Aula 2. Replicação, Transcrição, Tradução e Regulação

Transcrição

1 Aula 2 Replicação, Transcrição, Tradução e Regulação

2 Dogma Central da Biologia Molecular

3 Replicação Replicação é o processo de duplicação de uma molécula de DNA que antecede a divisão celular. Semiconservativa Bidirecional Semidescontínuo

4 Aqui temos a bolha de replicação: em eucariotos ocorrem múltiplas bolhas de replicação e em procariotos, apenas uma bolha de replicação (4) RNA primase: responsável pela localização dos iniciadores da replicação e ancoragem da DNA polimerase (extremidade 3 livre) Semiconservativa (5) DNA polimerase: responsável por adicionar os nucleotídeos na nova fita. (2) Helicase: abertura da fita dupla de DNA, especificamente em regiões ricas em AT (3) Proteínas de ligação: Protege a fita simples e auxilia na ligação da DNA polimerase (1) Topoisomerases: responsáveis pela liberação da fita dupla de DNA, anteriormente compactada como cromátides

5 Hipóteses Semiconservativa Meselson e Stahl em 1958

6 (7) Semidescontínua: Adição de nucleotídeos pela DNA polimerase obrigatoriamente no sentido 5 3. Fita continua (cadeia condutora) e fita descontínua (cadeia atrasada) que gera os fragmentos de Okazaki (5) DNA polimerase: Mg2+ é necessário para estabilização a ligação fosfoéster entre os nucleotídeos. Bidirecional e Semidescontínua (8) DNA primase: responsável por sintetizar os RNA primers na fita descontinua. Enquanto na fita continua é a RNA primase (6) Alongamento: Ambas as fitas são alongadas simultaneamente pela adição de nucleotídeos pela DNA polimerase no sentido 5 3 (Bidirecional) (9) DNA ligase: responsável pela ligação dos fragmentos de Okazaki

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8 Terminação em Eucariotos Na extremidade dos cromossomos ainda são necessário a adição de um RNA primer. Caso isso não ocorresse, pedaços finais do cromossomo seriam perdidas. Em insetos são regiões em tandem (TTAGG) que permitem o posicionamento do RNA primer e o fechamento da replicação. A telomerases são enzimas responsáveis por adicionar nucleotídeos no final de cada cromossomo (os telomeros). Os telomeros também tem a função de evitar continuidade da transcrição e eventualmente ligação entre os cromossomos

9 Tipos de DNA Polimerase: Procariotos DNA polimerases procariotos (I, II, III) DNA polimerase eucariotos múltiplas DNA polimerase mitocôndrias única Tipo em procariotos DNA Polimerase I DNA Polimerase II DNA Polimerase III Função crescimento no sentido 5 3, atividade de exonuclease 3 5 e 5 3 (processo de reparo) Polimerase alternativa de reparo É a polimerase primária durante a replicação normal do DNA, crescimento no sentido 5 3.

10 Tipos de DNA polimerase: Eucariotos DNA Polimerase em eucariotos DNA Polimerase α DNA Polimerase β DNA Polimerase γ DNA Polimerase δ DNA Polimerase ε DNA Polimerase ζ Função Replicação do cromossomo nuclear (fita lagging) Reparo de DNA no preenchimento de espaços do cromossomo nuclear. Análoga a Polimerase I Replicação do DNA mitocondrial Replicação do filamento leader a da lagging do cromossomo nuclear Reparo do DNA do cromossomo nuclear Aparentemente reparo de DNA

11 Tipos de DNA polimerase: Eucariotos DNA Polimerase em eucariotos DNA Polimerase α DNA Polimerase β DNA Polimerase γ DNA Polimerase δ DNA Polimerase ε DNA Polimerase ζ Função Replicação do cromossomo nuclear (fita lagging) Reparo de DNA no preenchimento de espaços do cromossomo nuclear. Análoga a Polimerase I Replicação do DNA mitocondrial Replicação do filamento leader a da lagging do cromossomo nuclear Reparo do DNA do cromossomo nuclear Aparentemente reparo de DNA

12 Fidelidade da Replicação e Reparo Devido aos erros proporcionados durante a replicação e por fatores endógenos e exógenos ao ambiente celular é necessário que ocorra os mecanismos de reparos Os mecanismos de reparo são os responsáveis pela conservação das características do organismo, protegendo o organismo de danos no genoma que podem levar mutações nocivas

