Profª Drª Ilíada Rainha de Souza

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA Profª Drª Ilíada Rainha de Souza

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA Profª Drª Ilíada Rainha de Souza

3 Principal (indicada): Complementares: Klug et al., 2009, cap.11, 14 e 15 Alberts et al., 2008, cap.6 Anthony Griffiths; Susan Wessler; Richard Lewontin; Sean Carroll. Griffiths et al., 2009: (biblioteca Universitária, Xerox) Cap. 8 Transcrição e processamento Cap Proteínas e sua síntese (Tradução) Menks Ribeiro, 2009 (Moodle).

4 Roteiro das Aulas 05 e 06 (cap. 8 e 9) O que são genes? E o genoma? Estrutura de gene Região promotora Região transcrita (Íntrons e Éxons) Regiões reguladoras Transcrição Processamento do RNA [quepe (cap), cauda poli- A e encadeamento (splicing)] Processamento alternativo do RNA (íntron éxon) Tradução ( teórico-prática) Regulação da tradução

5 GENOMAS E SUAS CARACTERÍSTICAS Como estão Organizados os Genomas de diferentes espécies?...e como é a Estrutura dos Genes?

6 Hipótese: Relação do tamanho do Genoma e a complexidade do organismo Constatação...

7 TAMANHO DO GENOMA (pb) Mus musculus Homo sapiens pb pb Escherichia coli Frittilaria assyriaca Amoeba dubia pb pb pb

8 DENSIDADE DO GENOMA (genes/mb) Mus musculus Homo sapiens 12/ pb 9,3/ pb Escherichia coli Frittilaria assyriaca Amoeba dubia 950/ pb nd > 90/ pb

9 Genomas Grande variedade de tamanho e organização O tamanho do genoma é medido pela sua quantidade de DNA: C (haplóide) O tamanho do genoma não se correlaciona com complexidade paradoxo do valor de C

10 Comparação da densidade gênica nos cromossomos para diferentes organismos: Região de 65 kilobases ( pares de bases) de DNA é ilustrada para cada organismo. A região que codifica para a maior subunidade da RNA polimerase (RNA pol II para as células eucariontes) está indicada em vermelho. Notar como o n o de genes codificados dentro do mesmo comprimento de DNA diminui a medida que a complexidade do organismo aumenta.

11 Tamanhos aproximados (em quilobases), espaçamento de genes e o número total de genes em vários organismos representativos Número total de genes ~ Número total de genes ~ Número total de genes ~ Número total de genes ~

12 O que são os genes?

13 O que é um gene? Dogma central da Biologia Molecular

14 O que é um gene? Dogma central da Biologia Molecular

15 EUCARIOTOS X PROCARIOTOS Semelhanças e diferenças

16 Procariotos

17 Esquema de um gene procarioto Região codificadora: contém a informação para o produto do gene (geralmente uma proteína). Regiões regulatórias: contém sequências reconhecidas e ligadas por proteínas que determinam a transcrição e influenciam a quantidade de RNA transcrito by W. H. Freeman and Company

18 Estrutura típica de um gene procarioto DNA +1 Promotor: Sítio de ligação da RNA Polimerase (transcrição) +1 = início de transcrição RBS = sítio ligador ao ribossomo; ATG = códon de iniciação da síntese protéica; Cds ou ORF = seq. codificadora da proteína ou quadro aberto de leitura (open reading frame); STOP = qualquer um dos três códons de finalização da síntese proteica (tradução); terminador = região terminadora da transcrição

19 Estrutura típica de um gene procarioto mrna transcrito do gene

20 UTR = untranslated region (região não traduzida) Estrutura típica de um gene procarioto mrna transcrito do gene

21 Estrutura típica de um gene procarioto mrna transcrito do gene 5'-UTR contém o RBS UTR = untranslated region (região não traduzida) 3'-UTR grampo de terminação

22 Estrutura típica de um gene procarioto mrna transcrito do gene 5'-UTR contém o RBS amino-terminal (N) Região codificante (C) carboxiterminal 3'-UTR grampo de terminação

