ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO METANOLICO de Thuya occidentalis

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1 ESTUD FITQUÍMIC D EXTRAT METANLIC de Thuya occidentalis Geyse do Carmo Diniz SAMPAI 1 (PG) geysampaio@hotmail.com Luziane da Cunha BRGES 2 (IC) (Bolsista PIBIC/CNPq) Wannigleice de Sousa AMRIM 2 (IC) (Bolsista PIBIC/CNPq). Milton Nascimento da SILVA 3 (PQ) (rientador) 1 Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Pós-graduação em Química. 2 Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Curso de Química Industrial. 3 Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Pesquisador-CNPq/UFPA. RESUM: Thuja occidentalis (Cupressaceae), é usada principalmente como fitoterápico, na forma de capsulas, tintura ou diluição; baseando-se em evidências fitoterápicas para infecções agudas e crônicas do trato respiratório superior, e como um adjuvante para antibióticos em grave infeções bacterianas, tais como bronquite, angina, faringite, otite média e sinusite. Por tanto se faz necessária a investigação química da planta para determinar, que ou quais compostos lhe confere estas bioatividades, assim foi possível obter a partir do extrato etanólico da espécie substancias da classe dos flavonóides; estes pertencem a uma classe de compostos naturais de considerável interesse científico e terapêutico. Palavras-chaves: Thuya occidentalis, flavonoides, CLAE. Área: Química Sub-área: Química rgânica Área temática: PRDUTS NATURAIS (PNAT) 1. INTRUDUÇÃ Thuya occidentalis é uma planta da família das Cupressaceae, também conhecida como pinheiro de cemitério, árvore-da-vida, cedrinho, ciprestes, tuia americana. Trata-se de árvore frondosa, de ramos folhosos mais ou menos horizontais e com copa no formato de pirâmide. Seu crescimento é lento e pode atingir até 20 metros de altura. s ameríndios usavam a tuia para problemas como dores de cabeça, febre e reumatismo e queimavam-na para "limpar" o ar. Atualmente, ela é usada principalmente como fitoterápico, na forma de capsulas, tintura ou diluição. Em combinação com outras plantas imunomoduladores; esta planta medicinal também é usada como baseada em evidências fitoterapia para infecções agudas e crônicas do trato respiratório superior, e como um principio ativo para antibióticos em grave infeções bacterianas, tais como bronquite, angina, faringite, otite média e sinusite. A tuia é sobre tudo usada em verrugas, embora 698

2 seja útil em outros problemas infecciosos, especialmente na sinusite, abcessos nos dentes, bronquite, cistite e infecções fúngicas (NASER, 2005). Várias propriedades terapêuticas dos flavonóides, principalmente da quercetina, têm sido estudadas nas últimas décadas, destacando-se o potencial antioxidante, anticarcinogênico e seus efeitos protetores aos sistemas renal, cardiovascular e hepático, e sobre a quercetina, se destacam suas fontes dietéticas, consumo alimentar, metabolismo, biodisponibilidade e efeitos benéficos à saúde (BEHLING, 2004). 2. BJETIVS Investigar a composição química das partes aéreas de Thuya occidentalis; e desenvolver, tratamento de amostra e métodos cromatográficos via CLAE semi-preparativo que sejam eficientes para obtenção das substancias puras, em menor espaço de tempo e com menor custo. Caracterizar as estruturas químicas isoladas por técnica espectrométrica de Ressonância Magnética Nuclear; desenvolver a valorização da espécie quanto a sua composição química. 3. METDLGIAS Procedimentos gerais s espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono-13, homo e heteronuclear, foram obtidos em espectrômetros Mercury Plus NMR, operando em 75 MHz para o 13 C e 300 MHz para o 1 H. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência analítico, da marca Shimadzu, constituído por uma bomba solenóide com quatro canais modelo LC-20AT, detector de arranjo de diodo modelo SPD-M20A, degaseificador de membrana modelo DGU-20As, auto-injetor de amostras modelo SIL-20A, interface de comunicação modelo CBM-20A acoplado a microcomputador Pentium IV com software de integração LCsolution. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência semi-preparativo, da Shimadzu, composto por duas bombas, modelo LC-6 AD, degaseificador de membrana DGU-20A- SR, detector com duplo canal de absorbância na região do ultravioleta e do visível, modelo SPD-10AV, operando com comprimento de onda 254 nm, injetor de amostras Rheodyne 7752, com alça de amostragem de 200 e 500 μl. Interface de comunicação CBM-20A, acoplado a um microcomputador com software de integração LC solution versão 1.25SP1. 699