13 Tipos de Mutações Mutações Transição: Envolve mudança entre purinas (A e G) ou entre pirimidinas (T e C) Transversão: Envolve mudança entre purinas (A ou G) e pirimidinas (T ou C) Inserção / Deleção (Indels): ocorre pela adição / remoção de um ou mais nucleotídeos na sequência de DNA

14 Transcrição Transcrição é o processo de formação do RNA mensageiro (mrna) a partir da cadeia-molde de DNA, sendo o primeiro estádio da expressão genica. Gene é toda o DNA que codifica a sequência primaria de um produto gênico final, seja ele um polipeptídio ou RNA, com função catalítica ou estrutural Conceito da colinearidade da informação genética (Beadle & Tatum, 1940s) Um gene Um gene Uma enzima Uma proteína

15 Transcrição Os genes eucarióticos são organizados em: - Exons : sequências de DNA codificadoras de proteínas, presentes no mrna já processado; - Introns: sequencias não codificadoras eliminadas do pré-mrna na preparação do mrna processado.

16 Transcrição: Eucariotos - RNA polimerase: - Tipo I: reconhece os promotores e é responsável pela confecção do rrna (RNA ribossonal); - Tipo II: reconhece os promotores e é responsável pela confecção do mrna (RNA messageiro) e snrna; - Tipo III: reconhece os promotores e é responsável pela confecção do trna (RNA transportador), ribossômico 5S e snrna;

17 Transcrição: Eucariotos - Reconhecimento e ligação da RNA polimerase - Início da transcrição - Elongação - Término

18 Transcrição: Eucariotos - Reconhecimento e Início da transcrição (mrna): é realizado pelas proteínas TFIID e pelos fatores de transcrição que são proteínas reconhecem os promotores (TATA box) e acoplam a RNA polimerase para o inicio da transcrição com a abertura da fita de DNA Agentes reguladores = enhancers (upstream or downstream)

19 Transcrição: Eucariotos - Elongação: A RNA polimerase se desloca pela molécula de DNA, desenrolando sua hélice e produzindo o pré-mrna. O DNA já transcrito volta a ser enrolado, quase que imediatamente, recompondo a sua dupla-hélice.

20 Transcrição: Eucariotos - Término: O final da transcrição ocorre quando a RNA polimerase encontra o sinal de terminação poly A codificado pelos nucleotídeos AAUAAA (dowstream).

21 Transcrição: Eucariotos - Processamento do Pré-mRNA: Guanina metilada: direciona a ligação do ribossomo O splicing do RNA é realizado por complexo proteico composto por mais de 50 proteínas e cinco tipos de snrna (U1, U2, U4, U5 e U6) conhecido como spliceossomo Enzima Poly A polimerase: proteção do mrna

22 Regulação: Eucariotos Splicing alternativo

23 Transcrição: Procariotos - Promotores RNA polimerase:

24 Expressão do mrna

25 Tradução Tradução é o nome dado ao processo biológico no qual a sequência nucleotídica de uma molécula de mrna (RNA mensageiro) é utilizada para ordenar a síntese de uma cadeia polipeptídica, cuja sequência de aminoácidos determinam uma proteína.

26 Tradução Ribossomo Eucarioto = Moléculas de RNA + Proteínas (60:40) - Compostos por duas subunidades (maior e menor) - Subunidade menor se liga ao mrna e ao trna - Subunidade maior catalisa a reação peptídica O Ribossomo apenas se monta completamente no início da alongamento

27 Tradução O trna ou RNA transportador carrega os resíduos de aminoácidos até os ribossomos para a síntese de proteínas. - Braço aceptor: Na região terminal 3 existe uma sequencia de fita simples conservada (CCA), onde ocorre a ligação com o aminoácido. - Braço TψC: pseudorina (ψ) e a ribotimidina (T) - Braço D: diidrourina (D) - Braço anticódon: onde se localiza a trinca do anticódon que reconhece o códon do mrna.