23 Estrutura típica de um gene procarioto mrna transcrito do gene 5'-UTR contém o RBS aminoterminal (N) UTR = untranslated region (região não traduzida) Região codificante carboxiterminal (C) 3'-UTR grampo de terminação

24 Um promotor regula a transcrição de vários genes ao mesmo tempo Um promotor regula a transcrição de um único gene In:

25 Os genes podem ser expressos sob diferentes taxas. Alberts et al. 2010, Fig 6-3

26 PROPRIEDADES DO RNA 5 3 Geralmente unifilamentar (+ flexível) Tem ribose Tem uracila (U) Pode catalisar reações (ribozimas)

27 Cadeia de polirribonucleotídeos. Ligação fosfodiéster é a mesma que ocorre no DNA. Moléculas de DNA em torno de milhões de pb e de RNA apenas milhares de pb ( ).

28 Enzimas polimerases apareceram duas vezes na evolução RNA-polimerase catalisa ligações fosfodiéster formando uma cadeia linear 5-3 Substratos trifosfatos de ribonucleosídeo Alberts et al. 2010, Fig 6-8

29 PROCARIOTOS INICIAÇÃO A RNA-polimerase (uma única) é composta de várias subunidades, alfa, beta e ômega (2α, β, β, ω) e o fator sigma (σ) Apoenzima (enzima base) + fator sigma = holoenzima RNA-polimerase Ponto chave da regulação gênica! PROMOTOR: sequência especial no DNA que indica o ponto de início de transcrição onde o fator sigma se liga firmemente. Há uma ampla gama de promotores + fortes ou + fracos.

30 Sequências promotoras de diferentes genes bacterianos Fortes sequências promotoras de E.coli Sequências de consenso para todas as sequências promotoras de E.coli TTGACAT TATAAT

31 TRANSCRIÇÃO Alberts et al. 2010, Fig 6-11

32 TRANSCRIÇÃO Funções da RNA polimerase? Alberts et al. 2010, Fig 6-11

33 TRANSCRIÇÃO 1. Reconhecer a região promotora 2. Desnaturar o DNA expondo a seqüência a ser copiada 3. Manter as fitas de DNA separadas na região da síntese Alberts et al. 2010, Fig 6-11

34 TRANSCRIÇÃO 4. Separação do fator σ da RNA polimerase 5. Manter o híbrido DNA:RNA estável 6. Renaturar o DNA na região imediatamente posterior à síntese Alberts et al. 2010, Fig 6-11

35 TRANSCRIÇÃO 7. Terminar a síntese do RNA Alberts et al. 2010, Fig 6-11

36 Funções da RNA polimerase: Reconhecer a região promotora Desnaturar o DNA expondo a sequência a ser copiada Manter as fitas de DNA separadas na região da síntese Manter o híbrido DNA:RNA estável Renaturar o DNA na região imediatamente posterior à síntese Terminar a síntese do RNA

37 TÉRMINO As sequências de TERMINADORES são muito mais heterogêneas do que as de PROMOTORES potencial de formar estruturas em grampo (ex: 5 CCCG...CGGG 3 ) Lewin. Genes IX, Fig

38 Lewin. Genes IX, Fig 7.13 Transcrição e tradução altamente relacionadas nas bactérias (quase simultâneos)

39 Sentidos de transcrição de uma pequena porção de genes bacterianos EXERCÍCIO: Se uma molécula de DNA for transcrita e uma das fitas seja 5 - CAATTTGGTTATGCCC (não molde para o RNA), qual será a sequência 5-3 do RNAm transcrito? Alberts et al. 2010, Fig 6-14

40 Roteiro da Aula 5 (cap. 8 e 9) O que são genes? E o genoma? Estrutura de gene Região promotora Região transcrita (Íntrons e Éxons) Regiões reguladoras Transcrição em Procariotos e Transcrição em Eucariotos Processamento do RNA [quepe (cap), cauda poli- A e encadeamento (splicing)] Processamento alternativo do RNA (íntron éxon)

41 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS -DNA nuclear de eucariotos é linear e empacotado através de histonas vs DNA bacteriano que é circular e não associado a histonas; Alberts et al. 2010, Tab 6-2