3 Material vegetal material botânico foi coletado no dia 13 de julho de 2011 ás 11 horas em Itajai Santa Catarina; a identificação botânica foi feita por comparação com exsicata, do herbário virtual REFLRA. A amostra foi submetida ao processo de secagem em estufa a 40ºC durante seis dias para retirada de umidade, obtendo-se assim 200g de material seco e triturado. Extração e isolamento dos constituintes químicos Testes de extração foram realizados e analisados demostrando que o material sendo submetido a extração primeiramente com o solvente orgânico pouco polar para este retirar as gorduras e clorofila presente na planta, tornando o material em condições favoráveis para ser tratado em CLAE. Após esta limpeza do material, para obtenção dos constituintes químicos este passou por duas extrações por maceração com 1 litro de metanol grau PA, em um tempo fixo de 2 dias x 24 horas, seguido de filtração simples, seguido de filtração e evaporação em evaporador rotativo, mantendo a temperatura do banho-maria em 45 C, obtendo-se 32,45g de extrato metanólico. Uma alíquota de 1 mg do extrato foi injetada em CLAE em modo gradiente com fase móvel composta por solvente A = H 2 e B = ACN, variando-se de 5 a 100% do modificador orgânico, no tempo de 60 minutos. A vazão da fase móvel foi de 1 ml/minuto, Como fase estacionária, utilizouse uma coluna analítica Gemini C18 (150 x 4,6 mmdi), com partículas de 5 μm, dotada de précoluna e detector de absorbância na região do ultra-violeta operando em 200 a 400 nm. Pela estimativa do % do solvente B para eluição isocrática, baseada no tempo de retenção da última banda t rz do gradiente inicial (CASS, 2011); Considerando o estudo de SNYDER e colaboradores (1997), é possível propor valores desejáveis para o fator de retenção k (k=5; k=10; k=20), com base nos tempos de retenção da última banda. tempo de retenção da última banda para o extrato metanólico de T. occidentalis foi próximo a 25 minutos. Com isso, foi calculado um valor teórico baseado nos estudos de SNYDER. Para se estimar um valor de percentual do modificador orgânico, optou-se por uma separação com k=20 e foi sugerido um sistema isocrático. sistema escolhido para iniciar as analises foi H 2 /ACN 70:30; o cromatograma não demostrou boa seletividade para os componentes da amostra, se fez necessário enfraquecer o modificador orgânico em percentual de cinco, dez, quinze; porém o aumento no principio da hidrofobicidade que confere a separação em CLAE foi inversamente proporcional a resolução do cromatograma. Mediante as analises foi possível perceber que picos correspondentes aos compostos majoritários estavam demonstrando um alargamento na banda, o que é indicativo de substancias que conforme a eluição com a fase móvel transformam-se na sua forma ionizada. Por tanto os solventes foram levemente acidificados com 700