28 Tradução A enzima trna aminoacil sintetase é responsável pela ligação do aminoácido ao seu trna especifico, chamado de aminoacil trna A ligação do t-rna com o AA consiste no passo de ativação da transcrição Existe uma enzima específica para cada AA

29 Tradução O Código genético - Universal - Específico - Degenerado

30 Tradução Iniciação: ligação da subunidade pequena e do metionina-aciltrna no sitio AUG (importante ponto de regulação gênica)

31 Tradução Elongação da cadeia: o polipeptídio nascente é alongado pela ligação de novos aminoácidos

32 Tradução Seleção do aminoacil-trna correto Vários ribossomos podem promover a tradução em uma mesma fita de mrna ( 25 AA)

33 Tradução Terminação: o aparecimento de um codão de terminação UAG, UGA ou UAA determina a ligação de um Fator de Libertação, ou erf. Este fator de libertação determina a quebra da ligação entre o último aminoácido e seu trna.

34 Pós-Tradução: Chaperonas Complexo proteico que auxilia na montagem da estrutura 3D de uma proteína

35 Pós-Tradução: Algumas modificações Várias modificações podem ser impostas à cadeia polipeptídica após a sua biossíntese. As principais modificações são: Redução do Tamanho: Conversão de proteínas inativas e zimogênios nas suas formas ativas, por remoção de sequências de aminoácidos catalisadas por endoproteases específicas. Alterações Covalentes: Fosforilação, glicosilação, hidroxilação, etc. Algumas proteínas são ainda endereçadas a organelas.

36 Regulação: Eucariotos Genes constitutivos (housekeeping genes): proteínas essenciais para a manutenção da vida, normalmente envolvida em processos básicos como geração de energia, replicação e manutenção do material genético (expressos em todas as células). Embora os chamados genes constitutivos sejam expressos constitutivamente, as concentrações celulares das proteínas codificadas por eles variam grandemente. Isso porque, as diferenças nas sequências de seus promotores permitem à célula sintetizar as quantidades apropriadas do produto de cada gene constitutivo

37 Regulação: Eucariotos Fatores que influenciam na regulação gênica Hormônios Fatores de Crescimento e de Diferenciação Celular Contato célula-célula (adesão celular) Alterações nutricionais (resposta é limitada!) Alterações ambientais

38 Regulação: Eucariotos Mecanismos pré-transcricionais Acetilação de histonas é necessária para abertura da fita de DNA e exposição dos promotores para que ocorra a transcrição Fosforilação de proteínas como os fatores de transcrição Metilação de bases nitrogenadas (citosina), nas ilhas de CpG, localizados próximas os sítios de transcrição (inibe a transcrição); Mecanismos pós-transcricionais Splicing alternativo Mecanismos pós-traducionais

39 Mitocôndrias 1. É um genoma pequeno (aprox 16 kb nos animais) e circular, com raras exceções; 2. Apresenta herança materna e ausência de recombinação, com raras exceções; 3. Possui 37 genes (13 codificadores de proteínas, 22 para RNA transportadores e 2 ribossômicos). Esse genes codificam apenas 5% dos produtos necessários para o funcionamento da mitocôndria; 4. Possui uma região não codificadora, conhecida como D-loop (vertebrados) ou região rica em A+T (invertebrados) - controle da replicação e transcrição;

40 Mitocôndrias 5. Genoma compacto, pois raramente possui sequências espaçadoras, sequências repetitivas, pseudogenes e íntrons; 6. O conteúdo gênico é bastante conservado, e a ordem em que esses genes se encontram organizados no genoma costuma ser também conservada; 7. A taxa evolutiva, ou seja, de substituições de base é muito alta, quando comparada a do genoma nuclear.

41 Mitocôndrias O código genético é mesmo universal? Universal Mitocôndrias

42 Mitocôndrias Código genético alternativo em mitocôndrias Códon Usual Mitocondrial UGA AGA AGG Stop Arg Arg Trp Stop Stop AUA Ile Met AGA Arg Ser

43 Mitocôndrias Código genético alternativo em mitocôndrias Pareamento códon-anticódon durante a tradução de proteínas. Nas mitocôndrias, o código genético é diferente do universal, e grande parte dos códons não apresentam pareamento nas três bases. Este trna, por exemplo, codifica a treonina (trh), seja qual for o códon para treonina presente no mrna. - A célula eucariota possui: 61 trna - A mitocôndria possui 22 trna (quase todos os trnas mitocondriais reconhecem dois ou quatro códons diferentes)