42 Estrutura Terciária do DNA em EUCARIOTOS Associação das duas fitas com proteínas - histonas

43 COMPACTANDO O DNA complete as lacunas: ( ) Compactação em intérfase (500x) 1 ( ) DNA descompactado ( ) Cada cromátide é uma molécula de DNA ( ) Solenoide ( ) Cromossomos em metáfase: Maior grau de condensação (10.000x) ( ) Histona H1 8 ( ) cauda N-terminal de histona ( ) Nucleossomo 9 10 EXERCÍCIO ( ) Tetrâmero de histonas H3-H4

44 EUCARIOOS TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS -DNA nuclear de eucariotos é linear e empacotado através de histonas vs DNA bacteriano que é circular e não associado a histonas; -RNA-polimerase tem 3 formas (semelhantes à única polimerase bacteriana) RNA-polimerase em Eucariotos: Forma RNA-polimerase I RNA-polimerase II RNA-polimerase III Produto rrna (ribossômico) mrna (mensageiro), snrna (small nuclear) rrna 5S, trna (transportador) -RNA-polimerase precisa de vários Fatores Gerais de Transcrição (GTF) vs único fator sigma (procariotos) GTFs ajudam 1) a posicionar a RNA-polimerase sobre o promotor, 2) a separar as 2 fitas de DNA e 3) a liberar a RNA-polimerase do promotor TFII = fatores de transcrição da polimerase II (TFII B, TFII D, TFII E, TFII F (mesma estrutura do fator sigma), TFII H, TFII I). Alberts et al. 2010, Tab 6-2

45 COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO (in vitro) TFIID = Fator de Transcrição (TF) da RNA polimerase II TBP = proteína de ligação à região TATA boxe Alberts et al. 2010, Fig 6-16

46 COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO (in vitro) TBP = TATA-binding protein TATA box (-25) Alberts et al. 2010, Fig 6-16

47 COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO (in vitro) TFIID = Fator de Transcrição da RNA polimerase II TFIIB = segundo liga-se ao DNA Alberts et al. 2010, Fig 6-16

48 COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO (in vitro) TFIID = Fator de Transcrição da RNA polimerase II TFIIB = segundo liga-se TFIIE, TFIIH = próximos fatores a ligarem-se à região. A seguir TFIIF e outros fatores ligam-se à polimerase que se unem ao complexo de préiniciação. Alberts et al. 2010, Fig 6-16

49 COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO (in vitro) CTD = domínio C-terminal = 52 repetições de 7 aa, que sofre fosforilação na cauda de carboxila. Alberts et al. 2010, Fig 6-16

50 O processo é ainda + complexo in vivo!!! Alberts et al. 2010, Fig 6-19 Há neste complexo de iniciação de transcrição proteico + de 100 subunidades A RNA-polimerase II precisa se liberar do complexo para polimerizar Depois ela se move aos saltos com ajuda de fatores de extensão que mantém a associação polimerase-dna

51 Fatores de transcrição e RNA polimerase II

52 Região promotora e transcrição Sítio de início da transcrição início da transcrição (+1) [ ]

53 COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO (in vitro) (North Dakota State University) Alberts et al. 2010, Fig 6-16

54 Griffiths et al. Figura 8.2

55 Regiões reguladoras da transcrição Promotores: Sequência da região 5 antes do ponto de início da transcrição, região codante do gene, onde fatores de transcrição (proteínas e/ou RNAs) e a RNA polimerase se ligam para dar início à transcrição. TATA box: Sequência conservada, encontrada na promotora a cerca de 25 a 30 pb anterior (5 ) do sítio de iniciação da transcrição, e onde se ligam complexos proteicos. Enhancer: É uma sequência de DNA próxima a região promotora que é capaz de aumentar a capacidade desta.

56 Regiões reguladoras da transcrição Início da Transcrição: É determinado por duas sequências curtas localizadas aproximadamente nos nucleotídeos -35 (aproximadamente 20 pares de bases da região TATA box) e -10, onde a polimerase se liga. Ocorre antes do AUG de início da Tradução. Estas sequências são bastante conservadas, assim como o espaçamento.

