise por CLAE-DAD do extrato hexânico de O. pomaderroides (EHexOPom), no comprimento de onda 320 nm, não revelou a presença de nenhum pico, o que indica que não existe na amostra substâncias químicas que contenham grupamentos cromóforos que absorvem nessa região. 70

71 Figura 14: Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOPer (λ=300 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 18,05 min) Pico 2 (t R : 21,86 min) Pico 3 (t R : 22,23 min) O pico 1 do cromatograma por CLAE-DAD do extrato hexânicos de Ocotea percoriacea (EHexOPer) apresentou espectro no UV característico de flavona ou flavonol com uma hidroxila a menos em C-3, enquanto os picos 2 e 3 apresentaram espectro no UV semelhantes aos picos 8 e 9 do cromatograma por CLAE-DAD de EEtOPer (Figura 14, Tabela 13). Tabela 13: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EHexOPer Pico t R (min) λ máx (nm) 1 18,05 264, ,86 270, ,23 264,

72 Figura 15: Cromatograma por CLAE-DAD de EHexOsp (λ=300 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 19,37 min) Pico 2 (t R : 21,00 min) Pico 3 (t R : 21,71 min) Pico 4 (t R : 23,53 min) Pico 5 (t R : 23,84 min) Pico 6 (t R : 26,27 min) 72

73 Os espectros no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EHexOsp tiveram intensidade muito fraca, impossibilitando a obtenção das absorções máximas (Figura 15). Figura 16: Cromatograma por CLAE-DAD (λ=300 nm) de EDiOPom e espectro no UV t R : 22,48 min, UV máx: 265 e 316 nm Os espectros no UV de todos os picos dos cromatogramas por CLAE-DAD de EDiOPom, EDiOPer e EDiOS (figuras 16, 17 e 18, tabela 14) apresentaram bandas de absorção semelhantes aos picos 8 e 9 do cromatograma de EEtOPer e picos 2 e 3 do cromatograma de EHexOPer. Isso sugere que esta seja uma das principais classes químicas responsáveis pelo efeito anticolinesterásico demonstrado pelos extratos testados. A utilização do reagente Dragendorff na CCD não evidenciou a presença de alcaloides nestes extratos. 73

74 Figura 17: Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPer (λ=300 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 21,35 min) Pico 2 (t R : 21,83 min) Pico 3 (t R : 22,19 min) 74

75 Figura 18: Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOS (λ=300 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 20,79 min) Pico 2 (t R : 21,18 min) Pico 3 (t R : 21,55 min) Tabela 14: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD de EDiOPom, EDiOPer e EDiOS EDiOPom EDiOPer EDiOS Pico t R (min) λ máx (nm) t R (min) λ máx (nm) t R (min) λ máx (nm) 1 22,48 265, ,35 264, ,79 263, ,83 266, ,18 268, ,19 266, ,55 266,

76 Figura 19: Cromatograma por CLAE-DAD de EDiOsp (λ=320 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 13,28 min) Pico 2 (t R : 13,54 min) Pico 3 (t R : 14,44 min) Pico 4 (t R : 14,79 min) Pico 5 (t R : 15,24 min) Pico 6 (t R : 16,46 min) 76

77 Pico 7 (t R : 16,77 min) Pico 8 (t R : 17,16 min) Pico 9 (t R : 17,47 min) Pico 10 (t R : 18,39 min) Pico 11 (t R : 18,92 min) Pico 12 (t R : 19,32 min) Pico 13 (t R : 21,66 min) Pico 14 (t R : 23,84 min) 77

78 Pico 15 (t R : 26,27 min) Apesar dos espectros no UV dos picos 1 a 5 do cromatograma por CLAE- DAD de EDiOsp apresentarem baixa intensidade, os mesmos assemelham-se aos espectros no UV de flavonoides (Figura 19, tabela 15). Os espectros no UV dos picos 9 a 12 mostraram máximos de absorção em 267 e 312 nm e pertencem à mesma classe dos picos 8 e 9 do cromatograma de EEtOPer, picos 2 e 3 do cromatograma de EHexOPer e todos os picos dos cromatogramas de EDiOPom, EDiOPer e EDiOS, conforme discussão anterior. Tabela 19: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos eluídos por CLAE-DAD de EDiOsp Pico t R (min) λ máx (nm) 1 13,28 269, ,54 253, ,44 265, ,79 265, ,24 271, ,46 295, ,77 269, ,16 nd 9 17,47 265, ,39 269, ,92 267, ,32 267, , , ,27 nd: não detectado nd 78

79 Figura 20: Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOPom (λ=330 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 16,02 min) Pico 2 (t R : 16,61 min) Pico 3 (t R : 17,07 min) Pico 4 (t R : 17,55 min) Pico 5 (t R : 18,32 min) Pico 6 (t R : 18,80 min) 79