4 ácido fórmico à 0,1 %, tornando assim o sistema de fase móvel constituído por H 2 /ACN/ácido fórmico 69:29:2. Este demonstrou-se eficiente para separação dos constituintes; entretanto, houve a necessidade de ajustar o modificador orgânico para otimizar o método de isolamento. sistema H 2 /ACN/ácido fórmico 79:19:2 foi o mais satisfatório para o isolamento da S1, S2 e S3. resultado pode ser observado no cromatograma. S1 S2 S3 Cromatograma no modo de eluição isocrático do extrato metanólico. Fase móvel H 2 /ACN/ácido fórmico 79:19:2 e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, λ = 235 nm, λ = 280 nm e λ = 320 nm. 4. RESULTADS E DISCUSSÕES No estudo fitoquímico das partes aéreas de T. occidentalis foi desenvolvido o método de pré-tratamento de amostra que simplificou o isolamento via CLAE, de uma substância (S2), pertencente a classe dos flavonóides. A S1 foi obtida em mistura, e de S3 obteve-se pouca massa, o que torna inviável a analise em equipamento de RMN, porém o espectro de hidrogênio das substancias demostraram valores de deslocamentos químicos característico de flavonóides. A determinação estrutural da substância S2, quercetina-3-raminosídio foi realizado com base na análise dos dados espectrométricos de RMN de 1 H, 13 C e por comparação com informações encontradas na literatura. 701

5 H H Estrutura química do composto isolado. Dados de RMN de 13 C C ,5 158, ,8 136, ,5 179, ,4 163,1 6 99,9 99, ,7 165,8 8 93,0 94, ,0 159, ,4 105, ,5 122, ,9 116, ,6 146, ,6 149, ,3 116, ,5 122, ,4 103,5 2 71,1 71,8 3 71,6 72,1 4 72,9 73,2 5 72,1 72,0 6 17,4 17,6 1- Dados obtidos experimentalmente em DMS. 2- Dados da literatura em CD 3 D (ALBUQUERQUE, 2014) 702

6 5. CNCLUSÃ s flavonóides têm recebido muita atenção nos últimos anos devido aos vários efeitos benéficos observados. Por causa do efeito antioxidante, eles tornaram-se importantes compostos dietéticos com promissor potencial terapêutico. Relatos e evidências epidemiológicas sugerem que dietas ricas em flavonóides, como a quercetina, têm efeitos na prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares, câncer e insuficiências renal e hepática. Neste trabalho foi possível isolar e caracterizar tal composto, realizando o estudo fitoquímico do extrato metanólico das partes aéreas de Thuya occidentalis, com os desenvolvimentos de métodos: de pré-tratamento de amostra e cromatográficos via CLAE, foram fundamentais para obtenção da substância purificada com menos gastos e em menor tempo; quercetina 3-ramnosídeo, segundo a literatura. A qual foi identificada por análise de dados espectroscópicos de RMN e por comparação com dados da literatura. 6. AGRADECIMENTS s autores deste trabalho agradecem, ao Laboratório de Cromatografia Líquida (UFPA) pela infra-estrutura que possibilitou a execução deste trabalho. 7. REFERENCIAS Albuquerque, C. H.; Tavares, J. F.; liveira, S. L.; Silva, T. S.; Gonçalves, G. F.; Costa, V. C..; Agra, M. F.; Pessôa, H. L. F.; Silva, M. S. FLAVNIDES GLICSILADS DE Erythroxylum pulchrum A. St.-Hil. (Erythroxylaceae). Quim. Nova, Vol. 37, No. 4, , 2014 BEHLING, E. B.; SENDÃ, M. C.; FRANCESCAT, H. D. C.; ANTUNES, L. M. G.; BIANCHI, M. L. P. FLAVNÓIDE QUERCETINA: ASPECTS GERAIS E AÇÕES BILÓGICAS. Alim. Nutr., v. 15, n. 3, p , 2004 CASS; Q. B.; DEGANI, A.L.G. DESENVLVIMENT DE MÉTDS PR HPLC. FUNDAMENTS, E ESTRATÉGIAS E VALIDAÇÃ, 1ª Ed. da UFSCar. Série Apontamentos, São Carlos, 77 págs., AD33C51703A3 703

7 Naser, B.; Bodinet, C.; Tegtmeier, M.; Lindequist, U. THUJA CCIDENTALIS: A REVIEW F ITS PHARMACEUTICAL, PHARMACLGICAL AND CLINICAL PRPERTIES. ecam ;2(1) SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. PRACTICAL HPLC METHD DEVELPMENT. 2ª Ed. John Wiley & Sons. New York, 765 pp.,