Aula de Bioquímica II. Tema: Transcrição. Prof. Dr. Júlio César Borges

Transcrição

1 Aula de Bioquímica II Tema: Transcrição Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP borgesjc@iqsc.usp.br

2 Dogma central da Biologia

3 Ácidos Ribonucléicos - RNA Participam diretamente da síntese de proteínas

4 Ácidos Ribonucléicos - RNA Tipos de RNA Tipo de RNA Tamanho Função RNA ribossômico (rrna) Variado Síntese de proteínas; Conta com a ajuda de proteínas ribossomais RNA de tranferência (trna) Pequeno Transportar aminoácidos para os Ribossomos Funciona como um adaptador RNA mensageiro (mrna) Variável Codifica a síntese de proteínas Pequenos RNAs nucleares (SnRNAs) Pequeno Maturação do mrna; transporte de proteínas; outras

5 Transcrição DNA RNA Síntese de RNA dirigida pela complementaridade com o DNA Fita molde 3 5 Não-codificante Fita codificante 5 3 Ambas as fitas do DNA podem ser Codificantes

6 Transcrição Síntese de RNA dirigida pela complementaridade com o DNA A fita molde para a síntese de RNA é a 3 5 ou não-codificante - Fita codificante no DNA é correspondente ao RNA T U

7 Transcrição DNA RNA Reação de polimerização catalisada pelas RNA polimerases RNA Polimerase DNA Dependente - Síntese segue a direção Similar às DNApol sem similaridade estrutural Evolução convergente

8 Síntese do RNA Síntese dirigida por complementaridade com o DNA RNA-polimerase DNA-dependente Coordenada da Reação

9 Síntese do RNA Síntese dirigida por complementaridade com o DNA RNA-polimerase DNA-dependente Reação de Polimerização Adição contínua de NTPs livres na extremidade 3 da fita crescente nucleotídeo livre está ativado Especificidade requer pareamento complementar; Envolve dois íons metálicos, usualmente Mg 2+ ; - Um ativa o grupo 3 OH do ribonucleotídeo incorporado para o ataque nucleofílico ao grupo fosfato alfa do NTP que entra; - O outro orienta e estabiliza eletrostaticamente o grupo trifosfato (grupo abandonador)

10 Transcrição RNA polimerase DNA dependente RNApol - Síntese dirigida pela complementaridade com a fita do DNA não-codificante Fita molde = fita não-codificante 1º Fase: Iniciação 2º Fase: Elongação 3º Fase: Terminação

11 RNA polimerase RNA polimerase (RNApol): holoenzima (subunidades)

12 RNA polimerase O cofator 70 participa do complexo de iniciação - Ele varre o DNA à procura do promotor do gene

13 Transcrição RNA polimerase DNA dependente RNApol

14 RNA polimerase Estrutura do complexo

15 Transcrição Elongação A RNApol abre a dupla-hélice do DNA e a desespiraliza a sua frente - A RNApol forma uma bolha de síntese duplex RNA-DNA substratos são os NTPs hidrólise das ligações fosfodiéster fornece a energia necessária dirige a termodinâmica da Reação A fita de RNA sintetizada se desliga do DNA molde e este se hibridiza novamente com a sua fita complementar A RNApol segura o DNA pelos dois lados da bolha de síntese

16 Transcrição A RNApol possui alta processividade - Polimeriza ribonucleotídeos por segundo Possui taxa de erro maior do que no DNA 1 base em 1000 os danos de erros da RNApol são limitados ao seu produto Pode ocorrer a síntese de vários mrnas a partir de um mesmo Gene Várias RNApol no mesmo gene molde em intervalos regulares

17 Transcrição Iniciação Sinais de início e fim da transcrição de um gene no DNA - flanqueiam a região a ser transcrita Fator sigma Apresentam sequências consenso existe heterogeneidade O início da transcrição é um ponto de regulação importante - diferenças estão relacionadas com a força e freqüência da ativação do promotor - ajuste fino evolutivo à necessidade do produto gênico São sequências assimétricas apenas uma das fitas de DNA deve ser reconhecida!!! a identificação da orientação para a Síntese pela RNApol na direção 5 3

18 Transcrição Terminação região rica em AT que precedida de uma sequência Palindrômica - região AT forma interações DNA-RNA fracas - forma grampos de RNA autocomplementar efeito estérico na RNApol liberação do DNA Efeito total dissociação simultânea do DNA-RNA-RNApol - sequências consenso mais variáveis do que as de iniciação Existem enzimas que catalisam a terminação

19 Dissociação DNA-RNA Fator Rho: helicase que desenrola DNA-RNA separando o último do molde

20 Polimerização em procarioto A RNApol liga fracamente ao DNA e desliza sobre ele antes de dissociar - a RNApol reconhece o promotor por contatos deste com o Fator Sigma O fator sigma ajuda a RNApol abrir a fita dupla de DNA na região do promotor sem gasto de ATP mudanças conformacionais na RNApol ativa a polimerização - início da polimerização pela ligação de dois NTP complementares adjacentes Após ~10 bases polimerizadas Mudanças conformacionais e a progressão da RNApol saída do fator sigma RNApol sofre outras pequenas mudanças conformacionais que permitem a progressão da polimerização Elongação - O desligamento do fator sigma cria um túnel de saída de RNA transcrito - mudanças conformacionais adicionais garantem que a RNApol não se dissocia do DNA antes do terminador A polimerização prossegue até a RNApol encontrar o sinal de terminação A RNApol dissocia-se do DNA e se liga novamente ao fator sigma