80 Pico 7 (t R : 20,18 min) Pico 8 (t R : 20,88 min) Pico 9 (t R : 21,69 min) Pico 10 (t R : 22,08 min) Pico 11 (t R : 22,46 min) A análise do cromatograma por CLAE-DAD de EAcOPom (Figura 20, Tabela 16) revelou que os picos 1 a 3 apresentam espectros no ultravioleta característicos da presença de flavonois, com máximos de absorção em torno de 255 e 350 nm. Os picos 4 e 5 do mesmo cromatograma possuem espectros no UV provavelmente pertencentes à classe das flavonas ou flavonóis contendo uma hidroxila a menos em C-3. Os picos 7 a 11 demonstram bandas de absorção semelhantes, em torno de 260 e 317, e pertencem à mesma classe química já discutida, que se supõe ser responsável pelo efeito anticolinesterásico observado. 80

81 Tabela 16: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD de EAcOPom Pico t R (min) λ máx (nm) 1 16,02 255, ,61 255, ,07 255, ,55 264, ,32 264, ,80 257, ,18 267, ,88 264, ,69 263, ,08 267, ,46 266, 316 Figura 21: Cromatograma por CLAE-DAD de EAcOsp (λ=320 nm) e espectros no UV Pico 1 (t R : 11,99 min) Pico 2 (t R : 12,59 min) 81

82 Pico 3 (t R : 12,97 min) Pico 4 (t R : 13,35 min) Pico 5 (t R : 13,57 min) Pico 6 (t R : 14,17 min) Pico 7 (t R : 14,48 min) Pico 8 (t R : 14,83 min) Pico 9 (t R : 18,96 min) Pico 10 (t R : 19,37 min) 82

83 Os picos 3, 4 e 5 do cromatograma por CLAE-DAD de EAcOsp (Figura 21, Tabela 17) possuem espectros no UV característicos da presença de flavonois, enquanto os picos 6, 7 e 8 apresentam bandas de absorção semelhantes às flavonas ou flavonóis contendo uma hidroxila a menos em C-3. Os picos 9 e 10 exibem máximos de absorção em torno de 280 e 310 nm, da mesma forma que os picos 9 e 10 do cromatograma por CLAE-DAD de EEtOsp (Figura 13, Tabela 12). Tabela 17: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD de EAcOsp Pico t R (min) UV máx (nm) 1 11, ,59 nd 3 12,97 256, ,35 256, ,57 256, ,17 265, ,48 265, ,83 264, ,96 282, ,37 284, 310 nd: não detectado 5.4 ANÁLISE POR CLAE-DAD DAS FRAÇÕES BIOATIVAS As figuras 22 a 34 apresentam os cromatogramas e os espectros no UV das frações que apresentaram melhor atividade, ou seja, inibições da atividade da enzima acetilcolinesterase maiores que 60%. As frações da CC 5 (frações 4/5, 5/5 e 6/5) são provenientes de EDiOPom. Todos os picos dos cromatogramas por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5 apresentaram tempos de retenção e bandas de absorção no UV semelhantes (λ máx em torno de 200 e 250 nm) (Figura 22, tabela 18). A partir destes dados pode-se apenas sugerir que estas frações ativas provenientes da CC 5 contém compostos aromáticos (PAVIA et al., 2010). Outras análises espectroscópicas são necessárias para estabelecer a classe química a qual pertencem estas substâncias. 83

84 Figura 22: Cromatogramas por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5 (λ=250 nm) e espectros no UV Fração 4/5 Fração 5/5 Pico 3 (t R : 27,53 min) Pico 1 (t R : 23,69 min) Pico 2 (t R : 27,19 min) Fração 6/5 Pico 3 (t R : 27,52 min) Pico 1 (t R : 23,70 min) 84

85 Tabela 18: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD das frações 4/5, 5/5 e 6/5 Fr 4/5 Fr 5/5 Fr 6/5 Pico t R (min) λ máx (nm) t R (min) λ máx (nm) t R (min) λ máx (nm) , , ,19 260, 280 sh , , *máximo observado; sh: ombro (shoulder) - - As frações da CC 6 (frações 3/6, 4/6, 5/6 e 6/6) são resultantes do fracionamento de EDiOPer. Os picos 1, 2 e 3 dos cromatogramas por CLAE-DAD das frações 3/6 e 4/6 apresentaram tempos de retenção e espectros no UV compatíveis com bandas de absorção de compostos aromáticos (Figuras 23 e 24 e tabelas 19 e 20). 85

86 Figura 23: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 3/6 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 23,61 min) Pico 2 (t R : 27,17 min) Pico 3 (t R : 27,79 min) Tabela 19: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 3/6 Pico t R (min) λ máx * (nm) 1 23, , , *máximo observado 86

87 Figura 24: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 4/6 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 23,68 min) Pico 2 (t R : 27,17 min) Pico 3 (t R : 27,49 min) Tabela 20: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 4/6 Pico t R (min) λ máx * (nm) 1 23, , ,49 *máximo observado

88 Figura 25: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/6 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 18,00 min) Pico 2 (t R : 18,55 min) Pico 3 (t R : 18,99 min) Pico 4 (t R : 23,64 min) Tabela 21: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 5/6 Pico t R (min) λ máx * (nm) 1 18,00 265, ,55 265, ,99 265, , *máximo observado 88