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58 Modificações co- e póstranscrição

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60 Processamento do RNA co-transcricional Quepe 5 (Cap 5 ): Estrutura de 7-metilguanosina adicionada aos mrna eucarióticos após a transcrição; auxilia na estabilidade da molécula e na iniciação da síntese protéica, podendo servir também de proteção. Cauda Poli-A: Parece ter várias funções: (1) auxilia na exportação do RNAm maduro para o citoplasma; (2) afeta a estabilidade do mrna; (3) parece servir como um sinal de reconhecimento para o ribossomo. A cauda poli-a em combinação com o quepe 5 mantém a conformação secundária circular da molécula de mrna ativa e permite ao ribossomo determinar se o mrna está intacto.

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62 PROCESSAMENTO DO RNA PÓS- TRANSCRIÇÃO (SPLICING)

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64 Gene HBB - Hemoglobina Íntron 1 Íntron 2

65 Processamento do RNA pós transcrição Sítio doador Transcrição 5 3 Sítio aceptor...éxon 1...Éxon 2...Éxon 3...Éxon 4...Éxon 5...Éxon 6...Éxon 7 TCAAAAGGTAGGCA AAATAAGGTGAGCC AGCTCAGGTACAGA CCTGCCAGTAAGTT ACAAATGGTAAGGT GACTGAGGTATATG TGAGAGGTATGGC Íntron A Íntron B Íntron C Íntron D Íntron E Íntron F Íntron G GCTCTAGACAACT ATTACAGGTTGTT TATTCAGTGTGGC TTTACAGGAATAC CTTAAAGGAATTA GCTCAAGCAAGAA CTTGCAGCTTGAG Éxon 2... Éxon 3... Éxon 4... Éxon 5... Éxon 6... Éxon 7... Éxon 8... Sequências permitidas: ggtaag gguaag cagg Comparação entre sequências nos limites éxon-íntron do gene da albumina

66 Splicing ou processamento do RNA transcrito primário

67 Processamento do RNA pós transcrição Exón: Sequência transcrita em RNA e é mantido na molécula funcional (mrna), após o processamento (splicing). A união dos éxons monta a região codificadora, assim como a 5 UTR e 3 UTR (todas presentes no mrna maduro). Íntrons: Sequência transcrita, portanto presente no pré-mrna, mas removida durante o processamento, não estando presente na molécula de mrna madura. Para isto as regiões que flaqueiam os íntrons (ou éxons) são ligadas, formando o RNAm maduro. Um gene pode conter um grande número de íntrons e estes podem ser bem maiores que a região contida nos éxons.

68 Processamento do RNA pós transcrição Splicing: Processo que ocorre durante a maturação do mrna eucariótico, onde ocorre a remoção de íntrons e a união dos éxons. É o mesmo que processamento do mrna. Junção de splicing: Sequência de DNA que cerca o limite entre um éxon e um íntron. Há um grau de conservação nestas regiões, permitindo a identificação e remoção correta dos íntrons.

69 Conceitos de Genética William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer & Michael A. Palladino transcrito primário Pré- RNA ribossomal (a) Interação de guanosina, a qual age como co-fator de reação com o transcrito primário; (b) Grupo 3 OH da guanosina é transferido para o nucleotídeo adjacente à extremidade 5 do íntron; (c) E à extremidade 3 do íntron; (d) O íntron é removido e as RNA ribossomal regiões dos dois éxons são

70 Processamento após Transcrição Splicing O splicing consiste na retirada dos íntrons de um RNA precursor (heterogêneo nuclear - hnrna), de forma a produzir um mrna maduro funcional. Essa excisão dos íntrons do mrna é um evento muito importante e requer uma extrema precisão das enzimas envolvidas no processo (small nuclear RNAs - snrnas). A falta ou o acréscimo de um único nucleotídeo em um éxon pode levar a uma alteração da fase de leitura e a produção de uma proteína completamente diferente da original.