21 Polimerização em procarioto

22 Polimerização em procariotos Muitas substâncias inibem a RNApol de bactérias Inibidores: - Rifampicina é um antibiótico que inibe a elongação da cadeia de RNA por se ligar na RNApol antes da iniciação; - actinomicina D se intercala na dupla fita de DNA

23 Polimerização em eucarioto é diferente de procarioto A complexidade estrutural dos eucariotos impõem necessidades

24 Polimerização em Eucariotos Complexidade da Transcrição em eucariotos 3 tipos de RNApol transcrição de diferentes tipos de RNA - RNApol I e III muitos trnas, rrnas e vários snrnas - RNApol II muitos genes codificadores de proteínas Necessitam dos Fatores Gerais de Transcrição - Transcription Fator for Polimerase II TFIIA, TFIIB, etc - Identificam o promotor e forma uma placa-suporte para a RNApol - Desempacotamento do DNA e outras estruturas da cromatina - Ajudam a posicionar a RNApol corretamente no promotor - Separação das fitas de DNA TFIIH (atividade helicase) gasto de ATP - Liberam a RNApol no modo de extensão - Complexo de iniciação de transcrição reunião de mais de 8 TFII

25 Polimerização em Eucariotos

26 Polimerização em Eucariotos TATA-box ~ 30 bases a upstream do sítio de início do transcrito - principal sequência consenso da RNApol II existem outras Eucariotos contam com ativadores e repressores localizados a grandes distâncias da sequência promotora

27 Polimerização em Eucariotos Fatores Gerais de Transcrição TFIID identifica o TATA-box TATA-Binding protein = TBP - 25 bases a upstream do sítio de início da transcrição A ligação distorce o DNA dupla fita na região de ligação - Marco físico para a transcrição Sítio de hospedagem para outros fatores

28 Polimerização em Eucariotos Fatores Gerais de Transcrição Fosforilação da cauda da RNApol pelo TFIIH (atividade kinase) ativação da RNApol no modo extensão Ligação de outras proteínas evita o Desligamento da RNApolII do DNA a ser transcrito fatores de extensão Os TFII estão livres do complexo de iniciação de transcrição para ativarem outro gene Ligação na Cauda da RNApolII de fatores de processamento do RNA transcrito

29 Polimerização em Eucariotos

30 Polimerização em Eucariotos Fatores de extensão - evitam a dissociação da RNApolII do DNA a ser transcrito - auxiliam na superação de regiões muito compactas da cromatina complexos remodeladores de cromatina -Topoisomerases eliminam as supertorção gerada pelo avanço da RNApolII na extensão do DNA. Ativadores transcricionais - ligam especificamente ao DNA e ajudam a atrair a RNApol II para o complexo de iniciação de transcrição - superar o empacotamento do DNA - recrutamento dos mediadores - recrutamento de enzimas modificadoras de cromatina remodeladores de cromatina e acetilases de histonas - aumento do acesso ao DNA na cromatina Aumentam a taxa de síntese de mrna

31 Síntese do RNA O RNAs são editados ou sofrem processamento!!!

32 mrnas O mrnas são editados de duas formas Modificações no 5 Introdução do Cap Reduz exposição à Nucleases e fosfatases Cap: mrna de eucarioto possui um cap de 7-metilguanosina adicionado ao nucleosideo 5 inicial via uma ponte 5-5 trifosfato

33 mrnas O mrnas são editados de duas formas: Modificações no 3 Poliadenilação - Estabiliza tradução - Aumenta o tempo de vida do mrna

34 Processamento de mrna Genes de eucariotos consistem de sequências que são expressas (éxons) e que não são expressas (introns) e que se alternam.

35 Processamento de mrna Genes de eucariotos consistem de sequências que são expressas (éxons) e que não são expressas (introns) e que se alternam.

36 Processamento do mrna O mrnas podem ser processados de forma que as proteínas codificadas por eles podem ser diferentes Introns e Éxons Differential Splicing Processamento Alternativo - Permite o controle combinatório aumenta a diversidade protéica

37 Processamento do mrna O mrnas podem ser processados de forma que as proteínas codificadas por eles podem ser diferentes

38 SnRNAs O papel dos pequenos RNAs nucleares (snrna) na edição do RNA snrna < 300 pb Contém proteínas Complexos snrnps Small nuclear ribonucleoproteins Particles snurps Interação dos smrnas com os RNAs levam à formação do Spliceossomo

39 SnRNAs O papel dos pequenos RNAs nucleares (snrna) na edição do RNA Identificação e alinhamento do local de corte e catálise A interação dos snrna-rna ocorre por complementaridade de bases

40 SnRNAs O papel dos pequenos RNAs nucleares (snrna) na edição do RNA Identificação e alinhamento do local de corte e também Catálise Mecanismo de Catálise