89 Os espectros no UV dos picos 1, 2 e 3 do cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/6 (Figura 25, Tabela 21) apresentaram bandas de absorção semelhantes aos picos 1, 2 e 3 do cromatograma de EDiOPer e picos 8 e 9 de EEtOPer, o que reafirma a possibilidade de que essa classe de substâncias seja responsável pelo efeito anticolinesterásico. A análise do cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/6 (Figura 26, Tabela 22) revelou que os picos 3 a 6 apresentam espectros no ultravioleta característicos da presença de flavonois, com máximos de absorção em torno de 255 e 360 nm, semelhantes aos picos 1 a 4 de EEtOPer. Os picos 7, 8 e 9 do mesmo cromatograma possuem espectros no UV provavelmente pertencentes à classe das flavonas ou flavonóis contendo uma hidroxila a menos em C-3 (λ máx em torno de 265 e 350 nm) da mesma forma que os picos 5 a 7 do cromatograma de EEtOPer. Figura 26: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/6 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 7,64 min) Pico 2 (t R : 10,37 min) 89

90 Pico 3 (t R : 11,90 min) Pico 4 (t R : 12,45 min) Pico 5 (t R : 12,69 min) Pico 6 (t R : 12,92 min) Pico 7 (t R : 13,37 min) Pico 8 (t R : 13,85 min) Pico 9 (t R : 14,19 min) 90

91 Tabela 22: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 6/6 Pico t R (min) λ máx * (nm) 1 7, ,37 275, ,90 255, ,45 255, ,69 255, ,92 255, ,37 265, ,85 265, ,19 *máximo observado 265, 345 5/6. As frações da CC 7 (frações 5/7 até 12/7) derivam do fracionamento de Fr Figura 27: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/7 (λ=260 nm) e espectro de UV t R : 23,60 min, UV máx: 270 nm O pico 1 (t R : 23,60 min) do cromatograma por CLAE-DAD da fração 5/7 (Figura 27) apresenta espectro no UV com máximo de absorção em 270 nm semelhante ao pico 1(t R : 23,61 min) do cromatograma da fração 3/6 (Figura 23). 91

92 Figura 28: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 6/7 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 12,88 min) Pico 2 (t R : 14,19 min) Pico 3 (t R : 15,86 min) Pico 4 (t R : 17,34 min) Tabela 23: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 6/7 Pico t R (min) λ máx * (nm) 1 12,88 225, , ,86 290, ,34 nd *máximo observado; nd: não detectado 92

93 Os picos 4 (t R : 14,18 min) e 5 (t R : 15,85 min) do cromatograma por CLAE- DAD da fração 7/7 (Figura 29, Tabela 24) são semelhantes aos picos 2 (t R : 14,19 min) e 3 (t R : 15,86 min) do cromatograma da fração 6/7. Os picos 6 (t R : 18,78 min) e 7 (t R : 19,56 min) do mesmo cromatograma pertencem à mesma classe química. O espectro no UV do pico 8 (t R : 27,09 min) apresenta máximos de absorção em 440, 415 e 265, dados que diferem dos resultados já apresentados e podem indicar a presença de pigmentos. Figura 29: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 7/7 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 12,01 min) Pico 2 (t R : 12,89 min) Pico 3 (t R : 13,96 min) Pico 4 (t R : 14,18 min) 93

94 Pico 5 (t R : 15,85 min) Pico 6 (t R : 18,78 min) Pico 7 (t R : 19,56 min) Pico 8 (t R : 27,09 min) Tabela 24: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 7/7 Pico t R (min) UV máx* (nm) 1 12, , ,96 220, , ,85 220, , , ,09 *máximo observado 265, 415, 440 O pico 1 (t R =12,86, λ máx = 225 e 275 nm) do cromatograma da fração 8/7 (Figura 30, Tabela 25) parece ser equivalente ao pico 1 (t R =12,88, λ máx = 225 e 275 nm) do cromatograma da fração 6/7 (Figura 28, Tabela 23). O pico 2 (t R : 15,85 min) da fração 8/7 é semelhante aos picos 5 do cromatograma da fração 7/7 e pico 3 do cromatograma da fração 6/7. 94

95 Os espectros no UV dos picos 8 e 9 do cromatograma da fração 8/7 assemelham-se ao espectro no UV do pico 8 (t R : 27,09 min) do cromatograma da fração 7/7 (Figura 29, Tabela 24). Figura 30: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 8/7 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 12,86 min) Pico 2 (t R : 15,85 min) Pico 3 (t R : 18,03 min) Pico 4 (t R : 18,71 min) 95

96 Pico 5 (t R : 19,55 min) Pico 6 (t R : 23,93 min) Pico 7 (t R : 24,26 min) Pico 8 (t R : 27,12 min) Pico 9 (t R : 27,51 min) Tabela 25: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 8/7 Pico t R (min) UV máx* (nm) 1 12,86 225, ,85 225, , , , ,93 260, 330, ,26 270, 330, ,12 270, 415, ,51 260, 320, 410 *máximo observado 96

97 Figura 31: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 9/7 (λ=319 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 15,59 min) Pico 2 (t R : 26,17 min) Pico 3 (t R : 27,44 min) Tabela 26: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 9/7 Pico t R (min) UV máx* (nm) 1 15,59 240, ,17 270, 325, ,44 *máximo observado 270, 325,