71 Conceitos de Genética William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer & Michael A. Palladino Pré- RNA mensageiro mrna Modelo de remoção de íntrons do pré-mrna de origem nuclear no mecanismo de encadeamento (splicing): A excisão depende de cinco pequenas riboncleoproteínas nucleares (snrnp- snurps) que são complexos de proteínas e um dos 5 snrnas (U1,U2, U4, U5,U6), as quais atuam como parte integrante de uma grande estrutura chamada spliceossomo. A estrutura em laço é típica

72 PROCESSAMENTO Do Transcrito Primário à Proteína A guaniltransferase adiciona 7- metilguanosina (cap = quepe) (5 +2) [ ~1800 nucleotídeos] Cauda poli-a: 150 a 200 nc

73 Remoção do Íntron por snrna

74 PROCESSAMENTO ALTERNATIVO (SPLICING)

75 Figure 8-14 Padrão complexo de splicing de mrna em eucariontes. O transcrito premrna do gene α-tropomiosina é alternativamente processado em diferentes tipos de células. As caixas verdes claras (, entre os números) representam íntrons e as outras cores de caixas representam éxons. Poliadenilações são indicadas por um A. Linhas pontilhadas nos mrnas maduros são indicações de regiões removidas por splicing. TM = tropomiosina. ( J. P. Lees et al., Molecular and Cellular Biology 10, 1990, ).

76 Splicing ou processamento alternativo - o mecanismo que pode explicar a enorme diferença entre o tamanho modesto do conjunto de genes humano e a elevada complexidade do proteoma. -Estima-se que mais de 50% dos genes humanos são alternativamente processados - Alguns genes podem gerar muitas isoformas de proteínas por eventos complexos de splicing alternativo. -A análise do transcriptoma (conjunto de mrnas do ser vivo ou da célula em estudo) poderá ajudar a decifrar splicing alternativo.

77 Os Exons Mais correto dizer: Éxons sequências que permanecem no RNA após a remoção dos íntrons Splicing alternativo??? O que é éxon em um momento pode ser íntron em outro momento e vice-versa É preciso estar alerta sobre esta dificuldade conceitual, que de fato não tem solução

78 Exemplo de processamento alternativo HLA-G 44 alelos 14 variantes protéicas (Robinson et al., 2006) (Donadi et al., 2011)

79 MECANISMOS DE RNA DE INTERFERÊNCIA

80 RNAi (RNA interferente ou RNA de interferência) é um mecanismo exercido por moléculas de RNA complementares a RNAs mensageiros, as quais inibem a expressão gênica na fase de tradução ou dificulta a transcrição de genes específicos...

81 TRANSCRIÇÃO X REPLICAÇÃO (S = semelhança / D = diferença) complementariedade por pareamento de bases (S) mas com U ao invés de T (D) síntese a partir de DNA (S) só uma fita do DNA de cada gene é molde, dependendo do promotor (D) o RNA não fica ligado ao molde muitas cópias ( / h / gene) (D) 1 molécula de DNA = milhões pb; 1 molécula de RNA milhares de bases (D) Síntese de RNA não há primer RNA polimerase erra 1000 X mais que a DNA polimerase (D)

82 Depois da aula é a hora de ver o que vc aprendeu...

83 Complete os exercícios que estão no moodle!!

84 Faça os exercícios para comentários na próxima aula!!

85 Literatura indicada: Griffiths et al., 2009: (biblioteca Universitária, Xerox) Cap. 8 Transcrição e processamento Cap.9 - Proteínas e sua síntese (Tradução) Griffiths et al., 2009 Complementares: Klug et al., 2009, cap.11, 14 e 15 Alberts et al., 2008, cap.6 Menks Ribeiro, 2009 Moodle.

86 MATERIAL COMPLEMENTAR: TRANSCRIÇÃO Animação: (AVANÇADO) - DNA Learning Center de mar de (Oxford University press). (by Canadian Museum of Nature) transcrição e tradução (Oxford University, 2014). - Regulação da Transcrição (North Dakota State University )

87 PROCESSAMENTO DO RNA Animação (Jack Slater) (cap e cauda poli-a) (splicing) (Publicado em 7 de jan de 2015)