98 A mesma classe de substâncias encontradas nas frações 7/7 e 8/7 (Figuras 29 e 30), com cromóforos que absorvem em regiões em torno de 400 nm, foi encontrada nas frações 9/7 (pico 2, t R : 26,17 min e pico 3, t R : 27,44 min), 10/7 (pico 5, t R : 26,16 min), 11/7 (picos 7 a 10) e 12/7 (picos 5 a 10) (Figuras 31 a 34 e Tabelas 26 a 29). Figura 32: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 10/7 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 13,47 min) Pico 2 (t R : 15,53 min) Pico 3 (t R : 18,74 min) Pico 4 (t R : 24,46 min) 98

99 Pico 5 (t R : 26,16 min) Tabela 27: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 10/7 Pico t R (min) UV máx* (nm) 1 13, ,53 240, , ,46 nd 5 26,16 270, 325, 410 *máximo observado; nd: não detectado 99

100 Figura 33: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 11/7 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 11,32 min) Pico 2 (t R : 13,51 min) Pico 3 (t R : 13,77 min) Pico 4 (t R : 18,77 min) Pico 5 (t R : 19,59 min) Pico 6 (t R : 20,13 min) 100

101 Pico 7 (t R : 22,20 min) Pico 8 (t R : 24,44 min) Pico 9 (t R : 24,94 min) Pico 10 (t R : 26,18 min) Tabela 28: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 11/7 Pico t R (min) UV máx* (nm) 1 11, , ,77 225, ,77 240, ,59 265, ,13 250, 320, ,20 275, ,44 270, ,94 265, ,18 270, 325, 410 *máximo observado 101

102 Figura 34: Cromatograma por CLAE-DAD da fração 12/7 (λ=260 nm) e espectros de UV Pico 1 (t R : 12,01 min) Pico 2 (t R : 13,76 min) Pico 3 (t R : 14,23 min) Pico 4 (t R : 16,29 min) Pico 5 (t R : 19,29 min) Pico 6 (t R : 20,13 min) 102

103 Pico 7 (t R : 22,23 min) Pico 8 (t R : 25,11 min) Pico 9 (t R : 26,48 min) Pico 10 (t R : 26,95 min) Tabela 29: Tempo de retenção e absorção no UV dos picos obtidos por CLAE-DAD da fração 12/7 Pico t R (min) UV máx* (nm) 1 12,01 220, 260, ,76 230, ,23 230, ,29 230, ,29 275, 325, ,13 250, 340, ,23 275, 330, 370, ,11 (nd), 415, ,48 265, 420, ,95 265, 420, 445 *máximo observado, nd: não detectado 103

104 5.5 ANÁLISE POR CLAE-DAD-EM/EM DOS EXTRATOS BIOATIVOS Para melhor elucidação estrutural das substâncias responsáveis pelo efeito anticolinesterásico apresentado, os extratos e frações mais ativos foram analisados por CLAE-DAD-EM/EM. Esta técnica desempenha um papel proeminente como uma ferramenta analítica para detecção e identificação de metabólitos secundários conhecidos e farmacologicamente ativos, provenientes de plantas. Quando comparada aos outros métodos de detecção, a espectrometria de massas não só permite a determinação da estrutura química de algumas substâncias naturais já descritos na literatura, como também oferece excelente sensibilidade para analisar amostras em pequenas quantidades em um tempo relativamente curto, além de ser bastante útil para avaliar flavonoides e outros constituintes fenólicos (SALDANHA et al., 2013). As análises por CLAE-DAD-EM/EM realizadas contribuíram para identificação ou confirmação da classe química de alguns metabólitos secundários presentes nos extratos e frações através da comparação dos espectros de massas obtidos com os dados disponíveis na literatura. As figuras 35 a 38 apresentam os cromatogramas de íons totais e os espectros de massas dos extratos em diclorometano e acetato de etila que apresentaram melhor atividade anticolinesterásica. Os cromatogramas de íons totais por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) de EDiOPom, EDiOPer, EDiOS e EDiOsp apresentaram picos majoritários com perfis de fragmentação semelhantes e uma região com picos sobrepostos no tempo de retenção entre 24 e 28 minutos. Os fragmentos do pico 1 (t R =17,0 min), presente em EDiOPom e EDiOS, indicaram a presença de 2 substâncias com massa molecular de 724 e 740. A fragmentação do íon m/z 723 [M-H] - originou os fragmentos m/z 577 [(M-H)-146] -, 559 [(M-H)-164] -, 413 [(M-H)-310] - e 285 [(M-H)-438] - (Tabela 30). Esse perfil de fragmentação é semelhante ao descrito para a substância canferol 3-O-α-L-(2,3-di- E-p-cumaroilramnopiranosídeo) (platanosídeo), encontrada no extrato acetato de 104

105 etila de Platanus acerifolia (KAOUADJI, 1990), indicando a presença de flavonoide di-cinamoil glicosídeo em O. pomaderroides. Esse dado está de acordo com o espectro de UV encontrado para o pico majoritário do cromatograma por CLAE-DAD de EDiOPom (λ máx = 265 e 316nm). De acordo com Kaouadji (1990), a presença de mais de um ácido p-cumárico ligados ao açúcar do flavonoide apresenta alta absorção em torno de 312 nm e uma banda menos perceptível (ombro) em 360 nm. Flavonoides glicosilados contendo ácido p-cumárico já foram encontrados no gênero Ocotea. Garcez et al. (1995) isolaram 3 derivados p-cumaroil da afzelina (canferol-3-o-α-l-ramnose) a partir do extrato clorofórmico de folhas de O. vellosiana. A partir do pico 1 também foi possível observar a presença de outro íon molecular em m/z 739 [M-H] - que originou os fragmentos m/z 593 [(M-H)-146] -, 447 [(M-H)-292] - e 301 [(M-H)-438] -, indicando a presença de outro flavonoide di-cinamoil glicosídeo, sendo que neste caso a aglicona é a quercetina (Tabela 30). A presença dos fragmentos m/z 301 e 285 no espectro de massas de flavonoides, obtido por CLAE-DAD-EM/EM no modo negativo, caracteriza as agliconas como sendo a quercetina e o canferol, respectivamente (SALDANHA et al., 2013). O pico 2 (t R =17,3 min), presente em EDiOPom, apresentou o íon molecular m/z 723 [M-H] - que deu origem aos fragmentos m/z 577 [(M-H)-146] -, 559 [(M-H)- 164] -, 437 [(M-H)-286] - e 285 [(M-H)-438] -. Em EDiOPer foi observado um pico com o mesmo tempo de retenção com diferença nos fragmentos m/z 617 [(M-H)-106] - e 439 [(M-H)-284] - (Tabela 30). O pico majoritário 3 (t R =17,8 min), presente em EDiOPom, EDiOPer, EDiOS e EDiOsp possui íon molecular m/z 723 [M-H] - que deu origem aos fragmentos em comum m/z 577 [(M-H)-146] -, 437 [(M-H)-286] - e 285 [(M-H)-438] -. Em EDiOPer foi observado o fragmento adicional m/z 559 [(M-H)-164] - e para EDiOPom foi verificada também a presença a mais dos fragmentos m/z 676 [(M-H)-164] - e m/z 559 [(M-H)- 164] - (Tabela 30). O pico 3 em EDiOPom também apresentou íon molecular m/z 723 [M-H] - e os mesmos fragmentos gerados pelo pico 2, diferindo na intensidade e presença do 105

106 fragmento m/z 676 [(M-H)-164] -, o que indica que provavelmente as substâncias dos picos 2 e 3 em EDiOPom sejam isômeros (Tabela 30). De modo semelhante ao pico 1, o padrão de fragmentação dos picos 2 e 3 e o espectro no UV demonstrados por estes picos majoritários sugerem a presença de flavonoides di-cinamoil glicosilados nos extratos diclorometano das espécies O. pomaderroides e O. percoriacea, O. spixiana e Ocotea sp. Com base apenas no perfil de fragmentação do espectro de massas não foi possível caracterizar os picos 4 (t R =24,0 min) e 5 (t R =24,0 min). Tabela 30: Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos diclorometano de espécies de Ocotea t Pico R [M-H] - Fragmentos (m/z) (min) (m/z) EDiOPom 1 16, , 447, , 559, 413, , , 559, 437, , , 577, 559, 437, 285 EDiOPer 2 17, , 577, 559, 439, , , 559, 437, , , , 699, 531 EDiOS 1 17, , , 559, 413, , , 437, , , , 699, 531 EDiOsp 3 17, ,4 601 (?) 556, 289, , , 699,

107 Figura 35: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPom x Pico 1 (t R =16,9 min) MS, 16.9min # x m/z -MS2(723.3), 16.7min # x m/z -MS2(739.0), 16.9min # x m/z Pico 2 (t R =17,3 min) -MS, 17.3min # m/z 107

108 x MS2(723.1), 17.6min # x m/z -MS2(791.1), 17.4min # x m/z Pico 3 (t R =17,8 min) -MS, 17.8min # x m/z -MS2(791.1), 17.8min # x m/z MS2(723.2), 17.8min # m/z 108

109 Figura 36: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOPer x10 6 Pico 2 (t R =17,3 min) MS, 17.3min # x m/z -MS2(723.2), 17.4min # x m/z Pico 3 (t R =17,7 min) MS, 17.7min # x m/z -MS2(723.1), 17.8min # m/z Pico 5 (t R =24,0 min) 109

110 x MS, 24.0min # x m/z -MS2(954.3), 24.1min # x m/z MS2(785.9), 23.9min # m/z 110

111 Figura 37: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOS x10 5 Pico 1 (t R =17,0 min) MS, 17.0min # x m/z -MS2(739.1), 16.8min # x m/z -MS2(723.1), 16.8min # m/z Pico 3 (t R =17,8 min) 111

112 x MS, 17.8min # x m/z -MS2(723.2), 17.8min # x m/z Pico 5 (t R =24,1 min) -MS, 24.1min # x m/z -MS2(954.1), 24.1min # x m/z MS2(786.0), 24.2min # m/z 112

113 Figura 38: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EDiOsp x10 5 Pico 3 (t R =17,8 min) MS, 17.8min # x m/z -MS2(791.0), 17.7min # x m/z Pico 4 (t R =21,4 min) -MS, 21.4min # m/z 113

114 MS2(601.4), 21.4min # x m/z Pico 5 (t R =24,5 min) -MS, 24.5min # x m/z -MS2(785.8), 24.1min # m/z Os extratos EAcOPom e EAcOsp também foram submetidos à análise por CLAE-DAD-EM/EM. Os resultados destas análises estão demonstrados nas figuras 39 e 40 e tabela 31 e 32. O pico 1 (t R =4,9min) observado no cromatograma de íons totais de EAcOPom obtido por CLAE-DAD-EM/EM não pode ser identificado com base apenas no seu padrão de fragmentação (Figura 39, Tabela 31). Os picos 2 (t R =10,3min) e 3 (t R =11,0min) foram identificados como sendo flavonoides glicosilados derivados da quercetina. Os fragmentos m/z 301[(M-H)-162] - e m/z 301[(M-H)-132] - dos picos 2 e 3, respectivamente, indicam a presença de uma hexose (glicose ou galactose) devido a perda de 162 Da, e presença de uma pentose (xilose ou arabinose) devido a perda de 132 Da (Figura 39, Tabela 31). 114

115 O pico 4 (t R =12,9min) apresentou íon molecular em m/z 431[M-H] - que gerou o fragmento m/z 285[(M-H)-146] -. Este perfil de fragmentação sugere a perda de uma deoxihexose ligada a aglicona canferol (Figura 39, Tabela 31). Os picos 6 (t R =16,9min) e 7 (t R =17,3min) apresentaram perfil de fragmentação semelhantes aos encontrados para os picos 1 e 2 do cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM de EDiOPom (Figura 35, Tabela 30), indicando que os mesmos flavonoides di-cumaroil glicosilados estão presentes nos extratos diclorometano e acetato de etila de O. pomaderroides. Os picos 5 (t R =15,9min) e 8 (t R =17,7min) demonstraram perfil de fragmentação que sugere a presença de flavonoides glicosilados derivados do canferol, contendo uma ou duas unidades de ácido p-cumárico, respectivamente (Figura 39, Tabela 31). Tabela 31: Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea pomaderroides Pico t R (min) [M-H] - (m/z) Fragmentos (m/z) 1 4, , 693, 559, 531, , , , , , , , , , 559, 413, , , 431,

116 Figura 39: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOPom x Pico 1 (t R =4,9 min) MS, 4.9min # x m/z MS2(863.2), 4.9min # x m/z Pico 2 (t R =10,3 min) MS, 10.3min # x m/z -MS2(463.0), 10.3min # m/z Pico 3 (t R =11,0 min) 116

117 x MS, 11.0min # x m/z -MS2(433.1), 11.1min # x m/z Pico 4 (t R =12,9 min) -MS, 12.9min # x m/z -MS2(863.1), 12.9min # x m/z Pico 5 (t R =15,9 min) -MS, 15.9min # x m/z -MS2(577.1), 15.9min # m/z 117

118 x10 6 Pico 6 (t R =16,9 min) MS, 16.9min # x m/z -MS2(739.1), 17.0min # x m/z Pico 7 (t R =17,3 min) -MS, 17.3min # x m/z -MS2(723.1), 17.4min # x m/z Pico 8 (t R =17,7 min) -MS, 17.7min # m/z 118

119 x MS2(723.1), 17.7min # m/z Tabela 32: Dados obtidos por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) dos compostos detectados nos extratos acetato de etila de Ocotea sp. Pico t R (min) [M-H] - (m/z) Fragmentos (m/z) 1a 5, , 693, 559, 408 2a 6, , 693, 559, 451 3a 10, , 285, 177, , 505, 415, 300, 271, 179 4a 11, , 271, , 565 5a 12, a 12, a 13, a 18, , 577, 559, 437, 285 Os picos 1a (t R =5,5min) e 2a (t R =6,6min) presentes no cromatograma de íons totais de EAcOsp obtido por CLAE-DAD-EM/EM pertencem a mesma classe química devido a semelhança dos seus íons moleculares e perfis de fragmentação, no entanto, não puderam ser identificados com base apenas nestes dados (Tabela 32, Figura 40). O pico 3a (t R =10,7min) possui íon molecular m/z 449 [M-H] - que deu origem aos fragmentos m/z 303 [(M-H)-146] -, 285 [(M-H)-164] -, 177 [(M-H)-272] - e 151 [(M- H)-298] - indicando a presença de um flavonoide glicosilado derivado do canferol. Os picos 5a (t R =12,0min), 6a (t R =12,9min) e 7a (t R =13,4min) também demonstraram íon molecular e perfil de fragmentação que sugere a presença de flavonoides glicosilados derivados da quercetina (5a) e do canferol (6a e 7a) (Tabela 32, Figura 40). O pico 8a (t R =18,3min) apresentou íon molecular m/z 723 [M-H] - da mesma forma que os picos 7 e 8 de EAcOPom (Figura 39, Tabela 31), indicando tratar-se provavelmente de um flavonoide acilado, derivado do canferol devido a presença do fragmento m/z

120 Figura 40: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo negativo) de EAcOsp x10 5 Pico 1a (t R =5,5 min) MS, 5.5min # x m/z -MS2(863.2), 5.4min # x m/z Pico 2a (t R =6,6 min) -MS, 6.6min # x m/z -MS2(863.2), 6.6min # m/z Pico 3a (t R =10,7 min)

121 x MS, 10.7min # x m/z -MS2(449.0), 10.6min # m/z -MS2(595.1), 10.7min # x m/z Pico 4a (t R =11,4 min) -MS, 11.4min # x m/z -MS2(564.9), 11.2min # x m/z Pico 5a (t R =12,0 min) MS, 12.0min # m/z 121

122 x MS2(447.0), 12.1min # x m/z Pico 6a (t R =12,9 min) -MS, 12.9min # m/z -MS2(834.8), 13.0min # x m/z Pico 7a (t R =13,4 min) -MS, 13.4min # x m/z -MS2(431.0), 13.4min # m/z Pico 8a (t R =18,3 min) 122

123 x MS, 18.3min # x m/z -MS2(723.2), 18.3min # m/z As interpretações dos espectros de massas das frações ativas 4/5 (obtida de EDiOPom), 5/6 e 10/7 (provenientes de EDiOPer) foram inconclusivas, havendo a necessidade de análises espectrais adicionais.os cromatogramas de íons totais por CLAE-DAD-EM/EM (modo negativo) de Fr 4/5, 5/6 e 10/7 estão apresentados nos anexos 1 a 3. O espectro de RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) da substância pura proveniente do fracionamento de Fr 5/5 (EDiOPom) mostrou sinais em δ 5,36 (H-6), sugerindo a presença de hidrogênio olefínico e um multipleto entre δ 3,47 a 3,60 (H-3) que pode ser atribuído a hidrogênio ligado a carbono carbinólico. Foram observados ainda sinais entre δ 0,60 e 2,40, característicos de absorções de hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos (Anexos 4 a 6). O espectro de RMN de 13 C registrou a presença de 29 átomos de carbono. Os sinais em δ 140,77 e 121,74 foram atribuídos aos carbonos da ligação dupla entre C-5 e C-6 do esteróide β-sitosterol. Foi observado ainda um sinal em δ 71,83 atribuído ao carbono carbinólico C-3 (Anexos 7 a 10). A comparação dos dados espectroscópicos obtidos com dados descritos na literatura (Tabela 33) permitiu confirmar que a substância isolada do extrato diclorometano de O. pomaderroides trata-se do β-sitosterol. No entanto, como esta não foi a fração mais ativa, não se pode atribuir a esta classe de substância (fitoesteroides) qualquer contribuição para o efeito biológico observado. 123

124 Tabela 33: Dados dos espectros de RMN de 13 C [300 MHz, CDCl 3, δ (ppm)] do β-sitosterol isolado de EDiOPom e valores da literatura* Posição do δ carbono β-sitosterol literatura 1 37,26 37, ,72 31, ,83 71, ,32 42, ,77 140, ,74 121, ,92 31, ,68 31, ,14 51, ,52 36, ,09 21, ,78 39, ,32 42, ,78 56, ,31 24, ,26 25, ,06 56, ,99 11, ,41 19, ,16 36, ,79 18, ,95 33, ,07 26, ,84 45, ,15 29, ,83 19, ,03 19, ,07 23, ,87 11,04 *GRECA, MONACO, PREVITERA, 1990 Uma revisão realizada por Barbosa-Filho et al. (2006) descreveu 260 substâncias naturais relatadas na literatura que foram avaliadas para inibição da atividade acetilcolinesterásica. A maioria das substâncias isoladas, identificadas e testadas são alcaloides (139), enquanto as demais fazem parte das classes dos monoterpenos (27), cumarinas (18), triterpenos (17), flavonoides (14), benzenoides (13), diterpenos (8), sesquiterpenos (5), lignanas (2), entre outras. Não foram descritos até o momento relatos que associem a atividade anticolinesterásica à presença de flavonoides di-cumaroil glicosilados, no entanto, 124

125 um estudo realizado por Santos (2009) indicou que polifenóis derivados do ácido cinâmico, como o ácido caféico, ácido p-cumárico e, principalmente, o ácido rosmarínico apresentam atividade anticolinestererásica, além da atividade antioxidante. Isto sugere que o efeito demonstrado pelos extratos de Ocotea pomaderroides e O. percoriacea descritos neste trabalho podem estar associados à presença das unidades de derivados do ácido cinâmico ligadas aos flavonoides glicosilados presentes nestas espécies estudadas. 125

126 6 CONCLUSÕES De acordo com os resultados obtidos, os extratos hexânicos: EHexOPom, EHexOPer e EHexOsp; diclorometano: EDiOPom, EDiOPer, EDiOS e EDiOsp; e acetato de etila: EAcOPom e EAcOsp foram promissores como inibidores da atividade da enzima acetilcolinesterase, apresentando resultados de inibição superiores a 70%. Isso mostra que estes extratos apresentam potente atividade anticolinesterásica in vitro. As frações obtidas de EDiOPom e EDiOPer também apresentaram atividade anticolinesterásica, em alguns casos, superior ao padrão eserina testado. A análise do perfil químico por CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM/EM dos extratos mais ativos revelou a presença de flavonoides glicosilados derivados da quercetina e do canferol, além de flavonoides di-cinamoil glicosilados como substâncias majoritárias presentes nas amostras testadas. A partir da fração 5/5 (obtido de EDiOPom) foi possível isolar o β-sitosterol, identificado por RMN de 1 H e 13 C. Para melhor caracterização química das substâncias presentes nas frações responsáveis pelo efeito anticolinesterásico observado, serão necessárias análises espectrais adicionais. Este trabalho contribuiu para o conhecimento científico das espécies Ocotea pomaderroides e O. percoriacea presentes no semi-árido baiano e pela primeira vez analisadas do ponto de vista químico e biológico. Além disso, as frações mais ativas 4/5 (provenientes de EDiOPom), 5/6, 9/7 e 10/7 (originadas de EDiOPer) possuem elevado potencial como produto biotecnológico com potente atividade anticolinesterásica. 126

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137 ANEXOS Anexo 1: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 4/5 (EDiOPom) x Pico 1 (t R =14,1 min) +MS, 14.1min # x m/z +MS2(181.1), 14.1min # x m/z Pico 2 (t R =19,7 min) MS, 19.7min # m/z 137

138 x MS2(452.2), 19.9min # x m/z Pico 3 (t R =20,7 min) MS, 20.7min # x m/z MS2(399.0), 20.8min # x m/z Pico 4 (t R =25,5 min) MS, 25.5min # m/z 138

139 x MS2(613.4), 25.7min # x m/z Pico 5 (t R =26,7 min) MS, 26.7min # x m/z +MS2(615.4), 26.9min # m/z 139

140 Anexo 2: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 5/6 (EDiOPer) x10 6 Pico 1 (t R =6,8 min) MS, 6.8min # x m/z MS2(716.0), 6.8min # x m/z MS2(357.7), 6.6min # m/z Pico 2 (t R =7,4 min) 140

141 x MS, 7.4min # x m/z +MS2(744.1), 7.3min # x m/z MS2(372.2), 7.5min # x m/z Pico 3 (t R =7,9 min) MS, 7.9min # m/z 141

142 x MS2(372.1), 7.9min # x m/z MS2(744.1), 7.5min # x m/z MS2(352.2), 7.9min # x m/z Pico 4 (t R =8,3 min) MS, 8.3min # m/z 142

143 x MS2(280.1), 8.4min # x m/z MS2(595.3), 8.4min # x m/z Pico 5 (t R =9,0 min) MS, 9.0min # x m/z MS2(296.0), 9.1min # m/z 143

144 x MS2(591.1), 9.3min # x m/z Pico 6 (t R =9,6 min) MS, 9.6min # x m/z Pico 7 (t R =13,2 min) MS, 13.2min # x m/z +MS2(573.0), 13.2min # m/z Pico 8 (t R =16,4-17,2min) 144

145 x MS, min #( ) x m/z +MS2(724.7), 17.0min # x m/z +MS2(439.0), 16.4min # x m/z Pico 9 (t R =20,7min) MS, 20.7min # m/z 145

146 x MS2(819.4), 20.8min # x m/z MS2(399.1), 21.0min # x m/z Pico 10 (t R =24,0min) MS, 24.0min # x m/z +MS2(667.7), 24.0min # m/z Pico 11 (t R =24,7min)

147 x MS, 24.7min # x m/z +MS2(653.3), 24.8min # x m/z Pico 12 (t R =25,1min) MS, 25.1min # x m/z +MS2(667.5), 25.3min # m/z Pico 12 (t R =25,8min) 147

148 x MS, 25.8min # x m/z +MS2(621.3), 25.8min # m/z 148

149 Anexo 3: Cromatograma de íons totais por CLAE-EM/EM (modo positivo) de Fr 10/7 (EDiOPer) x Pico 1 (t R =12,6 min) +MS, 12.6min # x m/z +MS2(331.0), 12.6min # m/z 149

150 x MS2(202.9), 12.6min # x m/z Pico 2 (t R =19,7 min) +MS, 19.7min # x m/z MS2(457.2), 19.7min # m/z 150

151 x MS2(452.2), 19.7min # x m/z Pico 3 (t R =20,7 min) +MS, 20.7min # x m/z MS2(399.2), 20.7min # m/z 151

152 x MS2(421.1), 20.8min # x m/z Pico 4 (t R =23,2 min) +MS, 23.2min # x m/z MS2(485.3), 23.2min # m/z 152

153 x MS2(421.2), 23.2min # x m/z Pico 5 (t R =24,4-24,7 min) MS, min #( ) x m/z +MS2(637.2), 24.5min # m/z Pico 6 (t R =25,7-26,5 min) 153

154 x MS, min #( ) x m/z +MS2(621.2), 25.9min # m/z 154

155 Anexo 4: Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom 155

156 Anexo 5: Ampliação 1 do espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom 156

157 Anexo 6: Ampliação 2 do espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom 157

158 Anexo 7: Espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom 158

159 Anexo 8: Ampliação 1 do espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom 159

160 Anexo 9: Ampliação 2 do espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom 160

161 Anexo 10: Ampliação 3 do espectro de RMN de 13 C (300 MHz, CDCl 3 ) do β-sitosterol isolado da fração 5/5 de EDiOPom 161